京白梨”授粉樹S基因型鑒定及對果實品質影響

【Abstract】Using9typesof‘JingbaiPear'polinationtresasresearchmaterials，thisstudyidentifiestheirS-genotypes andevaluatestheirsuitabilitybasedonfloweringsynchrony，polenquantitypolengerminationrate，andfruitqualityThe resultsidicatethat’ZhongliNo.2’，Nanguo Pear‘，and‘JianbaPear'haveahighdegreeofcompatibility with the floweringperiodof‘JingbaiPear’.Pollengerminationratesvariedsignificantly.For example，the‘PingguoPear‘has the pollen germination rate of 91.49 % ，the'Xinshiji Pear'79.08 % ，the‘Yali Pear‘72.76%，and the‘Zimu Pear‘ 72.41% ，thesefour varietieshavingahigherpollen germinationrates.Fruitqualityanalysisrevealed thatthe‘JingbaiPear‘ polinatedbyJinshuiNo.hasthelargestcore-to-fruitratio，whilethepearpollinatedby‘JianbaPear‘achievesthehighest soluble solids content （16.16 % ），the maximum flavonoid content （1o.67 mg/g） is observed in the pear pollinated by JinshuiNo.2，thepearpollinatedby‘Yaliear‘producesthehigheststonecellconcentration （6.97mg/g），thepearpollnated by‘Zhongli Pear No.2'shows the greatest firmness （8.53kg/cm^z） ），and the'JingbaiPear‘pollinated by‘ZimuPear‘ has the highest titratable acidity （0.17% ）and reducing sugar content 9.63% ）.There was no significant difference in VC content amongdiffrentpolinationtree varieties.Basedontheaboveresults，‘PingguoPear’，'XinshijiPear’，'ZimuPear‘and ‘Yali Pear‘are recommended as optimal pollinizers for‘Jingbai Pear'.

【Keywords]JingbaiPear;pollinationtree；selectionoffinevarieties;identificationofS-genotypes;pollngermination rate; pollen quantity; fruit quality

[中圖分類號］S792.99 [文獻標識碼］A [文章編號]1674－3229（2025）02-0100-07

0 引言

梨屬于自交不親和樹種，大部分品種自花授粉坐果率低甚至不結果，并存在異花授粉不親和現象。研究表明該現象是由自交不親和性基因（self-incompatibilitygene，Sgene，簡稱S基因）所決定。日本學者最早開始研究梨自交不親和基因及基因型，而我國相關研究起步較晚，衡偉等對原產于我國的“奧連”“沙疙瘩\"等20個梨品種和野生型個體S基因型進行了鑒定[1-15]。我國梨樹資源豐富，品種繁多，至今仍有大量的梨樹資源S基因型有待進一步測定。相關研究結果表明，相同的S基因型品種雜交不親和，雜交親和的S基因型品種不同，通過鑒定S基因型將為授粉樹品種配置及良種選育提供重要的科學依據[6]。

梨樹為異花授粉品種，為提高產量和品質，必須合理配置授粉樹，選擇合適的授粉樹品種首先要考慮S基因型，并結合花期相遇授粉品種的篩選。另外，授粉樹的花粉量、花粉活力對梨樹結實也起到關鍵作用[17]。不同授粉樹品種對梨樹果實品質會產生一定的影響，王家珍研究了南紅梨多個授粉品種對其坐果率、果形指數、果實品質及風味的影響，結果表明“蘋果梨\"和“花蓋梨\"可作為“南紅梨”的優(yōu)良授粉品種[18-20]。

“京白梨”又名北京白梨，屬于秋子梨系統，栽培歷史已有400多年，因其果實細膩的口感深受當地人民喜愛。近年來，由于授粉樹品種選擇不合理等原因，導致“京白梨\"果實品質逐年退化，目前，對“京白梨\"授粉樹的S基因型鑒定、花期遇合、果實品質等系統性的研究較少。本研究通過對9個“京白梨”授粉樹品種的S基因進行測序，鑒定了S基因型，同時觀察記錄了各授粉樹與“京白梨”花期遇合情況，并結合測定以各授粉樹品種為父本的“京白梨”果實大小、果形指數、果實品質等指標，綜合運用多個生物學實驗技術，篩選了可作為“京白梨\"授粉樹的優(yōu)良品種，能夠為“京白梨\"授粉樹合理配置提供理論基礎和生產指導，從而為有效解決“京白梨”果形變尖、風味變淡等品種退化問題提供技術支撐，研究內容具有一定的創(chuàng)新性。

1 材料和方法

1.1材料

供試材料為“白梨”“蘋果梨”“尖把梨”“中梨二號”“鴨梨”“金水二號”“新世紀梨”“子母梨”“南果梨\"9個授粉樹品種，“京白梨”為授粉對象，材料均采自北京市門頭溝區(qū)香峪京白梨資源圃內。取各種樹體的幼芽 1g ，放入液氮中處理后，存入 -80^°C 超低溫冰箱中備用。

1.2方法

1.2.1基因測序及鑒定

根據梨S基因DNA序列中高度保守區(qū)C1和可變區(qū)下游的保守區(qū)C3，設計合成一對簡并引物見表1，由英濰捷基（上海）貿易有限公司進行引物合成。用提取的基因組DNA為模板進行PCR擴增，擴增程序為： ， （95%30s，48%30s 72^°C60s）×30 個循環(huán)， 72°C5min 。反應體系見表2。

PCR擴增產物經 1.5% 瓊脂糖凝膠電泳分離后，切膠回收目的片段?；厥债a物連接到pMD18-T載體上，轉化至大腸桿菌，通過菌落PCR鑒定，挑取陽性克隆測序。由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成測序工作。對特異片段序列分析及S基因型確定，利用美國國立生物技術信息中心（NCBI的Blast軟件檢索所測得S基因序列，根據對比結果，確定測序序列的S基因名稱，從而鑒別供試梨品種的S基因型。再對不同品種S基因型的特異性驗證，根據GeneBank登錄的基因序列以及測序結果設計S單元型特異性引物（見表3），進一步驗證用兼并引物擴出的結果。

1.2.2不同授粉樹花粉量和花粉萌發(fā)率的測定

參照李芳芳等[7]的測定方法計算不同授粉樹花粉量，采摘含苞待放的大花蕾后剝離花藥，隨機選取飽滿、未開裂的花藥50粒放入 2mL 離心管中；放入 35^°C 烘箱中干燥，待花粉散出后，加入 2mL 濃度為 200g/L 的六偏磷酸鈉溶液，使用漩渦振蕩器振蕩成懸浮液；用移液槍吸取 400μL 懸浮液到 2mL 離心管中，再加入 1600μL 濃度為 200g/L 的六偏磷酸鈉溶液，混合均勻后吸取 5μL 溶液滴在載玻片上，顯微鏡下觀察，統計花粉粒量。試驗需進行3次生物學重復，花粉量 每個載玻片上總花粉粒數 ?×40 。

參照姜雪婷等[2的測定方法計算花粉萌發(fā)率。采集未開放的大花蕾，采集花粉陰干后播灑于0.1g/L 硼酸 蔗糖 +10g/L 瓊脂的固體培養(yǎng)基上，在 20% 條件下暗培養(yǎng) 3h ，觀察統計花粉萌發(fā)率。每個處理觀察3個視野，每個視野花粉粒應不少于30個，花粉管萌發(fā)的狀態(tài)是以花粉管長度大于花粉粒直徑[22-23]?；ǚ勖劝l(fā)率 σ=σ 已萌發(fā)花粉數/花粉總數 ×100% 。

1.2.3果實品質測定

采用電子天平測定單果重；使用游標卡尺進行測定果實橫縱徑值，計算果形指數；沿果實中心位置橫切，直接測定其果心與果實直徑，計算果心比例；用GY-4型數顯式水果硬度計（ 8mm 測頭）測定果實硬度[22-23]；使用手持式折射儀測定其可溶性固形物[24]；采用NaOH滴定法測算果實可滴定酸含量[25-26]；用2，6-二氯酚靛酚法測定維生素C含量[27]，采用冷凍處理法測定石細胞含量[28]。

2 結果與分析

2.1S基因型的鑒定與分析

由圖1可知，實驗用梨品種共得到4種不同大小的DNA譜帶，10個梨樹品種均在 100～250bp 之間有一條擴增帶，1#、2#、5#、7#材料在 500＼～750 bp之間都有一條擴增帶，3#、6#、9#在 750～1000bp 之間有一條擴增帶，4#、8#、10#在 1000～2000bp 處都有一條擴增帶。各個品種都有兩條特異的片段，說明梨樹品種S基因型均為雜合體。

將PCR擴增產物經凝膠分離后回收，克隆并測序。通過在NCBI中與其他S基因核酸序列進行比對，以確定各個品種的S基因型。通過兼并引物擴增出來的S基因型如表4所示。

2.2不同梨品種S基因型的特異性驗證

為驗證兼并引物擴增的每個授粉樹品種基因特異性，測序結果通過在NCBI數據庫中進行Blast對比分析，在Genebank中找到10個供試梨品種的基因全長序列后，分別設計S單元型特異性引物（見表3），來進一步驗證S基因在10個梨樹品種中的特異情況。結果如圖2所示，S63、S21基因只在“白梨”中表達，表明白梨的基因型為S63S21；S1、S11基因在“蘋果梨\"“尖把梨”“金水二號”中表達，表明“蘋果梨\"“尖把梨\"“金水二號\"的基因型均為S1S11；S17、S34基因在\"中梨二號\"\"子母梨\"\"新世紀\"中有表達，表明這三種授粉樹的基因型為S17S34；S16只在“鴨梨”中有表達，表明“鴨梨”的基因型為S16；S30只在“南果梨\"和“京白梨”中有表達，表明“南果梨”和“京白梨\"S基因型為S30。結果與表4的結果保持高度一致性。通過S基因型的鑒定，除了“南果梨”的基因型與“京白梨”相同外，其他8種授粉樹均可作為“京白梨\"授粉樹。

2.3“京白梨\"不同授粉品種花期觀察及花粉萌發(fā)率測定

對不同授粉品種花期觀察結果表明，4#“中梨二號\"花期提前“京白梨\"的花期1d開放，9#“南果梨\"提前2d，3#\"尖把梨\"提前 3d 。因“京白梨”是屬于邊花先開的果樹類型，因此這三種授粉樹的花期遇合度較高；通過測定不同授粉樹的花粉萌發(fā)率發(fā)現，2#“蘋果梨”、7#\"新世紀梨”、8#“子母梨”、5#“鴨梨”的花粉萌發(fā)率較高，各個品種的授粉樹花粉萌發(fā)率存在顯著性差異。具體見表5。

2.4不同授粉樹品種對“京白梨”坐果期果實品質的影響

表6結果顯示6#授粉樹“金水二號\"的“京白梨”母本果實果心比值最大為0.6，其次是3#“尖把梨”為0.54，最小的1#“白梨”果心比為0.43；3#授粉樹的“京白梨”母本果實可溶性固形物含量最高為16.16% ，其次是9#“南果梨” 15.59% ，5#“鴨梨”為15.34% ，最低的1#授粉樹“白梨”為 11.99% ；6#授粉樹“金水二號”對“京白梨”果實中的類黃酮含量影響最大為 10.67mg/g ，其次是8#授粉樹“子母梨”10.24mg/g ，最低的為2#授粉樹“蘋果梨 ^′7.04mg/g 5#授粉樹“鴨梨”對“京白梨”果肉中石細胞含量影響最大為 6.97mg/g ，其次為4#授粉樹\"中梨二號\"為6.84mg/g ，“京白梨”果實中石細胞含量最少的是9#授粉樹\"南果梨”為 2.15mg/g ；4#授粉樹“中梨二號”對“京白梨”果實的硬度影響最大為 8.53kg/cm² ，其次是9#授粉樹“南果梨\"為 7.87kg/cm² ，影響最小的為8#授粉樹“子母梨\"為 4.34kg/cm² ；8#授粉樹品種“子母梨”對“京白梨”果實的可滴定酸含量影響較大為 0.17% ，其次是9#授粉樹“南果梨”為 0.15% ，影響最小的為1#授粉樹“白梨”和6#授粉樹“金水二號”，為 0.08% ，1～9#各授粉樹對“京白梨”果實內的VC含量影響不大，各授粉樹品種之間的差異性不顯著。對“京白梨”果實中還原糖含量影響較大的為授粉樹8#“子母梨”為 9.69% ，其次為3#“尖把梨”為6.37% 、9#“南果梨\"為 6.37% ，影響最低的為4#授粉樹\"中梨二號' 4.56% 。

3討論

梨是重要的經濟果樹，作為薔薇科蘋果亞科梨屬植物，因其高度自花不實，即具有自交不親和（self-incompatibility，SI）遺傳特性，生產上必須配置合適的授粉樹或采取其他的輔助授粉措施才能保證其優(yōu)質豐產，因此通過確定“京白梨\"授粉樹品種的S基因型，觀察授粉樹花期的遇合度、測定花粉量及花粉萌發(fā)率，對生產授粉樹品種的選擇或雜交育種親本選配具有重要的指導意義。

應用PCR技術，結合S基因特異擴增條帶分離、克隆和測序，已成為梨屬植物S基因型鑒定的主要方法，但在使用中會出現同一品種S基因型鑒定結果不一致現象[29-33]。張春芳[34]、張茂君[35]鑒定的蘋果梨S基因型分別為S1S31、SdS31，而本試驗測定的蘋果梨S基因型為S1S11，結果差異較大，可能由于試驗中因取樣、研究方法的不同，導致結果存在一定差異性，需要在試驗方法上進一步探索。

科研工作者對棗、山楂、桃、蘋果等果樹研究發(fā)現，不同品種花藥內花粉量及花粉萌發(fā)率差異較大，姜雪婷[21等對來自不同種類的43個品種花粉萌發(fā)率和花粉量測定，結果表明梨不同品種間的花粉活力有顯著的差異性。花粉量及花粉萌發(fā)率對“京白梨”授粉結果起到關鍵性的作用。有研究表明果樹的不同授粉樹品種花粉量及質量的好壞直接影響著主栽品種的坐果率和產量，國外以柑橘、橄欖、葡萄、榛樹等果樹為研究對象，花粉量產量預測模型的研究證實了花粉量與產量之間存在顯著的相關關系。

果樹的不同授粉樹品種對果實的大小、果形、色澤、重量、可溶性固形物含量等外觀內在品質有一定的影響。袁仲玉37研究發(fā)現6個品種的花粉授粉后的“陜富6號\"蘋果的果形指數、果面光潔度等外觀品質以及硬度、可溶性固形物含量、可滴定酸含量等內在品質均有一定的差異。李保國[38等人用不同品種對“2001富士\"授粉，發(fā)現在果肉細胞大小、VC含量、糖酸含量等內在品質方面表現出明顯的差異。

4結論

為了篩選“京白梨”最優(yōu)授粉樹品種，對9種不同授粉樹進行了S基因型鑒定，結果表明“南果梨”與“京白梨”存在自交不親和現象，不適合作為“京白梨\"授粉樹，其他8種授粉樹均可作為“京白梨”的授粉樹。通過對這9種授粉樹花期的觀察記錄，發(fā)現：“中梨二號\"\"南果梨”“尖把梨\"3種授粉樹種與“京白梨”花期遇合度較高。分別對不同授粉樹的花粉活力及花粉數量進行了測定，結果表明“蘋果梨”“新世紀梨”“子母梨”“鴨梨”的花粉萌發(fā)率較高，各品種授粉樹花粉萌發(fā)率存在顯著性差異。

通過測定果心比、果形指數、類黃酮含量、石細胞含量、VC含量、可滴定酸含量、果實硬度、可溶性固形物等指標，表明以“金水二號”為授粉樹的“京白梨\"母本結實果心比值最大，以“尖把梨”為授粉樹的“京白梨”母本結實可溶性固形物含量最高，“金水二號\"對\"京白梨\"果實中類黃酮含量影響最大，“鴨梨”對“京白梨”果肉中石細胞含量影響最大，“中梨二號\"對“京白梨\"果實硬度影響最大，“子母梨”對“京白梨”果實中可滴定酸含量影響較大，對“京白梨”果實中還原糖的含量影響較大的為授粉樹“子母梨”。各授粉樹對“京白梨”果實內的VC含量影響不大，數值之間差異不顯著。

綜合以上結果，表明“蘋果梨”“新世紀梨”“子母梨”“鴨梨\"較適合作為“京白梨\"的授粉樹。

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責任編輯呂榮榮