早孕因子單克隆抗體對宮頸癌HeLa細胞增殖、遷移及調亡的影響

關鍵詞：早孕因子；單克隆抗體；宮頸癌；HeLa細胞；增殖；遷移；凋亡中圖分類號：R711.74 文獻標識碼：A文章編號：0439-8114（2025）05-0117-06DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2025.05.018

Effects of monoclonal antibody against early pregnancy factor on proliferation，migration and apoptosisofcervical cancer HeLa cells

DUANFu-chun，REN Hong-lin，HU Pan，LI Yan-song，LIUXi-lin，WANGHan， LIU Meng-di，LI Hao-song，LU Shi-ying

eyLaboratoryforDiagnosisandTreatmentofSevereZoonoticInfectiousDiseases/KeyLabratoryofZoonosisResearch，Ministryof Education/Instituteof Zoonosis/College of VeterinaryMedicine，JilinUniversity，Changchun13oo62，China）

Abstract：Theinibitoryefectofmonoclonalantibodyagainstearlypregnancyfactor（EPF-B6）onthebiologicalbehaviorofcervical cancer HeLacellswasinvestigatedbystudyingtheeectsofEPF-B6ontheproliferation，migration，cloningandapoptosisofHeLa cells.RT-PCR and Western Blot were used to detect the expression of EPF gene in six common cancer cells and EPF protein in cell culture medium.TheeffctsofdiferentconcenrationsofEPF-B6monolonalantibodyontheproliferation，migrationndpopulation dependenceofHeLacelsweredetectedbyCCK8assaycellscrathassayandplatecloning assay，espectively.Theapoptosisand cycleofHeLacellswere detected by flowcytometry.Results showed that EPF gene was present in common tumor cells.EPF protein was expresed in theculture medium ofcervicalcancer HeLacells，breastcancer MCF-7celsandovariancancer A2780cels.The resultsshowedthatEPF-B6monoclonalantibodycouldsignificantlyinhibit theproliferation，migrationandcolonyformationofHeLa cells，it was concentration-dependent （ Plt;0.01 ）.The results of cell cycle analysis showed that EPF-B6 monoclonal antibody blocked the DNA replication process of HeLa cells at G2/M phase.

Key Words：earlypregnancyfactors；monoclonalantibody;cervicalcancer;Helacells；proliferation;migration；apoptosis

早孕因子（Earlypregnancy factor，EPF）是澳大利亞學者在孕鼠血清中首次發現的，是一種具有免疫抑制和生長調節作用的微量蛋白[12]，其與腫瘤的發生密切相關。多種腫瘤疾病患者血清中存在早孕因子蛋白的表達，其不僅作為生長因子促進腫瘤進展[3]，還可能觸發機體免疫耐受機制，幫助腫瘤細胞規避機體的免疫清除[4.5]。人絨毛膜癌、卵巢癌、葡萄胎、惡性滋養層、黑色素瘤、膀胱癌和腸癌等腫瘤患者血清中均檢測到EPF表達，且表達水平與腫瘤的發生、進展和預后呈顯著相關性[6。睪丸癌患者血清中EPF或EPF樣活性物質呈陽性表達，而健康對照組均為陰性，說明EPF具有作為辜丸癌早期篩查的特異性生物標志物的潛在價值[。體內研究表明，將早孕因子單克隆抗體注入小鼠移植瘤模型可顯著抑制腫瘤生長[8]。體外試驗進一步證實，EPF單抗對多種腫瘤細胞系具有劑量依賴性的增殖抑制作用[9]。EPF是維持腫瘤細胞增殖和存活的關鍵分子，同時提示EPF單抗可能是一種潛在的抗腫瘤治療靶點。

宮頸癌作為人獸共患病的一種常見惡性腫瘤，在人類女性生殖系統中發病率持續上升[10]，2020年中國新發病例達11萬例，與2018年相比增加3.5%^[11-13] ，且發病呈現年輕化趨勢[14]。另外，宮頸癌在動物中也時常發生，特別是犬、貓、牛等動物中發病率較高[15-17]，對寵物業和畜牧業的發展也構成一定威脅。現有對宮頸癌的治療仍以手術、放療和化學藥物等手段為主，但易致宮頸瘢痕及機能不全[18]；引起膀胱炎、腸炎等放射性并發癥狀[19]，且復發率高[20]。鑒于宮頸癌現有治療方法的局限性，開發新型治療藥物具有重要的臨床意義。

本研究通過RT-PCR、WesternBlot等6種方法檢測腫瘤細胞中EPF基因的表達情況，且在宮頸癌和乳腺癌細胞中蛋白質的表達較強，進一步以宮頸癌HeLa細胞為重點研究對象，將前期制備的早孕因子EPF單克隆抗體EPF-B6與HeLa細胞體外共培養，通過CCK8細胞毒性試驗、平板克隆、細胞劃痕及流式細胞術等在細胞水平分析EPF-B6單抗對HeLa細胞增殖、遷移和凋亡的影響，探討利用早孕因子單克隆抗體抑制宮頸癌HeLa細胞增殖、侵襲、轉移和凋亡等生物學行為在腫瘤治療中的潛力，為開發以EPF為靶點的宮頸癌治療策略提供試驗依據。

F 材料與方法

1.1材料

人宮頸癌細胞（HeLa）、人乳腺癌細胞（MCF-7）、人肝癌細胞（ Hepg-2 由人獸共患傳染病重癥診治全國重點實驗室保存提供；人卵巢癌細胞（A2780）、人前列腺癌細胞（DU145）、人子宮內膜癌細胞（Ishikawa 3-H-12）購自Applied Biological Ma-terials（ABM）公司;EPF-B6早孕因子雜交瘤細胞由人獸共患傳染病重癥診治全國重點實驗室前期制備。GoatpAbtoEPF商品化抗體（貨號CR3255931-1）購自艾博抗（上海）貿易有限公司。DMEM高糖培養基和RPMI1640低糖培養基購自格來賽生命科技（上海）有限公司；胎牛血清購自美國Gemini公司；cDNA反轉錄試劑盒、PCR試劑盒購自Novoprotein;細胞計數試劑盒（Cellcountingkit8，CCK8）、細胞凋亡試劑盒、ECL發光顯影液購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 EPF-B6早孕因子單克隆抗體制備及純化

早孕因子單克隆抗體雜交瘤細胞EPF-B6由人獸共患傳染病重癥診治全國重點實驗室前期融合制備，復蘇后進行常規培養。取6＼～8周齡BALB/c雌性小鼠，采用腹水誘導法與辛酸-硫酸銨法獲得并純化單克隆抗體。間接ELISA測定純化后的EPF-B6單抗效價。

1.3常見腫瘤細胞中EPF基因的擴增

HeLa細胞、MCF-7細胞、 Hepg-2 細胞、DU145細胞復蘇后使用含 10% 胎牛血清 ，1% 青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養基常規培養。A2780細胞、Ishikawa3-H-12細胞復蘇后使用含 10% 胎牛血清、 1% 青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI1640培養基常規培養。每株細胞各取 2×10⁶ 個，Trizol提取細胞中總RNA，經cDNA反轉錄試劑盒獲得cDNA。于NC-BI網站獲取人源性 EPF 基因序列（序列號為 NM_- 002157.3），采用Primer permier 5.0軟件設計上、下游引物（表1）。以cDNA為模板，PCR特異性擴增 EPF 基因片段，擴增體系見表2，PCR產物經 2% 瓊脂糖凝膠電泳驗證。

1.4WesternBlot檢測腫瘤細胞培養液中EPF蛋白的表達

將6株癌細胞分別計數 2×10⁶ 個，接種至T25細胞培養瓶中， 3mL 完全細胞培養液培養 ^48h ，取細

胞上清液進行WesternBlot。1：1O00稀釋EPF-B6單抗和GoatpAbtoEPF商品化抗體作為一抗， 1：5 000 稀釋HRP-羊抗鼠作為二抗，ECL化學發光液顯影。

1.5CCK8檢測EPF-B6單抗對HeLa細胞的生長抑制率

取對數生長期HeLa細胞， 5×10³ 個細胞每孔鋪于96孔細胞培養板中，培養 ^12h 至細胞貼壁，設置僅完全培養基孔作為空白組，分別加入 0.0.1，.0.2 、0.4AA，0.6AA，0.8mg/mL EPF-B6單抗培養 24h ，更換為100μL/ 孔 10% CCK8完全培養基培養 ^2h 后測定OD_450nm ，計算細胞生長抑制率。

1.6細胞劃痕檢測EPF-B6單抗對HeLa細胞遷移的影響

取對數生長期HeLa細胞， 2×10⁵ 個每孔接種于6孔板中，加入 2mL 細胞培養液培養至細胞密度為80%～90% 。在孔中央人為制造劃痕后，試驗組分別加入含低濃度（ 0.1mg/mL ）、中濃度（ 0.4mg/mL ）高濃度（ 0.8mg/mL ）EPF-B6單抗的培養基，定點觀察細胞狀態并拍照，計算細胞遷移率。

1.7平板克隆檢測EPF-B6單抗對HeLa細胞克隆形成的影響

取對數生長期HeLa細胞，700個每孔接種于6孔板中，待細胞貼壁后試驗組分別加人含低濃度（0.1mg/mL） 、中濃度 （0.4mg/mL） 、高濃度 （0.8mg/mL） EPF-B6單抗的培養基，培養 ^48h 后更換為普通培養基，細胞每隔2～3d換液，繼續培養10～14d，待形成的細胞團塊大于50個細胞時終止培養，甲醇溶液固定 15min，0.1% 結晶紫染色 20min ，PBS溶液清洗后觀察并拍照，采用ImageJ軟件計數克隆數目。

1.8流式細胞術檢測EPF-B6單抗對HeLa細胞凋亡的影響

取對數生長期HeLa細胞， 2×10⁵ 個每孔接種于6孔板中，待細胞貼壁，試驗組分別加入含低濃度（0.1mg/mL ）、中濃度 （0.4mg/mL） 高濃度 0.8mg/mL ）EPF-B6單抗的培養基， 48h 后棄去舊培養基，細胞刮刀收集細胞，按照細胞凋亡試劑盒操作，用 100μL BindingBuffer與 5μL Annexinv-FITC和 10μL PI混勻后重懸 1×10⁵ 個細胞，室溫避光孵育 15min ，檢測細胞凋亡率。

1.9 流式細胞術檢測EPF-B6單抗對HeLa細胞周期的影響

取對數生長期HeLa細胞， 2×10⁵ 個每孔接種于6孔板中培養至細胞貼壁，將試驗組細胞分別加入0.4mg/mL 的EPF-B6單抗，培養 48h 后用細胞刮板收集細胞，PBS溶液清洗后加入 1mL70% 乙醇溶液， 4^°C 固定過夜，使用細胞周期檢測試劑盒按說明操作后經流式細胞儀檢測細胞周期。

1.10 統計分析

采用GraphPadPrism5.O統計學軟件進行數據分析。計量資料用平均值 ± 標準差（ Mean±SD ）表示，重復3次，多組間數據采用單因素方差分析及t檢驗。

2 結果與分析

2.1 腫瘤細胞中EPF基因及EPF蛋白的表達

PCR結果（圖1）表明，6種腫瘤細胞中均擴增出126bp 的特異性片段，提示這些細胞系中存在 EPF 基因的轉錄。WesternBlot結果（圖2）表明，EPF-B6單抗、GoatpAbtoEPF商品化抗體均檢測到人宮頸癌HeLa細胞、人乳腺癌MCF-7的細胞上清中存在大小約為 120ku 的EPF蛋白，GoatpAb檢測到A2780細胞上清中也存在約 120ku 的EPF蛋白，MCF-7細胞中有 160ku 的EPF蛋白出現，說明腫瘤細胞培養液中都存在EPF蛋白。間接ELISA結果表明，EPF-B6單抗效價比達到1：512000（圖3）。

2.2 EPF-B6單抗抑制HeLa細胞增殖

CCK8結果（圖4）表明，隨著EPF-B6單抗濃度的升高，HeLa細胞生長抑制率逐漸增加，呈現劑量依賴性。在不同的試驗濃度下，HeLa細胞生長抑制率分別為 （11.41±1.74）% 、 （21.85±3.58）% 、（ 42.61±2.36）% 、 （56.47±3.13）% 、 （77.88±3.64）% ，表明EPF-B6單抗抑制HeLa細胞生長。

2.3 EPF-B6單抗抑制HeLa細胞遷移能力

細胞劃痕結果（圖5）表明，當EPF-B6單抗與HeLa細胞共培養 24h 時，對照組、低濃度、中濃度、高濃度組細胞遷移率分別為 （28.12±0.28）% 、（13.72±0.13）%（6.70±0.81）%（4.10±0.31）%（Plt;0.01） 。當培養 48h 時，各試驗組細胞遷移率分別為（ 41.92± 0.58% 、 （19.42±0.63）% 、 （11.78±0.29）% 、（ 6.88± 0.67）% ，極顯著抑制HeLa細胞的遷移 （Plt;0.01 ），表明EPF-B6單抗能抑制HeLa細胞的遷移能力，呈現劑量與時間依賴性。

2.4 EPF-B6單抗抑制HeLa細胞克隆形成能力

細胞平板克隆結果（圖6）表明，當EPF-B6單抗在對照組、低濃度、中濃度、高濃度處理組作用于HeLa細胞時，細胞克隆形成率分別為（ 78.76±0.73）% 、 （68.81±0.78）% 、 37.33±0.81）% 、（ 15.66± 0.50） % （ Plt;0.01 ），表明EPF-B6單抗極顯著抑制HeLa細胞平板克隆形成。

2.5 EPF-B6單抗促進HeLa細胞的凋亡

流式細胞術結果（圖7）表明，HeLa細胞對照組、低濃度、中濃度、高濃度處理組細胞凋亡率分別為

（ 13.51±0.36）% 、（ 15.48±0.33）% 、 （46.9±1.33）% 、（57.76±0.97）%（Plt;0.05，Plt;0.01） ，表明EPF-B6單抗能顯著或極顯著促進HeLa細胞的凋亡。

2.6 EPF-B6單抗影響HeLa細胞凋亡周期

細胞周期結果（圖8）顯示，HeLa細胞對照組與EPF-B6單抗組相比G2/M期占比增高，說明EPF-B6單抗作用于HeLa細胞時細胞周期被阻滯在DNA合成的G2/M期，提示早孕因子單克隆抗體可能是通過影響HeLa細胞DNA合成后期促進其凋亡的。

3 討論

宮頸癌作為世界公共衛生問題，嚴重威脅著人類和動物生命安全及畜牧業的發展?，F有治療方式容易損害宮頸周圍正常組織及存在較高的復發率[20]，動物治療方面存在經濟成本較高的問題。因此，尋找一種新的藥物與靶點對宮頸癌的治療意義重大。

早孕因子是熱休克蛋白家族的一員，與熱休克蛋白10高度同源[21]，發揮免疫抑制和生長調節作用[21，22]。利用早孕因子單克隆抗體與癌細胞中EPF蛋白結合，抑制腫瘤細胞的惡性生物學行為是可以被預見的。已有關于EPF單抗與宮頸癌HeLa細胞的報道較少，本試驗旨在探討EPF單抗對HeLa細胞的影響，以期為利用EPF單抗治療宮頸癌提供一定的基礎。

本研究探討了6種常見癌細胞中EPF基因和EPF蛋白質的表達，發現6種癌細胞的總RNA均能擴增出 126bp 的特異性片段，但在細胞培養上清中，只有人宮頸癌HeLa細胞、人乳腺癌MCF-7細胞和人卵巢癌A2780細胞中檢測到EPF蛋白的表達。這可能是因為在相同培養條件下HeLa細胞、MCF-7細胞和A2780細胞比其他癌細胞生長分裂的速度快，分泌的EPF蛋白較多[23]

本研究著重探討EPF-B6單抗對HeLa細胞的影響，發現其能顯著抑制其惡性生物學行為，并且制備的早孕因子單抗對腫瘤細胞的抑制作用優于前期學者的試驗效果[24]。在凋亡周期結果中得知，EPF-

B6單抗阻滯HeLa細胞DNA合成的G2/M期，有學者曾發現EPF-B6單抗可通過影響癌細胞DNA合成中嘧啶含量干擾DNA的復制過程，進而抑制癌細胞的生長作用25，但其具體的調控機制與通路尚不明確。

綜上，EPF-B6單抗能顯著抑制宮頸癌HeLa細胞的生長、遷移、克隆形成，顯著促進HeLa細胞的凋亡，為開發新型高效、具有應用前景的抗腫瘤藥物提供了一定的試驗基礎，也為宮頸癌的治療提供了新藥靶，但其具體的作用機制與通路仍需要進一步研究。

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