不同光質處理下糙皮側耳qRT-PCR內參基因的優化

中圖分類號： S646.1⁺41 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2025）06-035-09

Optimization of reference genes for qRT-PCR of Pleurotus ostreatus under different lighting treatments

HUMengdan， ZHUMengke， ZHANG Peng， GAO Yuqian，QIULiyou，LI Yanan （CollgeofLifeiensHennAgicturalUesitKeyboratyofrictualcbalEeEngengstfA ricultureandRuralAffairs，Zhengzhou45oo46，Henan，China）

Abstract：To identify suitable reference genes for analyzing the specific gene expressonof Pleurotus ostreatus under differentlightingtreatments，themyceliumof P. ostreatuswasused asthematerial，and12 geneswere screened fromthe transcriptome data of mycelium under different lighting treatments as candidate reference genes forqRT-PCRof P. ostreatus，and their expression abundanceand expresionstabilitywereevaluated.Theresults indicatedthatthe primersof12 candidatereference genes had goodspecificity inqPCR，with single peaks in the meltingcurve，andthe CTvalues of the genes were between18and26，demonstrating good gene expressionabundance.Theexpression stabilityanalysisof geNorm，NormFinderand BestKeepershowedthatthe expressionstabilityofeukaryotic translationinitiation factorl encodinggene（eIF1），ubiquitin-conjugating enzyme encoding gene（UBC），40S ribosomal protein encoding gene（40SRP）and actinl encoding gene（Actin1）were atthe forefrontin thethree analyses.The expression abundanceof these four genes underdifferent lighting treatments from high to lowwas UBC，eIF1，Actinland 40SRP.eIF1and UBCcanbeused as the best reference gene combinationatthe high abundance expresion levelof target genes.40SRPandActinlcanbeused as the best reference gene combination at medium and low abundance expression levels of target genes.

Keywords：Pleurotus ostreatus;Reference gene;Lighting treatment; qRT-PCR

食用菌在栽培過程中需要適宜的光照1，不同品種的食用菌對光照具有不同的要求和響應[2-]。研究發現，在黑暗條件下，杏鮑菇原基可以形成，但難以進一步分化成具有正常結構的子實體；而在紅光和藍光條件下，原基能夠正常分化，且在藍光下分化的速度快，數量比紅光下多。在藍光下，與光調控相關的脫氧核糖二嘧啶光解酶基因PHR表達量顯著上調3。Kim等研究表明，藍光對香菇菌蓋和菌柄的發育有顯著影響，對其分析發現碳水化合物活性酶編碼基因和部分轉錄因子編碼基因的表達量出現明顯上調，為進一步解析光照對其調控機制奠定了基礎。糙皮側耳（Pleurotusostreatus），又名平菇，是我國栽培量最大、栽培范圍最廣的食用菌之一[7，因其具有高營養價值及藥用特性而著名。在糙皮側耳的生長中，其對光照的需求主要體現在原基分化時期和子實體形成及發育時期。目前通過試驗發現，不同程度的光照對糙皮側耳菌絲培養時期的生長發育也會產生不同的影響。分析不同光照條件下生長發育和調控中相關基因的表達差異，是解析其光調控機制的重要研究途徑。

實時熒光定量PCR（qRT-PCR）是研究基因表達差異的主要方法。該方法具有微量、高效、快速得到結果的特點。qRT-PCR計算基因表達量時通常采用 2^-ΔΔCt 的方法，該方法基于CT（cyclethresh-old）值，即反應過程中熒光信號達到閾值以上的最小循環數，通過計算目標基因與其內參基因之間的 CT 值差異，進而轉換為表達量的對數比值，從而實現對基因表達水平變化的相對定量。內參基因用于校正組內和組間由于樣本處理、RNA提取、逆轉錄及定量效率等可能存在的試驗誤差，對其進行歸一化處理，確保試驗結果的準確性[]。因此，內參基因的選擇在分析基因表達差異的過程中起著至關重要的作用，不合適的內參基因的使用會導致對基因表達水平和表達趨勢的誤判。通常，選擇在不同組織和不同處理條件下表達量穩定且相對較高的管家基因作為內參基因[l-12]。管家基因中 β. -肌動蛋白（ β. -actin）、 β. 微管蛋白（ β -tublin）、甘油醛-3磷酸脫氫酶（glyceraldehyde3-phosphatedehydrogenase）編碼基因作為常用的內參基因[13]。但是在特定處理條件下，一些常規管家基因的表達穩定性可能也會發生變化，導致其不再適合作為特定研究的內參基因。此時，需要通過分析對比通用管家基因的表達穩定性，以篩選出更合適的內參基因。

目前可用于分析基因表達水平穩定性的軟件有geNorm[14]、NormFinder[15]、BestKeeper[1等。Ge-Norm軟件可以篩選出兩個及兩個以上較為穩定的內參基因，通過程序運算，計算各個基因的 M 值， M 值越低，其作為內參基因的穩定性越高；反之越低[4]。NormFinder可用來篩選1個基因作為最優內參基因，通過程序計算出 S 值， s 值越低，表明該基因作為內參基因的穩定性越高；反之越低[5]。BestKeeper通過程序計算出每個基因相應的變異系數和標準偏差，變異系數和標準偏差低的基因適合作為內參基因。通常情況下，可通過這3個軟件的綜合評價分析，篩選出最優內參基因。

真核翻譯起始因子編碼基因eIF在日本桉 （Eu. onymusjaponicus）[7]、秋葵（AbelmoschusesculentusL.）[8]、魔芋（AmorphophallusKonjac）[]等植物中被廣泛用作內參基因，但在食用菌中使用此基因作為內參基因的報道較少。Yang等[2研究發現，絲狀真菌中新型內參基因RNB、V-ATP和VAMP比傳統內參基因ACTB、β-TUB和GAPDH更為穩定。王文沛等[2]發現在草菇（Volvariellavolvacea）常用菌株和繼代退化菌株中最佳參考基因組合為SPRYp和α -TUB，但Tao等[22發現，SPRYp、Ras和Vps26在草菇中表現出高穩定性。VSN、CYP、Ctsyn、UBC、40SRP和60SRP在生物脅迫下篩選內參基因中也有較多報道[23-24]，但在食用菌中使用頻率較低。在糙皮側耳中，VSN和Rbp在不同氮源處理下比Ac-tin1更適合作為內參基因，但在熱脅迫條件下，Actin1成為最佳選擇[25]。不同光照條件下內參基因的篩選報道較少，在植物刺葡萄（VitisdavidiiFoex.）愈傷組織中，不同光條件下最適內參基因為60SRP和TUB2，目前并未發現在食用菌中不同光質處理的內參基因的報道。筆者初步對這些基因在不同光照下糙皮側耳轉錄組中的本底FPKM值進行分析，篩選出了12個候選內參基因，并進一步對其表達豐度和表達穩定性充分對比分析，以期能夠為不同光質處理下qRT-PCR的規范和數據處理的保真性提供支撐，為研究糙皮側耳的基因表達水平和光調控機制提供保障。

1材料與方法

試驗于2024年4一8月在河南農業大學生命科學學院力行樓進行。

1.1供試菌株及培養基

糙皮側耳X831由河南農業大學食用菌課題組保存；麩皮固體培養基：麩皮 20g 蛋白豚 2.0g? 酵母粉 2.0g.MgSO₄?7H₂O0.5g.KH₂PO₄0.46g.K₂HPO₄ 1.0g? 瓊脂粉 20g. 加去離子水補足至 1000mL ，分裝后使用滅菌鍋于 121^°C 高壓滅菌 30min 0

1.2 不同光質處理

將活化后的菌種接種于麩皮固體培養基中，25°C 恒溫黑暗培養。在培養2d后，每天對菌絲分別進行紅光、藍光、白光 2h 光照處理（約 1000lx ，共處理6d），以黑暗培養的菌絲作為對照，培養7d后收集菌絲并于液氮中速凍，置于 -80^°C 冰箱備用。

1.3總RNA提取與反轉錄

使用TRIeasyTM Total RNA Extraction Reagent（購自上海翌圣生物科技有限公司）提取已保存菌絲的總RNA，具體按照說明書操作。通過瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計檢測RNA的完整性和濃度。使用 4×gDNA wiper Mix、 5× HiScript IIIqRTSuperMix（購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司）進行反轉錄獲得cDNA片段，保存于 -20°C 備用。

1.4候選內參基因的篩選、引物設計與基因克隆

通過查閱文獻[17-26]，使用NCBIblast比對分析，在糙皮側耳中初步選擇了20個內參基因，對其在不同光質下的轉錄組數據進行進一步篩查，以轉錄組數據中平均FPKM值 gt;100 以及 MFC?2 （最大值與最小值的比值）2作為參考依據，初步篩選出進一步重點關注的候選內參基因。查找候選內參基因的編碼序列，設計qRT-PCR引物，并對引物的特異性進行驗證。引物由生工（上海）生物工程有限公司合成，擴增產物長度為 100～200bp 。

1.5熒光定量引物標準曲線和擴增效率分析

qRT-PCR反應體系為 20μL 。使用定量PCR儀進行反應，運行過程中通過熔解曲線分析引物特異性。在熒光定量PCR引物的外側設計引物并通過常規PCR擴增獲取模板核酸片段的標準品，凝膠回收后測定其核酸濃度 （ρ）（100ng?μL^-1 左右），將模板標準品按照梯度稀釋 （10⁰，10^-1，10^-2，10^-3，10^-4） ，并分別進一步進行熒光定量PCR，記錄各稀釋濃度下對應的 CT 值，用于分析引物擴增的標準曲線和擴增效率。以標準品濃度為橫坐標，以基因的 CT 值為縱坐標，計算分析各基因的斜率 k 和回歸系數 R² ，通過E=10^-1/k-1 計算出各內參引物的擴增效率[]。

1.6不同候選內參基因的表達穩定性分析

以不同光質處理的糙皮側耳的cDNA為模板，采用1.5中確認過的標準曲線和擴增效率正常的熒光定量引物進行qRT-PCR，記錄其CT值，用于后續對候選內參基因表達穩定性的篩選。將不同光質處理下各候選內參基因的CT值通過geNorm、NormFinder和BestKeeper軟件進行分析，以反映基因表達的穩定性，具體參照Vandesompele等[14]、An-dersen等[]和Michael等[的方法。最終，對不同軟件中的穩定性排名進行綜合評估[2，以確定最合適的內參基因。

1.7 數據分析

采用Excel2016記錄整理數據；采用SPSS對試驗結果進行統計分析；采用Prism10對試驗分析結果繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 候選內參基因的篩選

通過查閱文獻初步選擇20個內參基因，基于糙皮側耳在不同光質處理下的轉錄組數據，對反映基因表達豐度的FPKM值進行匯總分析。在前期試驗中，筆者發現當FPKM值低于100時，其qPCR結果顯示的CT值大于26，此時CT值相對過大，不再適合作為內參基因。結果分析顯示（表1），絲狀真菌中的新型內參基因SPRYp、RNB、V-ATP、VAMP的平均FPKM值低于100，其中RNB和VAMP在某些處理下幾乎不表達，V-ATP在不同光質處理下存在超過2倍的表達差異。此外，不同氮源下篩選到的糙皮側耳最優內參基因為Rbp和VSN，但在本研究中， Rbp 的平均FPKM值小于100，不再適合作為常規表達量的內參基因。同時，Ctsyn和Actin3的平均FPKM值也低于100，而Cyp的平均FPKM值高于5000，也不適合作為常規表達量的內參基因。當 MFC?2 時，基因處于嚴格穩定狀態， MFCgt;2 的基因不適合作為內參基因。最后通過篩查獲得了12個候選內參基因，分別為Vps26、Ras、eIF1、eIF5A、Actinl、Actin2、GAPDH、TUB、UBC、VSN、60SRP、40SRP。

2.2 RNA質量和引物特異性檢測

將提取后的總RNA進行瓊脂糖凝膠電泳，均具有明亮的18S和28S條帶，通過分光光度計檢測其 A_260/280 在 1.8～2.1 之間， A_260/230 在 2.0～2.4 之間，說明提取的總RNA完整性較好。實時熒光定量PCR熔解曲線呈單一峰（圖1），說明引物特異性較好。as、40SRP、Vps26、VSN、對12個基因繪制標準曲線，結果表明候選內參基因的擴增效率處于 91%～116% 之間，回歸系數處于0.990 8～0.999 5 之間（表2）。結果顯示，引物擴增效率符合后續分析的要求。

表2不同候選內參基因熒光定量PCR擴增引物的標準曲線和擴增效率分析

2.3 候選內參基因CT值分析

對不同光質處理下12個候選內參基因的CT值進行分析，發現12個內參基因的CT值均處于18＼～26之間，其中基因表達豐度較高的為UBC、eIF1、eIF5A、TUB；基因表達豐度為中等水平的是Actin1、40SRP、60SRP；基因表達豐度較低的是Actin2、Ras、GAPDH、Vps26和VSN。同一基因在不同處理中的CT值波動幅度可反映其表達穩定性，波動值越小，基因穩定性越高。候選內參基因中穩定性較高的內參基因為Ras、40SRP、eIF1、GAPDH；穩定性中等的為Vps26、VSN、Actin1、UBC、60SRP；穩定性較差的為eIF5A、Actin2、TUB（圖2）。對這些候選內參基因的表達穩定性進一步利用geNorm、NormFinder和BestKeeper軟件進行定量分析。

2.4候選內參基因表達穩定性分析

2.4.1geNorm分析通過geNorm分析不同光質處理下候選內參基因的 CT 值，獲得候選內參基因的 M 值。 M 值越大，表明該基因作為內參基因的穩定性越低；M值越小，穩定性越高；當 M 值 gt;1.5 時，不適宜作為內參基因。分析12個候選內參基因數據，通過 M 值對其穩定性進行比較（圖3），發現 M 值均小于1.5，其中UBC和60SRP的 M 值最小，Ac-tin1和eIF1次之，這些基因表達穩定性較高，TUB和Actin2表達穩定性較差。

2.4.2NormFinder分析通過NormFinder分析不同光質處理下候選內參基因的 CT 值，獲得候選內參基因的 s 值。 s 值越大，表明該基因作為內參基因的表達穩定性越低， S 值越小；其作為內參基因的表達穩定性越高。分析結果得到候選內參基因的表達穩定性排名如圖4所示，eIF1的 s 值最低，穩定性最強，UBC、Actin1和40SRP次之。此排名順序與geNorm的結果有所差異。

2.4.3BestKeeper分析通過BestKeeper分析不同光質處理下候選內參基因的 CT 值，獲得候選內參基因的標準偏差（SD）和變異系數 （CV） 。 CV 和SD越大，說明穩定性越弱，反之穩定性越強。當SDgt;1 時，基因的穩定性較差，不宜作為內參基因。如表3所示，試驗中所選的12個基因 SD 均小于1，其中 SD 相對小的為Ras、40SRP、Vps26和VSN;CV 較低的基因為Ras、40SRP、Vps26、VSN。對這2項參數進行排序，并通過幾何平均數法得出Best-Keeper分析中各基因的穩定性排名，結果顯示，排名靠前的候選內參基因是Ras、40SRP、Vps26、VSN、GAPDH、eIF1和Actin1。

2.4.4候選內參基因的綜合性分析通過幾何平均數法對3種軟件的分析結果進行綜合排序（圖5），發現geNorm、NormFinder和BestKeeper分析后的優勢內參基因排名有所差異，geNorm和NormFinder分析排名較為一致。結果表明，綜合排名較靠前的基因為eIF1、UBC、40SRP和Actin1，適合作為不同光質處理下的內參基因。TUB和Actin2整體排名較靠后，不適合作為不同光質處理下的內參基因。

2.4.5候選內參基因兩兩變異性分析多項研究表明，僅使用一個內參基因進行靶基因表達量分析是不充分的，通常要2個及以上的內參基因對靶基因的表達量進行分析更為準確。通過geNorm對12個候選基因進行兩兩變異分析（圖6），以確定適合不同光質處理下參考基因的數量，當 V_n/n+1lt;0.15 時，認為適合該條件下的參考基因數量為 n 個。在不同光質處理下V_2/3lt;0.15 ，意味著最適參考基因數量為2個。綜合考慮上述對基因表達豐度和表達穩定性的分析結果，當靶標基因的表達量處于高水平時， eIFI 和UBC可以作為最佳內參基因組合；對于中度和低表達水平的靶標基因，40SRP與Actin1可作為理想的內參基因組合。

3 討論與結論

內參基因的選擇對基因表達分析的準確性至關重要，對目標基因進行基因表達量分析之前，必須對內參基因的穩定性進行綜合評估，以確保試驗結果的可靠性和數據的準確性[23-24]。并非所有傳統內參基因均適用于作為不同條件下的參照標準，這一現象可能歸因于不同物種之間以及不同處理方式下的生物學差異[3]。因此，精心挑選一個適宜的傳統型內參基因對試驗的準確性和可靠性至關重要。由于不同光質處理下內參基因的選擇未見系統的報道，在本研究中，筆者對糙皮側耳中內參基因的選擇進行了深入分析，旨在評估不同光質處理下內參基因的穩定性。在絲狀真菌中，傳統的內參基因如β-ACT、β-TUB和GAPDH常被用于qRT-PCR試驗中的標準化分析，但是Yang等2的研究中報道了3個新的內參基因RNB、V-ATP和VAMP在絲狀真菌穩定性評估中表現出比傳統內參基因更高的穩定性。筆者的研究結果表明，這些新型候選內參基因RNB、V-ATP和VAMP在不同光質處理下的糙皮側耳轉錄組中的表達量低且在不同處理組中相對不穩定，不再適合作為內參基因。

筆者通過基因熒光定量PCR獲得CT值，并通過geNorm、NormFinder、BestKeeper軟件對12個候選內參基因在不同光質處理下的表達穩定性進行了綜合分析，發現在不同光質處理下，常規內參基因Actin2和TUB不再適合作為糙皮側耳中的內參基因，這一發現與Trichodermaatroviride中Actin在光照條件下表達不穩定的研究結果一致2。在草菇中，Actin不適合作為內參基因，而在熱脅迫下糙皮側耳中，Actin可作為最佳內參基因[28]。此外，在橡膠靈芝菌[2]、天藍苜蓿[3中，TUB不適合作為內參基因。而在茯苓[中， a-TUB 適合作為不同組織中的內參基因。這些結果顯示，不同的生物學背景，不同的處理條件，常規內參基因的適用性也會發生改變。

本試驗結果表明，不同光質處理下糙皮側耳的eIF1、UBC、40SRP和Actin1基因表現出了較高的穩定性，適合作為最優內參基因的選擇。其中，有關eIF1的這一結論與積雪草[32]、廣藿香[33]、青錢柳[34]、魔芋[19]和黑麥草[35]等植物中 eIF 基因的高穩定性相一致，表明這些植物中eIF基因在不同條件下均能保持相對穩定的表達水平。然而，在斑地錦[3]、桑果[37]和樟葉越橘[38]中， eIF 基因則不適合作為內參基因，因為這些植物在特定條件下eIF基因的表達穩定性不足。在植物中，真核翻譯起始因子eIF作為內參基因的應用較為廣泛，但在食用菌中鮮有報道。同樣，40SRP和UBC在食用菌中的研究也較為有限。這些新型內參基因的鑒定為食用菌內參基因的選擇提供了新的參考依據。

在選擇內參基因時，除了考慮其表達穩定性外，還要考慮其表達量的平均值大小，要與目標基因相匹配。Yang等[2對內參基因選擇時將其歸為適用于不同表達水平靶標基因的內參基因。在本研究中，綜合考慮基因表達豐度和表達穩定性，當靶標基因的表達量處于高水平時，eIF1和UBC可以作為最佳內參基因組合；對于中度和低表達水平的靶標基因，40SRP與Actin1的組合可作為理想的內參基因組合。這種劃分可以使不同表達豐度的基因表達水平的計算更加科學。

綜上所述，真核翻譯起始因子編碼基因（eIF1）、泛素結合酶編碼基因（UBC）、40S核糖體蛋白編碼基因（40SRP）和肌動蛋白編碼基因（ActinI）在geNorm、NormFinder和BestKeeper3種分析方法中的表達穩定性均位于前列，其中eIF1和UBC可以作為靶標基因高豐度表達水平下的最佳內參基因組合，40SRP和Actin1可作為靶標基因中、低豐度表達水平下的最佳內參基因組合。研究結果為不同光質處理下qRT-PCR的規范性和數據處理的保真性奠定了基礎。

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