卡瑞利珠單抗聯合順鉑誘導食管鱗癌Eca-109細胞凋亡的研究

中圖分類號：R735.1 文獻標志碼：A DOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2025.03.010

Abstract：Inorder to study the effctofcarilizumabcombined with cisplatinonapoptosis of esophagealsquamous cell carcinoma celsEca-109byregulating mitochondrialoxidative phosphorylation （OXPHOS）andphosphatidylinositol3 kiase/ proteinkinaseB（PI3K/AKT）signaling pathway，andtoobservetheexpresionofheatshock proteinA9（HSPA9）.Inthis study， the test was divided into blank control group，cisplatin group （100μmol/L ）and combined administration group which is cisplatin （100μmol/L）? +carrilizumab 200mg/time ）.Transwell migration test，scratch test，cell counting kit8（CCK-8） test andclonalaggregation technique were used toobserve the effectsofcarrelizumabcombined with cisplatinontheinvasion， migrationand proliferationof esophagealsquamouscellcarcinomacelsEca-19.The expressionofHSPA9gene wasdetected by RT-PCR. Westernblot（WB）was used to detect the expresion ofOXPHOS and PI3K/AKTpathway proteins.Mitochondrial reactiveoxygenspecies （ROS）were detected byflowcytometry.Transwellmigration，scratchtest，CCK-8 testandclonal formationtestshowedthatthecombinedadministrationgroupihbitedtheactivitymigrationandaggregationofEca-O9cells more than the cisplatin group.Reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR）and WB detectionresults showed that compared with cisplatin group and control group，the expresion of HSPA9 and OXPHOS in combined administration group significantly decreased，and the phosphorylation of PI3K/AKTwas inhibited （Plt;0.01 ）. Flow cytometry showed that compared withcontrolgroupandcisplatin group，ROSlevelsincisplatin+carilizumab groupsignificantly increased，andtherewas a significantdifference ?Plt;0.05 ）.Compared with cisplatinalone，carrellizumabcombined with cisplatincould significantly inhibit the expressionofHSPA9andOXPHOS inesophagealsquamous cellcancercells，ihibit thephosphorylationofPI3K/ AKTsignalingpathwayandregulatereoxidationandmitochondrialhomeostasis.TheinhibitionofEca-1O9onesophageal squamous cellcarcinoma by inducing mitochondrial apoptosis provides a reference forthe precise interventionandtreatmentof esophageal squamous cell carcinoma in clinical practice.

Key words： carrilizumab; cisplatin; esophageal squamouscell carcinoma; OXPHOS; HSPA9 （ActaLaser Biology Sinica，2025，34（3）：274-281）

食管癌（esophagealcancer）是臨床上發病率較高、惡性程度較高的一類消化道腫瘤，因臨床癥狀較隱匿，早期不容易被及時發現，等出現臨床癥狀時已是中晚期。因此，其具有高發病率、高侵襲性以及預后差等特點，其治療手段較有限，主要為化學治療、放射治療、外科治療和綜合治療。化療是食管癌常見的治療手段，常用的藥物如順鉑（cisplatin）、紫杉醇（paclitaxel）等，但因其副作用較多，常導致療效較差，患者5年生存率不高[1-2]。免疫治療是目前的研究熱點，程序性死亡受體1（programmed cell death1，PDCD1）抑制劑屬于免疫檢查點抑制劑，具有適應證廣、療效安全可靠等特點。注射用卡瑞利珠單抗（camrelizumabforinjection）屬于人源化的免疫球蛋白G4（immunoglobulinG4，IgG4）單克隆抗體中的一種，是PD-1抑制劑，其通過激活T細胞發揮抑制腫瘤的作用[3]。自2019年卡瑞利珠單抗獲批用于治療經典型霍奇金淋巴瘤以來[3]，卡瑞利珠單抗的適應證不斷擴大，截至2021年底，卡瑞利珠單抗已在淋巴瘤、肺癌、肝癌以及鼻咽癌等腫瘤中廣泛應用。隨著研究技術水平的不斷提高和完善，HSPA9基因已經在不同類型腫瘤細胞的增殖和發生發展中被證實發揮著一定的作用，并和腫瘤細胞侵襲轉移存在高度的相關性，這就為臨床的診斷及靶向治療提供了一定的理論依據。近幾年來，研究人員對婦科腫瘤及消化系統惡性腫瘤的臨床病理特征進行了系統地統計分析，進一步明確了HSPA9可以作為癌癥獨立的危險因素，并提出了其對腫瘤患者預后的預測價值。磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信號通路是腫瘤細胞惡性增殖、轉移的重要通路之一，通過產生磷酸化，阻斷抑癌基因形成復合物，從而促進癌癥的形成[4]。研究表明，HSPA9通過MEK/ERK、PIK3/AKT、JAK/STAT、 β -catenin通路發揮上述作用。線粒體在腫瘤的發生、發展中發揮著重要的作用。細胞氧化磷酸化（oxidativephosphorylation，OXPHOS）和活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）水平的改變均在線粒體中發生。卡瑞利珠單抗聯合順鉑在食管鱗癌細胞Eca-109中的研究鮮有報道。本研究擬分析PI3K/AKT信號通路在卡瑞利珠單抗聯合順鉑促進食管鱗癌發生凋亡中的作用，以及聯合用藥對相關凋亡蛋白HSPA9表達的影響和線粒體OXPHOS和ROS水平的研究，為臨床上食管鱗癌的精準干預和治療提供新靶點。

1材料與方法

1.1主要細胞株、藥物、試劑與儀器

食管鱗癌細胞株Eca-109、正常人的食管上皮細胞（HET-1A）購自上海生命科學院細胞庫，在本實驗室中進行傳代培養并于液氮中保存。順鉑注射液購自山東省德州德藥制藥公司，產品規格每瓶為 10mg ，產品批號為CYHB2100107;卡瑞利珠單抗注射液購自蘇州盛迪亞生物醫藥有限公司，產品規格每瓶為 200mg ，產品批號為CTR20212837；DMEM培養基、RPMI1640培養基和胎牛血清（fetalbovineserum，FBS）來源于美國Gibco公司；所有一抗含AKT（1：2000；ab235958）P-AKT（1：2000：ab81283）PI3K（1：2000;sc-93）P-PI3K（1：2000;sc-16982-R）、HSPA9（sc-81623）和GADPH（sc-47778），均來源于美國Abcam公司；異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）和碘化丙啶（pmropidiuIodide，PI）購自美國Sigma公司；細胞計數試劑盒-8（CCK-8）反轉錄試劑盒由上海生工生物工程股份有限公司提供；聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidenefluoride，PVDF）來自上海碧云天生物技術有限公司；二喹啉甲酸（diquinolinicacid，BCA）特定蛋白定量檢測試劑盒購自美國Thermo公司。主要儀器有QiEPICSULTRA流式細胞儀（美國Beckmanamp;Coulter公司）TCSSP2激光共聚焦顯微鏡（德國Leica公司）MultiskanFC型多功能酶標儀（上海熱電生物科技有限公司）等。

1.2 培養與傳代

將食管鱗癌細胞株Eca-109和正常人的食管上皮細胞（HET-1A）放置于DMEM培養基中（含 10% 的FBS、 100U/mL 青霉素和 100U/mL 鏈霉素）于 、飽和濕度 95% 的恒溫細胞培養箱中貼壁培養，并用 0.25% 胰酶-EDTA進行消化，當貼壁的細胞達到 80%～90% 時進行傳代，傳至第三代后，收集培養的細胞用于后續試驗研究。

1.3CCK-8試驗檢測細胞活力

將 100μmol/L 順鉑處理過的Eca-109細胞接種在96孔板中（每孔 1×10⁴ 個細胞），培養 0，24，48h 和72h后，每組設置6個重復孔，同時取6個孔做空白對照孔，各孔分別加入 10% CCK-8溶液（ 10μL ），繼續在 37^°C，5%CO₂ 培養箱中孵育培養2h，最后用酶標儀測定各孔在 450nm 處的吸光度值并計算細胞活力。

1.4平板克隆形成試驗

取對數期生長的各組細胞，分別用 0.25% 胰酶-EDTA消化并吹打成單個細胞，加入RPMI1640培養基（含 10% FBS）制成細胞懸液，將懸液作梯度倍數稀釋，分別以每孔 500～1000 個細胞的密度接種于6孔板，每個試驗組重復3個復孔，并輕輕轉動，使細胞平均分布，于 細胞培養箱中培養 7～14d 。丟棄上清液，用PBS洗滌細胞3次，加入 4% 多聚甲醛對細胞進行固定， 20min 后丟掉固定液， 0.2% 結晶紫染色 5min ，最后使用PBS洗滌細胞，晾干，用相機拍照，計算克隆形成率。

克隆形成率 %= 克隆數/接種細胞數 ×100%

1.5 劃痕試驗

在24孔板中接種Eca-109，待細胞鋪滿孔底后，在孔底垂直劃線，并用ImageJ軟件測量 0h 的劃痕寬度，培養 48h 后，再次測量 48h 的劃痕寬度，計算細胞遷移率。

細胞遷移率 /%=（0h 劃痕寬度-48h劃痕寬度） /0h 劃痕寬度 ×100% （2）

1.6 細胞內ROS水平的測定

將每孔 3×10³ 個Eca-109細胞置于6孔培養板中，用藥物（順鉑 和卡瑞利珠單抗每次200mg ）培養 24h 后收集，加人PBS液 5mL ，洗滌3次， 5000r/min 離心 5min 后丟棄上清液，收集沉淀細胞，用加人DCFH-DA的無血清培養基重懸細胞，并于 37^°C 恒溫箱中孵育 40min ，最后加入 5mL PBS終止反應， 5000r/min 離心 10min 收集單細胞，將沉淀細胞用 500μL PBS輕輕吹打均勻后上機（流式細胞檢測儀）檢測。每次試驗需獨立重復3次。

1.7 HSPA9基因的表達檢測

用Trizol提取培養 ^48h 后的Eca-109細胞的RNA，按照逆轉錄試劑盒步驟逆轉錄RNA為第一鏈DNA，按照試劑說明書的要求于擴增反應管中依次加人第一鏈DNA、RNaseFree H₂O 、dNTPMixture（10mmolL ） 10×RT Buffer、 MgCl₂ 、HSPA9引物、β2微球蛋白引物和Opti-Taq在PCR儀器中進行片段擴增，擴增后的片段于 4^°C 保存。最后，用 2% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定HSPA9基因的表達情況。引物序列見表1。

1.8蛋白質印跡（Westernblot）法檢測AKT、PI3K和OXPHOS的表達

48h 后收集培養板中的細胞， 1500r/min 離心 5min ，獲取沉淀細胞，抽提總蛋白并測定蛋白濃度。利用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）分離蛋白，并轉至PVDF膜， 5% 脫脂牛奶室溫封閉 ^2h ，接著加入一抗AKT、PI3K、OXPHOS（ ）和內參（GAPDH）（ 1：1 000? 繼續 4% 過夜孵育，隨后加人二抗1：5000，室溫避光孵育2h，洗滌3次，每次 10min 最后在成像系統進行顯影、定影，掃描膠片。計算分析條帶灰度值采用ImageJ軟件。

目的蛋白相對表達量 Σ=Σ 目的蛋白灰度值/GADPH蛋白灰度值 （3）

1.9 統計學方法

兩兩比較采用獨立樣本t檢驗，多組間利用單因素方差進行統計學分析，計量資料數據以平均值± 標準差 表示， Plt;0.05 被認為差異有統計學意義；運用GraphPadPrism10軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1各組細胞增殖活力的比較

用 100μmol/L 濃度的順鉑處理 0，24，48h 和72h 后，Eca-109細胞存活率呈現下降趨勢，分別為（97.2±1.9）^0%（76.4±8.3）^0/_0.（61.9±4.4）^0/₀ （33.8±3.2）% 。如圖1所示，順鉑 100μmol/L 和卡瑞利珠單抗每次 200mg 聯合用藥 24h 和 48h 的細胞存活率分別為 （63.7±2.3）% 和 （51.2±5.4）% 。因此，選擇 48h 順鉑 和卡瑞利珠單抗每次 200mg 進行后續試驗。

2.2 Eca-109細胞克隆聚集的對比

從圖2a中可以看出，隨著順鉑和卡瑞利珠單抗的加人，與對照組（不加藥物組）和順鉑組相比較，細胞聚集的數量肉眼可見明顯減少（ Plt;0.05 ）（圖2），各組細胞克隆形成率分別為 90% 、 56% 和24% ，提示順鉑和卡瑞利珠單抗可能對Eca-109細胞有明顯的抑制作用。

2.3 Eca-109細胞遷移能力的對比

用藥0h和 48h 后觀察細胞的遷移情況，試驗發現，順鉑組和聯合用藥組與對照組相比較， 0h 各組沒有變化， 48h 后順鉑組和聯合用藥組細胞的遷移數明顯低于對照組，差異有統計學意義（ Plt;0.05 ））（圖3）。

2.4各組細胞中線粒體ROS表達水平的比較

對照組、順鉑組和聯合用藥組中ROS的表達水平分別為 14.29% 19.35% 和 23.73% ，順鉑組和聯合用藥組分別與對照組相比較，ROS的表達水平增高，隨著卡瑞利珠單抗的加人，聯合用藥組細胞線粒體ROS的表達進一步增加，差異有統計學意義0 （圖4），提示ROS釋放到一定程度可以影響腫瘤細胞的發生和發展。

2.5Eca-109細胞中 HSPA9mRNA 表達的比較

如圖5所示，順鉑組和聯合用藥組用藥48h后Eca-109細胞中HSPA9mRNA的表達水平低于對照組，隨著順鉑組中加入卡瑞利珠單抗，與其他組相比較， HSPA9mRNA 的表達水平快速地下降，差異具有統計學意義 （Plt;0.05 。

2.6Eca-109細胞中AKT、ERK和OXPHOS相關蛋白表達的對比

48h 聯合用藥組與對照組和順鉑組相比較，

AKT、PI3K和OXPHOS的表達發生顯著下降，隨著卡瑞利珠單抗的加入，其抑制AKT和PI3K蛋白發生磷酸化，差異有統計學意義（ Plt;0.01 ）；順鉑組與對

（a）電泳圖； （b）HSPA9/β₂m 光密度比值。1：Eca-109;2：Eca ?109+1 Cisplatin;3：Eca- 109+ Cisplatin+Carrellizumab;4：Marker。與對照組相比， （20 ^*Plt;0.01 ；與順鉑組相比， ^#Plt;0.05， 0 （a）Electrophoresed photo; （b） Ratio of luminous intensity of HSPA9 to β₂m bands.1： Eca-109;2：Eca ?109+ Cisplatin; 3：Eca-109+Cisplatin+Carrellizumab; 4：Marker.Compared with control group， ^*Plt;0.01 ; compared with control group， ^#Plt;0.05

照組相比較，AKT、PI3K和OXPHOS的表達無明顯改變，無顯著性差異 Pgt;0.05） （圖6）。這提示AKT、PI3K和OXPHOS蛋白表達的改變在卡瑞利珠單抗誘導腫瘤細胞發生凋亡中發揮著重要的作用。

3 討論

食管癌是一類發病率和死亡率較高的惡性腫瘤，其致病機制非常復雜，往往涉及基因突變、DNA損傷、腫瘤微環境等，不良的飲食生活習慣、食管黏膜損傷、炎癥反應、營養不良等也是增加食管癌發病風險的因素[5-6]。目前，食管癌的致病原理一直未能完全揭示，眾多學者希望通過尋找有效的藥物來降低食管癌的病死率。近年來隨著研究的深人，免疫制劑受到廣泛關注，其逐漸被應用于惡性腫瘤的治療中。注射用卡瑞利珠單抗是一種國產的免疫檢查點抑制劑，通過激活T細胞產生免疫應答，重建腫瘤免疫監測機制，發揮顯著的抗腫瘤作用[7-8]。卡瑞利珠單抗單獨使用療效有限，為使大部分病患受益，提高腫瘤的治療效果，臨床上常將卡瑞利珠單抗和其他藥物聯合使用，卡瑞利珠單抗聯合順鉑對食管癌細胞Eca-109的治療效果及作用機制的研究鮮有報道。因此，對卡瑞利珠單抗聯合順鉑在食管癌中的作用的相關機制進行研究，在臨床治療中具有重要的意義。

本研究首先通過CCK-8試驗進行檢測，結果顯示，順鉑 100μmol/L 和卡瑞利珠單抗每次 200mg 作用于Eca-109細胞 48h ，細胞存活率為 （51.2±5.4）% 故選擇該濃度進行后續試驗。后面我們運用劃痕試驗和克隆試驗進一步驗證藥物對細胞的抑制作用。本研究發現，卡瑞利珠單抗聯合順鉑作用下，細胞聚集顯著減少，遷移率明顯降低（ ）。這與曾本姣等[3卡瑞利珠單抗在消化道系統腫瘤的應用研究進展中的報道結果相一致，說明卡瑞利珠單抗聯合順鉑對食管癌有顯著的抑制作用。

PI3K/AKT、 Wnt/β -catenin、JAK2/STAT3是食管癌發生、發展的3條主要信號通路。食管癌患者病死率高，主要的原因是化療后期都會出現藥物耐藥情況，腫瘤產生藥物耐藥的機制很多。線粒體被稱為細胞的發電站，細胞內高達 90% 的三磷酸腺昔通過OXPHOS在線粒體中產生，線粒體在正常組織的穩態和代謝、腫瘤的發生發展、神經退行性變、免疫穩態和傳染病等多種生理和病理過程中發揮重要作用[9]。在本研究中，順鉑聯合卡瑞利珠單抗組AKT、PI3K和OXPHOS的表達較順鉑組與對照組相比較顯著下降，并抑制AKT和PI3K蛋白發生磷酸化 Plt;0.01 ）。這與聶旭陽等[10]、向中山等[1]研究發現的PI3K/AKT信號通路系調節多種腫瘤耐藥性的途徑之一、可以通過干預PI3K/AKT通路來抑制PI3K/AKT磷酸化治療甲狀腺癌的報道相一致，說明聯合用藥能夠通過調控PI3K/AKT信號通路和線粒體功能抑制食管癌的發生和發展。本研究發現，卡瑞利珠單抗聯合順鉑使Eca-109細胞內ROS水平顯著增加（ Plt;0.05 ）并誘導Eca-109細胞凋亡，這與眾多研究發現的多種化療藥物能誘導腫瘤細胞內ROS含量升高、當ROS水平達到一定數值時可以誘導腫瘤細胞發生凋亡的相關報道相一致[12-15]，說明ROS的增加對食管癌的進程具有抑制作用。HSPA9基因在包括乳腺癌、結腸癌、肝癌和胰腺癌在內的多種惡性腫瘤中高表達，參與腫瘤抗凋亡與侵襲轉移相關的信號通路，維持線粒體穩態，是腫瘤細胞生長和發展的重要調節因子[16-17]。本研究結果顯示，卡瑞利珠單抗聯合順鉑與對照組和順鉑組相比較，HSPA9表達顯著下降（ Plt;0.01 ，說明HSPA9基因在食管癌的發生、發展中也發揮著重要的作用。

綜上所述，卡瑞利珠單抗聯合順鉑可能通過促進ROS表達，打破氧化還原和線粒體穩態，下調HSPA9和OXPHOS表達，抑制食管鱗癌Eca-109細胞中AKT和PI3K發生磷酸化，抑制PI3K/AKT信號通路的促癌作用從而對食管癌發揮抑制作用。本試驗尚缺少動物試驗的研究，對聯合用藥抗食管癌作用的分子機制研究不夠深入。下一步，我們將從miRNA角度對線粒體信號通路上的蛋白表達抑制進行進一步深入的探討。

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