基于網絡藥理學及動物試驗探究抗纖苗靈方治療肝纖維化的作用機制

摘要：本文主要基于網絡藥理學及動物試驗探究抗纖苗靈方治療肝纖維化的藥效作用機制。通過數據庫篩選出抗纖苗靈方的活性成分及其靶點，并與肝纖維化疾病靶點進行對比，以確定相互作用的核心靶點。隨后，對這些核心靶點進行了蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡、基因本體（GO）功能和京都基因與基因組百科全書（KEGG）信號通路的富集分析。為了驗證網絡藥理學的預測結果，利用硫代乙酰胺（TAA）誘導肝纖維化模型大鼠，并在造模的同時給予抗纖苗靈方進行治療。通過蘇木素-伊紅（HE）和Masson染色觀察肝組織病理學變化，并檢測血清生化指標以及肝臟組織中相關基因的表達情況。研究結果顯示，抗纖苗靈方含有55種活性成分，與肝纖維化共有98個相互作用靶點。PPI網絡分析揭示了絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、腫瘤壞死因子（TNF）白介素-6（IL-6）腫瘤蛋白p53（TP53）、白介素-1β（IL-1β）基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase9，MMP9）缺氧誘導因子1亞單位 a （hypoxia-inducible factor1-alpha，HIF1A）、前列腺素內過氧化物合成酶2（prostaglandin endoperoxidesynthase2，PTGS2）、Jun原癌基因（Jun proto-oncogene，JUN）和雌激素受體1（estrogenreceptor1，ESR1）等10個核心靶點，這些靶點主要涉及癌癥通路、PI3K-Akt信號通路、脂質與動脈硬化以及TNF等信號通路。分子對接試驗表明，槲皮素、龍膽堿、大黃酸和木犀草素等成分與AKT1和PTGS2等核心靶點有良好的分子結合位點。動物試驗發現，與正常組相比，模型組大鼠的肝組織顯示出嚴重的纖維膠原沉積和炎癥細胞浸潤，血清谷丙轉氨酶（ALT）谷草轉氨酶（AST）和總膽紅素（TBIL）水平以及腫瘤壞死因子 σ?a （TNF-α）IL-6和IL-1β的表達水平顯著升高，肝組織中平滑肌肌動蛋白（ a -SMA）磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶催化亞基 a （PIK3CA）AKT1和轉化生長因子β1（TGF-β1）的mRNA水平亦顯著上升。治療組與模型組相比，肝組織炎癥和膠原纖維沉積有所改善，血清ALT、AST和TBIL水平以及炎癥因子表達水平顯著降低，肝組織中 a -SMA、PIK3CA和AKT1的mRNA水平同樣顯著降低。本研究發現，抗纖苗靈方可能通過多組分、多靶點、多通路的相互作用，調節PI3K/Akt與TNF信號通路，抑制炎癥因子的釋放，并促進膠原纖維的降解，從而有效改善TAA誘導的大鼠肝纖維化。

關鍵詞：抗纖苗靈方；肝纖維化；網絡藥理學；PI3K/Akt信號通路；靶點分子對接中圖分類號：Q811.41 文獻標志碼：A DOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2025.03.008

Abstract：Thisarticleaimstoexplore thepharmacologicalmechanismofthekang-xian-miao-lingformulabasedonnetwork pharmacologyandanimal experiments.Activeingredientsandtheir targets fromtheformula were identifiedviadatabase screningand werecompared withtargetsassociated withliver fibrosis todetermine thecore interactiontargets.Thesecore targets underwent enrichment analysisof protein-protein interaction （PPI） networks，gene ontology（GO）functions，and Kyoto encyclopediaof genesand genomes （KEGG）signaling pathways.To validate the predictions derived from network pharmacology，aliver fibrosis model was established inrats using thioacetamide （TAA），withconcurrenttreatmentusing the formula.Histopathological changes in liver tisse were assessed through hematoxylinand eosin （HE）and Masson staining， while serumbiochemicalindicatorsand theexpressionofrelevant genes in livertissue were evaluated.The studyidentified55 activeingredientsinthekang-xian-miao-lingformula，with98interactingtargetsassciatedwithliverfibrosis.Pnetwork analysisrevealed10core targets，icludingAK1，NF，I-6，53，IL-1β，MMP9，HFA，GS2，JUN，andESR1，icre primarilyimplicated inancerpathways，thePI3K/Aktsignalingpathwaylipidmetabolim，atherosclerosis，andTFgnaling pathways.Moleculardockingexperimentsindicatedthatingredientssuchasquercetin，gentianine，emodi，andluteolinehibit favorablemolecularbindingafinitywithcoretargetslikeAKT1andPGS2.Animalexperimentsdmonstratedthat，compared tothe normalgroup，themodelgroupratsexhibitedsignificantfibrouscollagendepositionandinflammatorycellinfiltrationin liver tissue，along withmarkedlyincreasedserm lvelsofALT，AST，andtotalblirubin （TBI）.Aditionaly，iflator factors such as TNF- α_q ，IL-6，and IL- 1β were elevated， alongside increased mRNA expression levels of a -SMA，PIK3CA， AKT1， and TGF- _?{β1 in liver tissue.In comparison to the model group，the treatment group exhibited improvements in liver tissue inflammationandclagenfiberdepositio，alongsidesgnificantlyducedserumlevelsofALT，AST，andIL.Addiioaly therewas adecrease in the expressionof inflammatory factors and the mRNA levelsof α_a -SMA，PIK3CA，andAKT1inliver tissue.Thisstudy foundthat kang-xian-miao-lingformulamayregulate thePI3K/Akt andTNFsignaling pathways through theinteractioofmultiplecomponents，targets，andpathways.Itinhbitsthereleaseof iflammatoryfactorsandpromotes the degradationof collagen fibers，thereby effectively improving TAA-induced liver fibrosis in rats.

KeyWords： kang-xian-miao-ling formula;liver fibrosis;network pharmacology;PI3K/Aktsignalingpathway;target molecule docking

（ActaLaserBiologySinica，2025，34（3）：254-266）

肝纖維化（hepaticfibrosis）是各種慢性肝損傷的過度修復反應，其主要特征是細胞外基質（extracellularmatrix，ECM）的合成與降解失衡，導致肝內彌漫性ECM的過度沉積。這一過程是慢性肝病向肝硬化、肝衰竭甚至肝癌進展的中間病理過程[1]據統計，全球肝纖維化患者接近9億人，每年約200萬人死亡，其中100萬人死于肝硬化，而我國約占28萬人[2]。現代醫學尚未找到治療肝纖維化的明確藥物，而中醫藥在治療肝纖維化方面具有顯著優勢。中醫藥治療肝纖維化的獨特之處在于其多靶點和多途徑的特點，使其在肝纖維化治療中效果顯著，其作用已在相關研究中得到廣泛認可[3]。因此，深入研究肝纖維化的發病機制，以及探索低毒高效的中藥方劑，對肝纖維化的防治具有重要意義。

抗纖苗靈方出自《苗藥方劑學》，屬于貴州民間驗方，由茵陳、連錢草、梔子、龍膽和大黃組成。其中，茵陳（Artemisiascoparia）是菊科植物的干燥地上部分，具有保肝利膽、抗腫瘤、平喘和抗炎的作用[4]。其保肝機制是通過抑制巨噬細胞的炎癥反應，降低肝內脂肪的蓄積能力，以及通過p38-MAPK途徑和PI3K/Akt/NF-kB通路，抑制促炎因子的表達與釋放[5]。連錢草（Glechoma longituba）是唇形科植物活血丹的干燥地上部分，具有消腫、抗炎、抗氧化、抗血栓、保肝利膽、抗腫瘤和降血脂等作用[]梔子（GardeniajasminoidesEllis.）是茜草科梔子屬植物，具有抗炎、抗氧化、利膽、利尿、抗腫瘤、解熱、鎮痛、抗血栓、保護神經和抗阿爾茨海默病等作用[7]。龍膽（GentianaeRadix etRhizoma）是龍膽科植物的干燥根及根莖，具有抗炎鎮痛、保肝、抗腫瘤、調節胃腸功能和調節神經系統等多種生物活性[8]。大黃（Rheum officinale Baill.）是一味常用的藥材，具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經和利濕退黃的功效[9]。現代藥理學研究表明，抗纖苗靈方中的各種中藥均具有保肝作用，能夠改善肝功能，抗肝臟脂質過氧化損傷。盡管抗纖苗靈方在臨床應用治療肝纖維化中取得了一些療效，但對于其抗肝纖維化的具體作用機制的探究仍然十分有限。本研究利用網絡藥理學預測抗纖苗靈方改善肝纖維化的作用靶點及信號通路，通過構建肝纖維化動物模型，檢測抗纖苗靈方對肝纖維化模型大鼠的藥效學作用，并檢測相關作用靶點，闡明抗纖苗靈方改善肝纖維化的機制，為抗纖苗靈方治療肝纖維化提供新思路，并為其進一步臨床應用提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1試劑

硫代乙酰胺（thioacetamide，TAA）購買自麥克林科技有限公司，丙氨酸轉氨酶（alanineaminotransferase，ALT）天冬氨酸轉氨酶（aspartateaminotransferase，AST）和總膽紅素（totalbilirubin，TBIL）試劑盒均購自于南京建成生物工程研究所；白介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子 ?α （tumor necrosis factor- ??a ，TNF- ）和白介素 -1β （interleukin- ?1β ，IL- ?1β ）的ELISA檢測試劑盒均購自于上海酶聯免疫生物科技有限公司；蘇木精-伊紅（hematoxylinand eosin，HE）染色試劑盒和Masson染色試劑盒購自于長沙維世爾生物科技有限公司；引物均由上海生工生物科技有限公司合成；其他化學試劑為國產分析純。

1.1.2 儀器

多功能酶標儀（賽默飛世爾科技有限公司），倒置生物顯微鏡（日本Olympus公司），KH30RF高速離心機（賽默飛世爾科技有限公司），熒光定量PCR儀CFX96Touch（美國伯樂公司），YC-R50電熱恒溫干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司），KZ-III-FP低溫型組織研磨儀（武漢塞維爾生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 網絡藥理學研究

1.2.1.1篩選藥物有效成分及作用靶點

通過TCMsP數據庫（https：//old.tcmsp-e.com/），分別以關鍵詞“連錢草”“茵陳”“梔子”“龍膽”和“大黃”進行檢索。根據五味藥物的口服生物利用度（oralbioavailability，OB） ≥30% 和類藥性（drug-likedrug，DL） ?0.18 作為篩選標準，得到每味中藥的潛在化學成分及其相應的蛋白質靶點。然后，在TCMSP數據庫中檢索化合物靶點，利用UniProt數據庫獲得基因的正式名稱。將物種定義為“Homosapiens”，以排除非人類目標，并對所獲取的靶點名稱進行規范化，從而得到靶蛋白的基因名。

1.2.1.2 獲取疾病的靶點

登錄基因數據庫（GeneCards，https：//www.genecards.org/），以“liverfibrosis”為檢索詞獲取疾病靶點，以Relevancescore ?12 作為篩選分界值，獲取相關性較強的靶點，確定肝纖維化的潛在作用靶點。在微生信平臺（https：//www.bioinformatics.com.cn/ ）中將抗纖苗靈方的靶點及肝纖維化的相關靶點取交集，繪制韋恩圖。

1.2.1.3 構建“藥物成分-疾病-靶點”網絡與蛋白質-蛋白質相互作用（protein-proteininteraction，PPI）網絡

建立抗纖苗靈方“藥物成分-疾病-靶點”相互對應關系的數據集，導人Cytoscape3.8.0軟件中構建“藥物成分-疾病-靶點”靶點網絡。將抗纖苗靈方與肝纖維化相互作用的交集靶點導入String數據庫（https：//cn.Stringdb.org/）進行PPI分析。設定物種為“Homosapiens”，置信度為0.4，然后將數據導入Cytoscape3.8.0軟件進行PPI網絡分析。通過AnalyzeNetwork功能進行拓撲學參數分析，并通過degree進行排序，構建疾病靶點網絡圖。其中，節點越大、顏色越深，表明該節點的degree值越高，即該靶點的作用越關鍵。

1.2.1.4GO功能及KEGG通路富集分析

將交集靶點上傳到Metascape平臺（https：//metascape.org）進行基因本體（geneontology，GO）功能分析，內容包括生物過程（biologicalprocess，BP）分子功能（molecularfunction，MF）和細胞組分（cellularcomponent，CC）。同時，進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，并在微生信平臺上分析繪制GO功能富集氣泡圖和KEGG通路富集氣泡圖。

1.2.1.5 分子對接

使用分子對接對網絡藥理學篩選出的活性成分與肝纖維化交集靶點進行驗證。在PubChem數據庫中下載4種主要活性成分的SDF格式3D結構圖，隨后在美國全球蛋白質數據庫中下載交集靶點的PDB格式3D結構圖。將這些結構上傳至CB-Dock網站（https：//cadd.labshare.cn/）進行分子對接。根據配體分子與受體蛋白結合構象的能量，選擇能量最低、結構最穩定的對接構象，并使用PyMOL進行可視化。

1.2.2 動物試驗

1.2.2.1 動物與藥材

選取的48只雄性（SpragueDawley，SD）大鼠（Rattusnorvegicus），6＼～8周齡，購自長沙市天勤生物技術有限公司［試驗動物生產許可證號SCXK（湘）：2023-0014]，適應性喂養1周后開始試驗，控制飼養室溫 （22±2）^°C ，相對濕度為 （55±15）% 。試驗所有操作均通過醫學倫理委員會審查批準（倫理號：GZY20230015）。抗纖苗靈方的制備方法：稱取茵陳 200g 連錢草 150g， 梔子100g 、龍膽 120g 和大黃 100g ；利用蒸餾水煎煮兩次，每次1h，過濾后將濾液混合；然后在旋轉蒸發儀中將藥液濃縮后冷凍干燥，稱取 10g 溶于1L生理鹽水中，制成 10mg/mL 的溶液備用。秋水仙堿購自北京索萊寶科技有限公司，將其溶于生理鹽水中，制成質量濃度為 0.03mg/mL 的溶液。

1.2.2.2 動物試驗造模、分組與給藥

隨機數字表法將SD大鼠分為正常組、模型組、抗纖苗靈方低、中、高劑量組和秋水仙堿陽性組，每組8只。SD大鼠適應性喂養1周后，其余各組大鼠腹腔注射TAA（ 200mg/kg ）溶液進行造模，每周3次，連續4周。在第5周開始進行藥物治療，依據人與大鼠體表面積換算標準，抗纖苗靈方低、中、高劑量組分別灌胃給予 5.4g/kg，10.8g/kg 和 21.6g/kg 劑量的抗纖苗靈方溶液，分別相當于人臨床用量的1、2、4倍。同時，給予秋水仙堿組大鼠灌胃秋水仙堿溶液 0.1mg/kg ，正常組和模型組則灌胃給予等體積生理鹽水，每天1次。持續給藥4周后，大鼠禁食不禁水 24h ，通過異戊巴比妥麻醉處死大鼠，腹腔動脈取血，采集的肝臟組織迅速置于液氮中冷卻，隨后置于 -80% 冰箱進行后續試驗。

1.2.2.3 各組大鼠血清生化指標檢測

在大鼠腹腔動脈取血后靜置1h，然后在 4^°C 下以 3500r/min 離心 15min ，收集上層血清。根據試劑盒說明書，檢測血清中ALT、AST、TBIL、IL-6、TNF- α_a 和IL-1β的表達水平。

1.2.2.4各組大鼠肝組織病理學檢測

從大鼠肝臟右葉相同位置取樣，放入組織固定液中固定。經過2d后，使用全自動組織脫水儀進行組織脫水、石蠟包埋和切片，隨后分別進行HE染色和Masson三色染色。之后再進行脫水、二甲苯透明與封片，最后使用玻片掃描儀進行掃描和拍照。1.2.2.5利用實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-qPCR）法進行檢測

采用TRIzol提取肝臟組織的總RNA，測定其濃度和完整性后，按照試劑盒說明進行逆轉錄合成cDNA，以3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）作為內參蛋白，定量檢測平滑肌肌動蛋白（alpha-smoothmuscleactin，a -SMA）、轉化生長因子β1（transforminggrowthfactorbeta1，TGF- _?β1 ）磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶催化亞基 a （phosphatidylinositol-4， 5-bisphosphate3-kinasecatalyticsubunitalpha，PIK3CA）和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶AKT1的mRNA表達水平，引物序列見表1。PCR反應條件： 95°C 3min 95°C 15 s， 60^°C 30s，共40個循環。反應結束后，使用 2^-ΔΔCt 法計算基因的相對表達量，以驗證篩選出的關鍵基因的表達情況。

1.3 統計學分析

采用GraphPad8.0軟件進行數據分析，符合計量資料以平均值 ± 標準差 表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組別之間的數據比較采用t 檢驗。以 Plt;0.05 代表差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1抗纖苗靈方有效成分及疾病靶點篩選

通過TCMSP數據庫篩選，得到抗纖苗靈方中連錢草的有效成分8種，龍膽的有效成分10種，梔子的有效成分15種，茵陳的有效成分13種，大黃的有效成分17種。合并各藥的有效成分，共獲得抗纖苗靈方的有效成分55種。本研究納入了抗纖苗靈方配伍中生物活性良好和利用價值大的活性成分，包括槲皮素、木犀草素、龍膽堿、大黃酸、蘆薈大黃酸、山柰酚和谷甾醇，詳見表2。通過整理各數據庫檢索出的靶點，并去除重復項，獲得242個潛在活性靶點。對于GeneCards數據庫中與肝纖維化疾病相關的靶點進行了整理，根據Relevancescore ?12 ，篩選出1119個潛在蛋白靶點。

2.2抗纖苗靈方抗肝纖維化的核心靶點與PPI網絡分析

將得到的抗纖苗靈方的242個活性靶點，與肝纖維化疾病的1119個靶點進行交集。在Venny工具中，對藥物與疾病的交集靶點進行映射，得到抗纖苗靈方作用于肝纖維化的潛在核心靶點98個，見圖1a。使用NetworkAnalyzer對核心靶點進行PPI網絡拓撲分析，采用CytoHubba插件選擇MCC方法提取核心靶點，并根據MCC評分提取前10名靶點，如圖1b所示。關鍵靶點的度值排名前10位的包括AKT1、Jun原癌基因（Junproto-oncogene，JUN）、缺誘導因子1亞單位 a （hypoxia-inducible factor1-alpha，HIF1A）IL- 1β 、IL-6、基質金屬蛋白酶9（matrixmetalloproteinase9，MMP9）、前列腺素內過氧化物合成酶2（prostaglandin endoperoxide synthase2，PTGS2）、腫瘤壞死因子（tumornecrosisfactor，TNF）腫瘤蛋白p53（tumorproteinp53，TP53）和雌激素受體1（estrogenreceptor1，ESR1）。這些靶點可能是抗纖苗靈方抗肝纖維化的關鍵靶點。采用Cytoscape3.8.0軟件構建了“藥物成分-疾病-靶點”網絡，其

表2藥物主要活性化合物基本信息

中化合物節點的大小與化合物的度值呈正相關，如圖1c所示。通過AnalyzeNetwork進行拓撲分析，該網絡包含98個節點和4598條邊。排名靠前的有效化學成分包括槲皮素、木犀草素、龍膽堿、大黃酸、山柰酚、蘆薈大黃酸和谷甾醇等。結果表明，抗纖苗靈方可能通過這些活性成分作用于核心靶點，從而發揮抗肝纖維化的作用。

2.3抗纖苗靈方抗肝纖維化靶點的GO功能富集與KEGG通路富集分析

通過G0功能富集分析得到861個富集條目，包括674個生物過程、57個細胞組分和130個分子功能。篩選出排名前10的條目進行可視化。其中，生物過程主要涉及基因表達的正向調控、RNA聚合酶Ⅱ對轉錄的正調控、對外來刺激的反應、凋亡過程的負向調控、轉錄的正調控和細胞對脂多糖的反應等；細胞組分主要涉及細胞外空間、細胞外區域、含蛋白復合物、細胞核和細胞內溶質等組分；分子功能主要涉及酶的結合、同質蛋白結合、蛋白結合和核受體活性等功能（圖2a）。KEGG通路富集分析得到了抗纖苗靈方抗肝纖維化的重要相關信號通路164條。選取排名前20的通路，繪制了KEGG可視化氣泡圖（圖2b）。富集的通路主要包括癌癥通）抗纖苗靈方與肝纖維化靶點交集韋恩圖；（b）抗纖苗靈方與肝纖維化靶點PPI網絡圖；（c）抗纖苗靈方與肝纖維化“藥物成分-疾病-點”網絡圖。

（a）Vendagaoteiaglaisats;（okafa miao-lingfolailveosisagets;）etwkahofgopeiseasaets”foreagiaolaad liver fibrosis.

路、PI3K-Akt信號通路、脂質與動脈硬化信號通路、TNF信號通路、MAPK信號通路和IL-17信號通路等。其中，抗纖苗靈方抗肝纖維化相關的通路中，PI3K/Akt信號通路的富集程度最高，并且在PPI網絡分析中，多個核心靶點如AKT1、PTGS2和TNF等蛋白靶點均富集于該通路，因此后續動物試驗選用PI3K/Akt信號通路進行驗證。

2.4分子對接分析

分別選取4個主要化學活性成分：槲皮素、木犀草素、龍膽堿和大黃酸，與關鍵靶點AKT1、TNF、TP53、HIF1A和PTGS2進行分子對接分析。結果顯示，這4種主要藥物活性成分與這6個關鍵靶點的結合能大部分小于 -5.00kcal?mol^-1 ，表明所篩選的活性成分與關鍵靶點具有良好的結合活性（圖3a）。通過大黃酸與AKT1進行的分子對接顯示，大黃酸能夠與AKT1蛋白443位的THR形成良好的氫鍵結合位點（圖3b）。龍膽堿與AKT1蛋白153位的LEU和438位的PHE也具有良好的氫鍵結合位點（圖3c）。槲皮素與AKT1蛋白54位的ASN、271位的VAL和291位的THR形成良好的氫鍵結合位點（圖3d）。木犀草素與PTGS2蛋白229位的ASP、235位的GLY和333位的ARG具有優良的氫鍵結合位點（圖3e）。結果顯示，抗纖苗靈方可能通過槲皮素、木犀草素、龍膽堿和大黃酸等主要活性成分調控AKT1和PTGS2相關信號通路，從而抑制炎癥和細胞增殖，促進細胞內膠原纖維的降解，改善肝纖維化。

2.5抗纖苗靈方對肝纖維化大鼠血清肝功能指標的影響

大鼠血清中ALT、AST和TBIL的水平是肝臟功能損傷的重要指標。我們構建了大鼠肝纖維化模型，并通過藥物處理進行試驗。與正常組相比，模型組大鼠血清中ALT、AST和TBIL水平顯著升高（ Plt;0.01 Plt;0.05 ）。與模型組相比，抗纖苗靈方各劑量組和陽性對照組大鼠血清中ALT、AST和TBIL的表達水平明顯降低（ Plt;0.01 ， Plt;0.05 ，圖4a＼～4c），結果提示，抗纖苗靈方對TAA誘導的肝纖維化大鼠的肝功能損傷具有保護作用。

2.6抗纖苗靈方對肝纖維化大鼠肝組織病理學變化的影響

通過HE染色檢測各組大鼠肝臟組織的病理學變化。正常組大鼠的肝臟細胞排列整齊，肝組織形態正常；而模型組大鼠肝組織結構嚴重破壞，假小葉增多，肝血竇壓縮變形，肝細胞大小不均，部分出現鈣化，伴隨大量炎性浸潤及明顯的藍染纖維索，提示有大量膠原纖維沉積（ Plt;0.01 ）。與模型組相比，抗纖苗靈方中、高劑量組及陽性組大鼠肝組織細胞形態異常的情況有所改善，假小葉結構顯著減少，炎性浸潤區域減少，藍染纖維組織的沉積減輕，纖維條索數量減少（ Plt;0.01 Plt;0.05 ，圖4d＼～4i）。

2.7抗纖苗靈方對肝纖維化大鼠血清炎性因子TNF- a 、IL-6和IL-1β水平的影響

血清炎性因子水平反映了組織損傷的程度，通過檢測各組大鼠的血清炎性因子水平可以得出這樣的結論（圖5）。與正常組相比，模型組大鼠的血清炎性因子IL-6、TNF- ??a 和 IL-1β 水平顯著升高中 Plt;0.01 Plt;0.05） 。與模型組相比，抗纖苗靈方各劑量組和陽性對照組大鼠的血清IL-6、TNF- 和IL-1β表達水平降低（ Plt;0.05 Plt;0.01 ）。這些結果提示，抗纖苗靈方可以有效抑制TAA誘導的肝纖維化大鼠血清炎性因子的表達水平，從而減輕肝纖維化大鼠的炎癥反應。

2.8各組大鼠肝組織 、PIK3CA、AKT1 和TGF- _?{β1 的mRNA表達情況檢測

通過檢測PI3K/AkT信號通路中關鍵蛋白PIK3CA和AKT1的mRNA表達水平，結果顯示：與正常組相比，模型組大鼠肝組織中 （a-SMA 、PIK3CA、AKT1和TGF- ?β1 的mRNA表達水平顯著升高（ Plt;0.01 ）；與模型組相比，抗纖苗靈方低劑量組大鼠肝組織中 a-SMA 、PIK3CA、AKT1和TGF- ?{β} 的mRNA表達無明顯變化 （Pgt;0.05） 。而抗纖苗靈方中、高劑量組及秋水仙堿組大鼠肝組織中a -SMA、PIK3CA、AKT1和TGF _?{β1 的mRNA表達水平均降低（ Plt;0.05 Plt;0.01 ），見圖 6 這些結果提示，抗纖苗靈方能夠降低膠原纖維 a -SMA的表達水平，同時降低PIK3CA和AKT1的表達水平，從而抑制肝星狀細胞的增殖，進而改善大鼠肝纖維化。

3 討論

肝纖維化是慢性肝炎發展為肝硬化甚至肝癌的關鍵過程。現代醫學尚未有明確治療肝纖維化的藥物，而中藥方劑在治療肝纖維化方面具有突出優勢。肝纖維化屬于中醫“肋痛”“積聚”和“肝著”的范疇，其中肝脾受損、邪實內結符合肝硬化轉變為肝癌的癌前病變類型[10]。抗纖苗靈方由連錢草、茵陳、梔子、龍膽和大黃等中藥材組成。方中連錢

（a）活性成分與靶點分子對接結果；（b）AKT1與大黃酸分子對接可視化圖；（c）AKT1與龍膽堿分子對接可視化圖；（d）AKT1與槲皮素分于 對接可視化圖；（e）PTGS2與木犀草素分子對接可視化圖。

（a）Dockingesultsetwcipotsdargemolees;（b）oleladcvisalatiofni;（colaog visualizationofei;（d）leuladingsalfuei;（e）lecialattel withPTGS2.

（a）各組大鼠血清中ALT活性水平；（b）各組大鼠血清中AST活性水平；（c）各組大鼠血清中TBIL含量；（d）正常對照組大鼠肝臟HE染色；（e）模型組大鼠肝臟HE染色；（f）抗纖苗靈方低劑量組大鼠肝臟HE染色； Π（g） 抗纖苗靈方中劑量組大鼠肝臟HE染色；（h）抗纖苗靈方高劑量組大鼠肝臟HE染色；（i）秋水仙堿組大鼠肝臟HE染色。A代表正常組，B代表模型組，C＼～E代表抗纖苗靈方低、中、高劑量組，F代表秋水仙堿組。 ^##Plt;0.01 ，與正常組比較差異顯著； ^*Plt;0.01 ^*Plt;0.05 ，與模型組比較差異顯著。

（a）LevelsofAactiviintheseuofratsfromeachgoup;（b）LevelsofAactivityinteseruofratsfoeachoup;（c）Levelsf intheeruofatfoachoup;（dHEtaiigflivetisuefroatstoalotloup;（e）HEsaiigofliversefroat inthemodelgop;（fHEaigolessatsinedoagi-lnfougoupHaioleso ratsinthedoeailagop;Egfefroatseaiaola group;（i）HEstaingoflverissatsinoliegop.GoupAepresetsthoalotrolopoupBepeststeodel groupgroupsCtottedigosagousfiletielydo the colchicine group. ^##Plt;0.01 indicates a significant diffrence compared to the normal group; ^**Plt;0.01 ?_Plt;0.05 indicate significant differences compared to the model group.

草具有利濕通淋、清熱解毒和散瘀消腫的作用；大黃則能夠瀉熱通腸、涼血解毒、逐瘀通經，這兩者共為君藥[]。茵陳具有清熱利濕的作用，而梔子和龍膽則均可保肝利膽[12]。諸藥配伍共具保肝利膽、散瘀消積的功效。TAA是一種間接肝毒素，能夠導致實質細胞壞死，其通過微粒體CYP2E1代謝活化為硫代乙酰胺-S-氧化物，然后轉化為硫代乙酰胺-S-二氧化物。這是一種高度反應性的代謝產物，其反

（a）各組大鼠血清中TNF-a含量；（b）各組大鼠血清中IL-6含量；（c）各組大鼠血清中IL-1β含量；（d）正常對照組大鼠肝臟Masson染色；

（e）模型組大鼠肝臟Masson染色；（f）抗纖苗靈方低劑量組大鼠肝臟Masson染色； （g） 抗纖苗靈方中劑量組大鼠肝臟Masson染色；（h）抗纖

苗靈方高劑量組大鼠肝臟Massn染色；（i）秋水仙堿組大鼠肝臟Masson染色。A代表正常組，B代表模型組，C＼～E代表抗纖苗靈方低、中、 高劑量組，F代表秋水仙堿組，標尺 。 ^##Plt;0.01 ，與正常組比較差異顯著； ^*Plt;0.01 ?_Plt;0.05 ，與模型組比較差異顯著。

（a） Levels of TNF- intheserumofrats from eachgroup;（b）LevelsofIL-6intheserumofrats fromeach group;（c）LevelsofIL-1β intheserumof

ratsfromechpdss’sgofsrtsialop（ess’sof tissuefromatsiodelgop;（faso’srchoesaingolverefroatstoseagin-ia-llagop;

（g）Mason’soesagfvesatsindosea-inflagrop;osoeagf

livertissroatsiaialago;s’sgofatsi

group.GrouptsaoptseooCprtoe

groupsof the kang-xian-miao-ling formula，respectively，and groupFrepresents thecolchicine group，bar ?50μm = ^##Plt;0.01 indicatesa significant difference compared to the normal group; ^**Plt;0.01 ^*Plt;0.05 indicate significant diferences compared to the model group.

（a）各組大鼠肝組織 a SMA的mRNA表達水平；（b）各組大鼠肝組織TGF-β1的mRNA表達水平；（c）各組大鼠肝組織PIK3CA的mRNA表達水平；（d）各組大鼠肝組織AKT1的mRNA表達水平。A代表正常組，B代表模型組，C＼～E代表抗纖苗靈方低、中、高劑量組，F代表秋水仁堿組。 ^##Plt;0.01 ，與正常組比較差異顯著； ^*Plt;0.01 ^*Plt;0.05 ，與模型組比較差異顯著。

（a） mRNA expression levels of a -SMAin livertissueofrats fromeach group;（b）mRNAexpressionlevelsofTGF-β1in livertissueofrats from each group;（c）mexpessolsofinliveisseoftfachgp;（dexpessolsiiveoats fromeachgroup.GouepresntsteoalontoloupopBepesentsteodelgoupoupsCtoEepresnthldd high dosage groups of the kang-xian-miao-ling formula，respectively，and group Frepresents the colchicine group. ^##Plt;0.01 indicates a significant difference compared to the normal group; ^**Plt;0.01 ^*Plt;0.05 indicate significant diferences compared to the model group.

應性代謝產物可以與蛋白質和脂質共價結合，導致氧化應激和小葉中心壞死[13]。因此，TAA構建的大鼠肝纖維化模型具有明顯優勢。為進一步探究抗纖苗靈方抗肝纖維化的作用機制，本研究通過腹腔注射TAA建立肝纖維化大鼠模型。結果顯示，模型組大鼠肝組織出現明顯纖維化和炎癥反應，肝組織的假小葉結構和藍染纖維結構增加，血清ALT、AST和TBIL水平升高。而抗纖苗靈方組則能改善以上指標，表明抗纖苗靈方具有抗大鼠肝纖維化的作用。

血清炎性因子的水平反映了組織損傷的程度。TNF- ??a 、IL-6和IL-1β等炎癥因子是肝纖維化發生與發展過程中的關鍵促炎因子[14]。研究表明，肝星狀細胞（hepaticstellatecell，HSC）能夠被TNF- σ?a 激活，活化的HSC會進一步產生炎癥因子，并分泌 a -SMA等纖維化標志物，最終導致肝臟中ECM沉積的增加。因此，抑制炎癥因子的表達以及HSC的活化是逆轉肝纖維化的關鍵[15]。本研究結果顯示，抗纖苗靈方能夠降低TAA誘導的肝纖維化大鼠血清中TNF- ??a 、IL-6和IL-1β的表達水平，從而通過抑制炎癥因子的產生來改善大鼠的肝纖維化進程。此外，a -SMA是HSC活化的標志。當肝細胞受到損傷時，炎癥因子會激活HSC，活化的HSC通過分泌大量的a -SMA來增加ECM的沉積。因此， α_u-SMA 不僅是HSC活化的標志，也是肝纖維化逆轉中的重要標志物[16]。本研究結果表明，抗纖苗靈方干預后，肝纖維化大鼠的肝臟膠原沉積和炎癥因子減少，肝功能指標及 a -SMA表達降低。這表明抗纖苗靈方可能通過抑制HSC活化，降低 a -SMA的表達，從而減少肝組織中膠原的沉積。

為探究抗纖苗靈方防治肝纖維化的作用機制，本研究采用網絡藥理學方法預測其改善肝纖維化的作用靶點及潛在信號通路。GO功能富集結果表明，抗纖苗靈方的抗肝纖維化作用機制與RNA聚合酶II正調控轉錄、調亡過程的負向調控、轉錄的正調控及炎癥反應等過程密切相關。KEGG信號通路富集結果顯示，抗纖苗靈方通過多種途徑在肝纖維化治療中發揮作用。值得注意的是，單個成分可能調控多個途徑，如主要有效成分中的槲皮素等活性成分可能作用于PI3K/Akt信號通路和MAPK信號通路等。分子對接結果表明，排名前4的核心成分與靶點的對接情況良好，能夠自由結合。從成分角度分析，槲皮素和木犀草素與大部分結合能較低。從靶點角度分析，AKT1、TP53、TNF、HIF1A與大多數成分的結合能也較低。槲皮素通過抑制NF-kB/TLR/NLRP3途徑，抑制肝臟炎癥，它還降低由PI3K/Nrf2介導的氧化應激，并抑制自噬中mTOR的激活，進而抑制與肝病發展相關的凋亡因子的表達[17]。木犀草素通過抑制AKT/mTOR/p70S6K和TGF-β1/Smad信號通路，減少肝星狀細胞的增殖及膠原蛋白的合成，發揮抗纖維化作用[8]。龍膽堿通過激活TGF-β1介導的PI3K/Akt信號通路，減輕四氯化碳誘導的肝纖維化[19]。大黃酸通過抑制TGF-β1/Smad信號通路，減少肝星狀細胞產生的細胞外基質，抑制肝纖維化的發展[20]。由此可見，抗纖苗靈方可能通過槲皮素、木犀草素、龍膽堿和大黃酸等化合物作用于AKT1、TP53、TNF、HIF1A和PTGS2等靶點，進而通過PI3K/Akt、MAPK、TNF等信號通路發揮抗炎、抗腫瘤和抗肝纖維化等作用。

PI3K/Akt通路是細胞內重要的信號傳導通路，參與調控細胞增殖、存活、代謝和遷移等多種生理過程[21]。PI3K由調節亞基p85和催化亞基p110構成，形成異二聚體，具備磷脂酰肌醇激酶和絲/蘇氨酸激酶的雙重活性。AKT1是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶之一，也是PI3K下游的重要靶基酶[22]。PI3K/Akt信號通路在肝纖維化中扮演著關鍵角色，通過影響HSC的活化狀態，進而調控ECM的沉積與降解[23]。AKT1可以通過磷酸化多種底物，如參與mTOR信號通路，調節細胞生長和蛋白質合成，進而影響細胞外基質的合成和降解相關酶的表達[24]。AKT1是細胞存活的主要調節因子，可以通過直接抑制促凋亡蛋白或抑制由轉錄因子引發的促凋亡信號來實現調節。在肝纖維化中，PI3K-Akt信號通路的激活可增強肝細胞和HSC的存活，抑制其凋亡，從而影響肝纖維化的進程[25]。因此，PI3K/Akt信號通路被認為是開發抗肝纖維化治療策略的潛在靶點。通過阻斷該信號通路，可能有助于減緩甚至逆轉肝纖維化的進程。網絡藥理學分析表明，抗纖苗靈方對PI3K/Akt信號通路具有調節作用。抗纖苗靈方抗肝纖維化潛在作用靶點的蛋白相互作用研究發現，度值排名靠前的靶點包括AKT1、TP53、TNF、HIF1A和PTGS2。研究結果顯示，在TAA誘導的大鼠肝纖維化模型和肝硬化患者中，AKT1的表達水平上調。抑制AKT1可以降低原代肝星狀上皮細胞中 a -SMA的表達，同時也能抑制TGF-β1的表達。這些發現表明，AKT1在肝臟纖維化中發揮著重要作用，抑制AKT1的過度表達可以在一定程度上阻止肝纖維化進程[26]。本研究發現，肝纖維化大鼠肝組織中PIK3CA、AKT1和TGF-β1的mRNA表達水平均顯著升高。高劑量抗纖苗靈方處理組的大鼠肝組織中PIK3CA、AKT1和TGF-β1的mRNA表達則顯著降低。上述結果與網絡藥理學研究所預測的靶點相吻合，表明抗纖苗靈方抗大鼠肝纖維化可能與下調PI3K/Akt信號通路相關。

綜上所述，本研究基于網絡藥理學及動物試驗證明，抗纖苗靈方中的多種主要活性成分可能通過抑制肝纖維化的炎癥反應，減少纖維蛋白膠原表達，調控PI3K-Akt與TNF等信號通路，發揮抗肝纖維化的作用。本研究為抗纖苗靈方通過多通路、多靶點抗肝纖維化提供了客觀依據。然而，肝纖維化的機制及中藥活性成分的作用較為復雜，研究仍存在不足之處，尤其是缺乏體外細胞試驗和分子機制的驗證。課題組后續將通過體外試驗深人研究抗纖苗靈方抗肝纖維化的機制，以期為抗纖苗靈方的臨床應用及中醫藥的開發利用提供新的方向。

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