基于網絡藥理學和分子對接探討穿心蓮改善心肌缺血再灌注損傷的潛在作用機制

摘要目的：運用網絡藥理學和分子對接技術探討穿心蓮改善心肌缺血再灌注損傷（MIRI）的潛在作用靶點及機制。方法：應用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）篩選出穿心蓮的有效成分和作用靶點，采用UniPort數據庫注釋靶點基因；利用人類基因數據庫（GeneCards）、DisGeNET、治療靶點數據庫（TTD）、在線人類孟德爾遺傳數據庫（OMIM）獲得MIRI的靶點;運用Venn在線軟件獲取穿心蓮與MIRI的共同靶點基因，并以Venn圖展示；采用CytosCape3.9.1軟件構建“藥物-藥物有效成分-靶點”可視化網絡圖；應用注釋、可視化和綜合發現數據庫（DAVID）對交集靶點進行基因本體（GO）及京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析；通過STRING數據庫將交集靶點進行蛋白-蛋白相互作用（PPI）分析，利用Cytoscape3.9.1軟件Cytohubba插件對PPI網絡進行分析，獲取關鍵靶點。通過AutoDockTools1.5.7軟件與PyMol2.5.0對篩選后的6個關鍵靶點蛋白受體和藥物活性成分配體進行分子對接驗證。結果：篩選得到穿心蓮的36個有效活性成分和172個靶點基因，MIRI相關靶點基因1466個，49個藥物與疾病交集靶點；獲得關鍵核心靶點有α-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT1）、腫瘤壞死因子（TNF）、白細胞介素-6（IL6）、半胱天冬氨酸蛋白酶-3（CASP3）、一氧化氮合酶（NOS3）、細胞腫瘤抗原p53（TP53），其主要參與一氧化氮生物合成、脂多糖介導的信號傳導、凋亡、基因表達、炎癥反應等生物學過程；KEGG通路富集分析顯示主要作用機制可能與脂質和動脈粥樣硬化、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）-蛋白激酶B（AKT）信號通路、糖尿病并發癥中的晚期糖基化終末產物（AGE）-晚期糖基化終末產物受體（RAGE）信號通路、EB病毒感染和白細胞介素（IL）-17信號通路等有關。結論：穿心蓮對MIRI的干預作用具有多成分、多靶點、多通路、多環節的調控特點，其調控靶點可能主要涉及AKT1、TNF、IL6、CASP3、NOS3和TP53等；其調控的通路可能涉及氧化應激和炎癥相關信號通路、細胞生存和凋亡相關信號通路等，這為后續深入探討穿心蓮改善MIRI的潛在分子作用機制奠定了基礎。

AbstractObjectivehepotentiatargetsandmechanismsofandrographispaniculatainimprovingmyocardialishemieperfusioninjuy （MIRI）wereexploredbynetworkpharmacologyandmolecularlinkagetechniques.Methods：Theactiveingredientsandtargetsitesof andrographispaniculatawerescreenedoutusingthePharmacologyDatabaseandAnalysisPlatformforTradionalChineseMedicine System（TCMSP）.Thetarget genes wereannotatedusingthe UniPortdatabase.Thetargetsof MIRlwereobtainedbythe HumanGene Database（GeneCards），iseNET，herapeuticTrgetatabase（TD），andtheOnlineHumanendelianGeneticDatabase（O）.e commontargetgenesofandrographispaniculataandMIRlwereobtainedbytheVennonlinesoftwareandpresentedasVennplots.The visualizationnetworkdiagramofdrugdrugactiveingredientargetwasonstructedbyusingCytosape3.9.1softare.TeAotation， VisuaizationandComprehensiveDiscoveryDatabase（DAVID）wasapliedtoconductgeneontology（GO）classicationenrichment analysisandKyotoEncyclopediaofGenesandGenomes（KEGG）pathwayenrichmentanalysisontheintersectiontargets.Protein interaction（PPl）analysisofthintersectiontargetswasconductedtroughtheSTIGdatabase，andthePlnetworkwasanalyzed usingtheCytoubbapluginofCytosape3.9.1softaretoobtainthekeytargets.Themoleculardockingverficationofthesreeedsix keytargetproteinreceptorsanddrugactivedistributorswasconductedthroughAutoockTools1.5.7softwareandPyMol2.5esults： Thirtysixeftiectimpontsdrgtgesofdgasicataeeddg166atedat genesand49druganddiseaseintersectiontargets.ThekeycoretargetswerebtainedincludingAKT1，F，IL6，CASP3，N，and TP53，whichweremainlyinvolvedinbologicalproessessuchasnitricoxidebiosynthesis，lipopolysaccharide-mediatedsignal transduction，apoptosis，geneexpresionandinflammatoryresponse.KEGGpathwayenrichmentanalysisrevealedthatthemain mechanismsofactionrelatedtolipidsandatherosclerosis，thephosphatidylinositol3-kinasePl3K）proteinkinaseB（AKT）signaling pathway，theadvancedglycationendproduct（AGE）advancedglycationendproductreceptor（RAGE）signalingpathwayindiabetic coplicatiit paniculataonMiRlshows theregulatory characteristics of multiple components，multiple targets，multiple pathwaysand multiple links.Its regulatorytargetsmainlyinvolves L6，CASP3，NOS3，and TP53，etc.Its regulates pathwaysmay involves oxidative stressand inflammation-relatedsignaling pathwa survival andapoptosis-related signalingpathways，etc.Thiswillprovide foundation for the subsequentin-depth explorationof the potentialmolecularmechanism relatedandrographis paniculata improving MIRl.

Keywordsmyocardialischemia/reperfusioninjuryandrographispaniculata;networkphamacolgymacromoleculardcking；mcani

急性心肌梗死（acutemyocardial infarction，AMI）是一種危及生命的心血管疾病。自2002年以來，我國AMI死亡率總體呈現上升態勢，且自2012年開始農村地區AMI死亡率明顯升高，2020年城市地區AMI死亡率為60.29/10萬，農村地區AMI死亡率為78.65/10萬。AMI伴心肌缺血再灌注損傷（myocardialischemiareperfusioninjury，MIRI）進一步加重心臟功能的障礙，增加了AMI的不良預后。MIRI的發生機制尚未完全闡明，主要涉及多種病理生理因素，如氧化應激、心肌細胞凋亡、鈣超載、內皮功能障礙、線粒體功能障礙、炎癥反應等[23]。即使目前已對MIRI機制的理解有了較大進展，但臨床防治效果仍不容樂觀。因此，探索其分子機制以尋求減輕或避免MIRI的策略或將成為新的挑戰。近年來，傳統中藥（traditional Chinese medicine，TCM）在改善MIRI方面取得了一定的進展[46]。TCM區別于西藥，具有多靶點、多通路、多環節和整體觀念的治療優勢。穿心蓮，作為一種重要的草本植物，廣泛應用于中國、印度以及多個東南亞國家的傳統醫學中。研究表明，穿心蓮具有抗炎性反應、抗氧化、降血脂、降血糖、保肝、保腎、抗瘧疾、抗過敏和保護心血管系統等藥理作用[78]。研究發現，穿心蓮在治療MIRI方面可能具有一定的保護作用9，但更深入的分子機制研究甚少。網絡藥理學是從整體性和系統性方面對藥物、疾病之間相互關系進行全面分析的一門新興學科。本研究擬在網絡藥理學基礎上采用分子對接技術，進一步探討穿心蓮在抗MIRI方面的具體分子作用機制，以期為后續的進一步研究提供新思路。

1資料與方法

1.1藥物有效成分及其靶點獲取

本研究利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems PharmacologyDatabase andAnalysisPlatform，TCMSP，https：//tcmsp-e.com/tcmsp.php）檢索“穿心蓮\"以收集該草本藥的相關信息，限定口服利用度（ .OB）≥30% 和類藥性（DL）≥18% 篩選有效成分并通過TCMSP數據庫獲得相應化合物對應的靶點[10]。滿足篩選條件但是未能在TCMSP數據庫獲得相應作用靶點的化合物，搜索其CAS號并輸入PubChem數 據庫[1]（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）以 獲取其CanonicalSMILES 號。通過 Swiss Target Prediction平臺[12]（http：//www.swisstargetprediction.ch），物種選擇為“Homosapiens”，將預測出的靶點取Probability gt;0 作為補充。此外，在此基礎上使用中醫百科全書（The EncyclopediaofTraditional ChineseMedicine，ETCM，http：//www.tcmip.cn/ETCM/）數據庫[13]以及相關文獻進行再次補充，取評分 0.490.67 為Good的成分，最后僅保留可靠性分值 gt; 0.8的靶標。應用UniPort數據庫[14]（https：//www.uniprot.org），以物種為人類且為已驗證的基因作為篩選條件，對預測的藥物靶點名稱進行校正，統一為GeneSymbol。

1.2疾病靶點收集

以“myocardial ischemiareperfusion injury”為檢索詞，通過人類基因數據庫[15]（GeneCards，https：/www.genecards.org/）和在線人類孟德爾遺傳數據庫[16]（OMIM，https：//www.omim.org/）進行檢索，其中GeneCards數據庫所得數據以Relevancescore ≥8 為篩選條件。同時以“myocardial reperfusion injury\"為檢索詞，采用DisGeNET數據庫[17]（https：//www.disgenet.org/）、治療靶點數據庫[18]（TTD，http：//db.idrblab.net/ttd/）進行補充檢索，其中DisGeNET數據庫所得數據以Score_gda ?0.5 為篩選條件。上述結果匯總后刪除重復項，獲得MIRI的基因靶點。

1.3篩選疾病相關靶點及繪制Venn圖

將穿心蓮和MIRI相關靶點數據集，利用Venn在線軟件繪制韋恩圖，確定穿心蓮和MIRI的交集靶點作為穿心蓮抗MIRI的可能潛在靶點。

1.4藥物-有效成分-靶點網絡圖構建

將藥物、有效成分和靶點導人Cytoscape3.9.1[19]中構建“藥物-有效成分-靶點\"可視化處理獲得初步網絡圖，運用NetworkAnalyzer工具，計算各個節點的連接度（Degree）值。其中，節點代表著藥物、化合物或靶點，節點之間的連接代表其存在相互作用，節點的Degree值代表節點之間相連的數目。

1.5蛋白-蛋白相互作用（PPI）網絡圖構建

將獲取的交集靶點輸人STRING數據庫[20]（https：//cn.string-db.org/），篩選條件為物種“Homosapiens”，最低相互作用得分 ?0.4 ，去除在網絡中斷開的節點；以TSV格式導出相應結果，將文件導入Cytoscape3.9.1，構建PPI網絡。設置節點的大小、顏色與Degree值成正比。運用Cytohubba插件對PPI網絡進行篩選分析，分別以最大團中心性（MCC）、緊密中心性（Closeness）、度（Degree）值、中介中心性（Betweenness）應力中心性（Stress）計算前20個核心基因，再次利用Venn在線軟件取其交集，獲取關鍵靶點。鑒于在Cytohubba中指標MCC的可信度更好[21]，因此將獲得的關鍵靶點按照MCC降序排列，最終選取出相互關系最密切的靶點作為穿心蓮抗MIRI的潛在核心關鍵靶點。

1.6基因本體（gene ontology，GO）、京都基因與基因組百科 全 書（kyoto encyclopedia ofgenesandgenomes，KEGG）富集分析

通過運用注釋、可視化和綜合發現數據庫（DAVID，https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）[22]和微生信可視化平臺（https：//www.bioinformatics.com.cn），本研究對穿心蓮和MIRI的共同靶點進行GO和KEGG富集分析。利用DAVID平臺，導入穿心蓮與MIRI的共同靶點，并進行相應參數設置，即Thresholds設定為Count：3，EASE：0.05為篩選條件，分別將GO生物過程（biologicalprocesses，BP）細胞組成（cellularcomponents，CC）、分子功能（molecularfunctions，MF）和KEGG通路進行富集分析。利用微生信網站，選取 Plt;0.05 的條目分別制作GO三合一柱狀圖和KEGG富集氣泡圖，探討穿心蓮抗MIRI相關生物學過程和關鍵信號通路。

1.7靶標-通路網絡構建

在KEGG的基礎上，通過使用Cytoscape3.9.1構建PPI網絡，并根據Degree值進行排序，找出富集在上述通路上的穿心蓮改善MIRI的潛在的關鍵靶點，最終構建“靶標-通路”多維網絡關系圖。

1.8分子對接驗證

經有機小分子生物活性數據庫[11]（PubChem，https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）搜索關鍵靶點對應的有效成分并下載其sdf格式的三維結構，使用Chem3D20.0軟件將sdf格式處理后轉化為mol2格式文件，同時應用蛋白質結構數據庫[23]（PDB，http：//www.rcsb.org）搜索關鍵靶點并下載其三維結構。通過PyMOL2.5.0和AutoDockTools1.5.7軟件對受體和配體進行相應處理，輸出pdbqt格式，借助AutoDockVina對受體和配體進行分子對接[24]。將分子對接數據導入PyMOL2.5.0軟件進行可視化展示。

2結果

2.1藥物活性成分及其靶點的篩選

通過TCMSP數據庫和ETCM數據庫收集到36個 藥物活性成分。獲取相應化合物對應的靶點，匯總后 去除重復值，穿心蓮有效活性成分對應靶點基因共計 172個。詳見表1。

2.2穿心蓮活性成分與MIRI交集基因的分析 2.4PPI網絡構建及關鍵靶點的選取

通過GeneCards、OMIM、DisGeNET和TTD數據庫得到MIRI靶點基因1466個。將172個藥物靶點與1466個疾病靶點取交集得到交集靶點49個，即穿心蓮抗MIRI的潛在靶點。詳見圖1。

2.3“藥物-有效成分-靶點\"網絡

通過Cytoscape3.9.1軟件，構建穿心蓮抗MIRI的藥物-有效成分-靶點網絡圖。該網絡包括209個節點（其中菱形代表的是穿心蓮藥物，周圍正方形代表的是藥物有效成分PubChemCID，外圍圓形代表基因靶點），572條邊，根據各個節點的Degree值，排序后發現穿心蓮中最主要的10個活性化合物依次為：panicolin、1-monoolein、wogonin、mono-O-methylwightin、14-deoxy-11-oxoandrographolide、oroxylina、deoxycamptothecine、14-deoxyandrographolide、andrographidineF_qt、carvacrol。詳見圖2。

將獲取的交集靶點導人STRING數據庫進行PPI網絡分析，保存STRING數據庫生成的PPI網絡圖以及每條邊代表蛋白質和蛋白質之間的相互作用（見圖3）。將輸出的TSV格式文件導入Cytoscape3.9.1軟件，構建PPI網絡圖，詳見圖4，用于后續核心靶點的篩選。網絡中顯示表明連線越多，關聯度越強，PPI網絡中交集靶點的排名越靠前。結果發現，PPI網絡中包含49個節點 .1002 條邊。利用Cytohubba插件對PPI網絡圖進行分析，分別設置MCC、Closeness、Degree值、Betweenness和Stress（見表2），計算前20個核心基因并繪制韋恩圖（見圖5），得到15個關鍵靶點，按照MCC降序排列（見表3），依次為 α -絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT1）、腫瘤壞死因子（TNF）、白細胞介素-6（IL6）、雌激素受體（ESR1）、前列腺素G/H合成酶2（PTGS2）、纖維連接蛋白（FN1）、熱休克蛋白 90-α （HSP90AA1）半胱天冬氨酸蛋白酶-3（CASP3）、一氧化氮合酶（NOS3）、清蛋白（ALB）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG）細胞腫瘤抗原p53（TP53）、白細胞介素-1β（IL1B）、絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）G1/S特異性細胞周期蛋白-D1（CCND1）。在PPI網絡中將15個關鍵靶點創建子集以構建PPI核心網絡（見圖6），該網絡中有15個節點、105條邊。按照最大團中心性降序從紅到黃漸變。顏色越紅，意味著其在最大團中心性中排名越靠前。排名最前的為AKT1，排名最末為CCND1。

2.5 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析

將49個穿心蓮活性成分與MIRI的交集靶點導入DAVID數據庫中，獲得GO功能分析及KEGG通路分析結果。

GO-BP富集分析顯示其可能通過調控以下生物過程，包括正向調控一氧化氮生物合成過程（positiveregulationofnitricoxidebiosyntheticprocess）、脂多糖介導的信號傳導途徑（lipopolysaccharide-mediatedsignalingpathway）、凋亡過程的正向調控（positiveregulationofapoptoticprocess）、凋亡過程的負向調控（negativeregulationofapoptoticprocess）、基因表達的負向調控（negative regulation of gene expression）、炎癥反應（inflammatoryresponse）、血管生成（angiogenesis）、蛋白激酶B信號傳導（proteinkinaseBsignaling）、蛋白激酶B信號傳導的正向調控（positiveregulationofproteinkinaseBsignaling）、自噬的負向調控（negative regulationof autophagy）。

GO-CC富集分析顯示其主要參與以下細胞組分的構成，包括巨大分子復合物（macromolecularcomplex）、線粒體（mitochondrion）、細胞溶質（cytosol）、細胞質（cytoplasm）、內質網（endoplasmicreticulum）、細胞核（nucleus）、細胞核周圍區域（perinuclearregionofcytoplasm）、內質網腔（endoplasmicreticulumlumen）、胞外區域（extracellularregion）、細胞核質（nucleoplasm）。

GO-MF富集分析顯示其分子功能主要包括酶結合（enzymebinding）、相同蛋白質結合（identicalproteinbinding）、蛋白激酶結合（proteinkinasebinding）、泛素蛋白連接酶結合（ubiquitinprotein ligasebinding）、蛋白酶結合（proteasebinding）、RNA聚合酶I轉錄因子活性、通過配體激活的序列特異性DNA結合（RNApolymeraseItranscriptionfactor activity，ligand-activatedsequence-specificDNAbinding）、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性（proteinserine/threonine/tyrosinekinaseactivity）、蛋白激酶活性（proteinkinaseactivity）、蛋白質結合（proteinbinding）、類固醇結合（steroidbinding）。詳見圖7。

KEGG通路富集分析（見圖8）顯示其可能通過參與脂質和動脈粥樣硬化（lipidandatherosclerosis）、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）-蛋白激酶B（AKT）信號通路（PI3K-AKTsignalingpathway）、糖尿病并發癥中的晚期糖基化終末產物（AGE）-晚期糖基化終末產物受體（RAGE）信號通路（AGE-RAGE signalingpathway indiabeticcomplications）、EB病毒感染（epstein-barrvirusinfection）、白細胞介素（IL）-17信號通路（IL-17signalingpathway）、流體剪切應力與動脈粥樣硬化（fluidshearstressandatherosclerosis）、NOD樣受體信號通路（NOD-like receptor signaling pathway）、凋亡（apoptosis）、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路（TNFsignalingpathway）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路（MAPKsignalingpathway）、EGFR酪氨酸激酶抑制劑抵抗性（EGFRtyrosinekinaseinhibitorresistance）、p53信號通路（p53signalingpathway）、胰島素抵抗（insulinresistance）、低氧誘導因子1（HIF-1）信號通路（HIF-1signalingpathway）、血管內皮生長因子（VEGF）信號通路（VEGF signalingpathway）、Toll樣受體信號通路（TollHike receptor signaling pathway）、核因子-kB（NF- κκB ）信號通路（NFkappaBsignalingpathway）、Janus激酶（JAK）-信號轉導與轉錄激活子（STAT）信號通路（JAK-STATsignalingpathway）、趨化因子信號通路（chemokine signalingpathway）、血小板活化（plateletactivation）為主要調控作用途徑。

2.6靶標-通路網絡構建

基于KEGG通路富集分析結果，進一步對靶點-通路之間的關系進行可視化分析，構建靶標-通路網絡（見圖9）。其中Degree值較高的依次是AKT1、NFKB1、TNF、BCL2、IL6、MAPK14、IL1B、CASP3、NOS3、CXCL8等共35個，主要涉及脂質和動脈粥樣硬化、PI3K-AKT信號通路、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、EB病毒感染、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、IL-17信號通路、NOD樣受體信號通路、調亡、EGFR酪氨酸激酶抑制劑抵抗性、MAPK信號通路、TNF信號通路等20個信號通路。

2.7分子對接驗證結果分析

一般而言，配體分子與受體蛋白間結合能愈小則表示二者結合親和力愈強，結構也愈穩定。本研究將PPI核心網絡中排名前15位的靶點與靶點-通路之間構建的靶標-通路網絡圖中排名前15位的靶點取交集，獲得共同靶點6個進行分子對接，即通過對AKT1、TNF、IL6、CASP3、NOS3、TP53與及其相應的化合物進行分子對接。詳見表4。

2.7.1 活性成分與AKT1相互作用分析

wogonin、panicolin與AKT1對接結果表明，2種活性成分和AKT1均存在較強的結合作用，結合能力為panicolingt;wogonin。潛在的結合位點主要有THR-87、ARG-15、GLU-17和ARG-48。其中，panicolin可與氨基酸形成4個氫鍵，化合物與蛋白口袋結合能力相對較佳。詳見圖10。

2.7.2活性成分與TNF相互作用分析 14-deoxyandrographolide、dehydroandrographolide、wogonin、 14-deoxy-11-oxoandrographolide、 3-dehydrodeoxyandrographolide14-deoxy-15Hsopropylidene-11

與TNF對接結果表明，6種化合物和TNF均存在較好的結合作用，結合能力為Wogonin gt; 14-deoxy-15-Isopropylidene-11gt;3-dehydrodeoxyandrographolidegt;14-deoxyandrographolidegt;dehydroandrographolidegt;14-deoxy-11-oxoandrographolide。潛在的結合位點主要有GLN-47、ALN-46、ALA-145、ASN-92、GLN-149、PRO-139、GLY-24、LEU-142、PHE-144、TYR-141、SER-95 和 ASN-92。 其 中 wogonin、14-deoxy-11-oxoandrographolide與TNF受體形成氫鍵相對較多，說明該化合物與蛋白結合口袋結合相對較強。詳見圖11。

2.7.3 活性成分與IL6相互作用分析

wogonin、oroxylina、14-deoxy-11-oxoandrographolide、14-deoxyandrographolide、dehydroandrographolide與IL6對接結果表明，此5種活性成分與IL6均存在較好的結合作用，結合能力為wogoningt;oroxylinagt;dehydroandrographolidegt;14-deoxyandrographolidegt;14-deoxy-11-oxoandrographolide。潛在的結合位點主要有LYS-47、GLN-157、ARG-105、LEU-93、ASN-45、THR-139、ALA-59、LYS-67、SER-170、ASN-65、LEU-63、LEU-65。5種化合物均可與氨基酸形成至少2個氫鍵。其中wogonin與IL6受體的活性殘基形成4個氫鍵，說明該化合物與蛋白結合口袋結合相對較強。詳見圖12。

2.7.4活性成分與CASP3相互作用分析

wogonin、oroxylina與CASP3對接結果表明，2種穿心蓮有效成分和CASP3均存在較強的結合作用。潛在的結合位點主要有MET-61、ASN-208和ASP-45。wogonin和oroxylina分別與CASP3受體的活性殘基形成1個氫鍵和2個氫鍵。詳見圖13。

2.7.5 活性成分與NOS3相互作用分析

deoxycamptothecine、quercetintetramethyl ^{3′，4′，5，7）} ether與NOS3對接結果表明，2種活性成分和NOS3均存在較強的結合作用，結合能力為deoxycamptothecinegt;quercetin tetramethyl （3^′，4^′，5，7） ether。潛在的結合位點主要有TYR-475和TRP-178。2種穿心蓮活性成分均與氨基酸形成1個氫鍵。詳見圖14。

（A為wogonin與 IL6;B為oroxylina與 IL6;C為14-deoxy-11-oxoandrographolide與IL6; D為14-deoxyandrographolide與 IL6; E為dehydroandrographolide與 IL6）

[A為deoxycamptothecine與NOS3;B為quercetintetramethyl （3^′，4^′，5，7 Dether與NOS3]

2.7.6活性成分與TP53相互作用分析wogonin與TP53對接結果表明，wogonin和TP53

存在較強的結合作用，潛在的結合位點主要有ASN-345。

wogonin與氨基酸形成2個氫鍵。詳見圖15。

3討論

MIRI可降低AMI治療效果及加重脈管病變程度，也是引起惡性心律失常或心源性猝死及預后的重要因素。防治MIRI尚缺少有效的藥物和方法，AMI并發MIRI的死亡率依然較高[25]。穿心蓮是一種十分重要的中藥材。目前，僅有穿心蓮少部分活性成分報道對MIRI可能有抑制作用[9.26]，并且涉及分子機制甚少。

本研究綜合多數據庫資料，匯集了穿心蓮的有效成分、靶點及MIRI相關靶點。交集分析揭示了49個穿心蓮與MIRI共有靶點。在GO分析中，共同靶點主要涉及一氧化氮生物合成、脂多糖介導信號傳導、調亡、基因表達等關鍵生物學過程。在CC和MF方面，這些靶點在巨大分子復合物、線粒體、細胞質等方面以及酶結合和蛋白質結合活性方面表現出核心基因的富集。這些分析揭示，穿心蓮可能通過參與上述生物學過程和信號通路改善MIRI。KEGG分析識別了20個高度富集的信號通路，表明核心靶點基因的作用不局限于單一信號通路。例如，AKT1被發現參與脂質代謝、PI3K-AKT信號通路、AGE-RAGE信號通路等11種關鍵通路，這突顯了穿心蓮靶點不僅通過單一途徑作用于MIRI，而是通過多個信號通路的相互作用形成復雜的信號網絡，從而實現信號的級聯放大效應。

基于功能相關性將KEGG富集通路結果分為以下五大類：1）氧化應激和炎癥的信號通路，包括AGE-RAGE、TNF和MAPK等信號通路。AGE-RAGE的激活誘發氧化應激和炎癥，且與MIRI的發病機制密切相關[27]。TNF信號通路通過調節炎癥反應、細胞凋亡和氧化應激在MIRI中發揮核心作用[28]。MAPK信號通路調控細胞生長和炎癥反應，并在MIRI的調控中扮演關鍵角色，其中p38MAPK的抑制能增強抗氧化反應，改善 M||R|^[29] 。另有研究發現，穿心蓮活性成分穿心蓮內酯可改善MIRI，其機制可能與降低p38-MAPK，升高p-ERK1/2蛋白表達，進而增加心肌抗氧化能力相關[30]；此研究發現和本網絡藥理學研究發現一致。2）細胞生存和凋亡相關信號通路，如PI3K-AKT信號通路、調亡、P53信號通路等。PI3K-AKT信號通路在MIRI中起保護作用，通過抑制細胞凋亡和調控炎癥響應來維持心肌細胞的存活[31-32]。此外，PI3K-AKT還能調控p53等腫瘤抑制基因，進一步影響細胞凋亡過程[33]。3）血管和血小板相關信號通路，主要包括VEGF和趨化因子信號通路。VEGF通過促進內皮細胞的增殖和遷移，促進新血管生成，并與PI3K-AKT等信號通路相互作用[34]。趨化因子通過調節炎性細胞的遷移，對MIRI的恢復過程產生影響[35]。4）代謝和能量調節相關信號通路，如胰島素抵抗。胰島素抵抗可通過增加氧化應激和促進炎癥反應，并影響心肌細胞的保護途徑而導致MIRI的發病和嚴重程度增加[36]5）其他病理過程，如IL-17信號通路，通過促進心肌細胞凋亡、中性粒細胞浸潤和心肌重塑，從而加重MIRI的程度[37]。因此，本研究發現穿心蓮抗MIRI作用涉及多條信號通路，包括氧化應激、炎癥、細胞生存與凋亡等，顯示了其作用的復雜性與多維性。

為實現穿心蓮活性成分與這些靶點具有較高的結合活性，并且在相關信號通路上仍保持較高的富集，本研究經多次篩選而獲取靶標。將獲得49個藥物和疾病的共有靶點，利用Cytohubba插件設置參數，運用PPI網絡進行分析得到的15個關鍵靶點與靶點-通路之間構建的靶點-通路網絡圖中排名前15位的靶點取交集，最終得到6個關鍵核心靶點，以期作為穿心蓮抗MIRI的潛在的靶標。這6個潛在的靶點分別是AKT1、TNF、IL6、CASP3、NOS3、TP53。在心肌組織中，AKT1發揮調控心肌細胞活性和功能的重要作用。通過對下游因子的調控，AKT1不僅參與細胞增殖、凋亡和自噬等關鍵過程，而且在減輕MIRI中具有重要作用[38-39]。另一方面，AKT1通過調控下游的VEGF等因子，有益于血管生成，亦引起肌漿網 Ca²⁺ 通道開放明顯增加，這使MIRI中 Ca²⁺ 超載的狀態顯著減輕[35.40]。TNF、IL6是MIRI進程中關鍵的促炎因子，可誘導炎性細胞進入心肌缺血損傷區[5]。而促炎因子TNF、IL6血清含量的降低，顯著減輕了心肌細胞炎性反應的發生[41]。在TNF信號通路上，CASP3作為半胱天冬酶家族的重要成員，活化的CASP3進一步切割和激活其他蛋白質，引起細胞凋亡，并在細胞凋亡的進展中發揮重要作用[42]，而心肌細胞凋亡在MIRI病理過程中起重要作用，抑制半胱天冬酶家族的表達可以抑制細胞凋亡，進而減輕再灌注損傷[3]。NOS3主要分布在冠狀動脈血管和心腔面的內膜，研究發現，NOS3的過表達有益于改善 M∣R∣^[43] ，其機制可能與抑制氧化應激、炎癥反應和鈣超載有關。TP53，也稱為p53蛋白，是一種經典的腫瘤抑制基因。p53通過多種機制參與MIRI，主要涉及細胞凋亡，自噬，鐵死亡和氧化應激等[33]。本研究分析表明，穿心蓮可能通過調控AKT1、TNF、IL6、CASP3、NOS3和TP53改善MIRI。

在6個關鍵核心靶標的基礎上，對穿心蓮抗MIRI的有效成分進一步進行分子對接驗證。分子對接結果發現10個關鍵活性成分與AKT1、TNF、IL6、CASP3、NOS3、TP53對接結合能都 lt;-20.90kJ/mol ，活性成分均存在一定數量的氫鍵受體供體，這說明10個關鍵有效成分與以上相應關鍵靶點蛋白具有較好的結合活性，推測穿心蓮有效成分可能通過這些靶點發揮作用。

作為一門新興學科，網絡藥理學結合分子對接的研究，可能在中藥研究中實現優勢互補。然而本研究也存在一定的不足，主要體現在兩個方面：首先，本研究的相關靶點來自TCMSP、ETCM、GeneCards等數據庫。由于每個數據庫的側重點稍有不同，數據庫之間也存在一定的差異。因此，多個數據庫之間的聯合分析不排除可能存在一定的潛在風險。其次，本研究使用了分子對接技術進行驗證，這對網絡藥理分析結果的可靠性提供了一定程度的依據，但更進一步精確的驗證，仍需要基礎實驗來完成，這將是下一步研究的重點。

4小結

本研究基于網絡藥理學與分子對接技術，揭示了穿心蓮在抗MIRI過程中對一氧化氮生物合成、脂多糖介導信號傳導、調亡、基因表達等關鍵生物學過程的調控作用。研究發現，穿心蓮可能通過影響氧化應激和炎癥、細胞生存和凋亡等信號通路參與MIRI調控，顯示出復雜的信號網絡作用機制。這些信號通路與靶點基因的相互作用可能共同促進MIRI的防治效果。AKT1、TNF、IL6、CASP3、NOS3和TP53這6個關鍵靶點可能構成穿心蓮抗MIRI作用的核心。Wogonin、14-deoxy-11-oxoandrographolide、 oroxylinA、dehydroandrographolide和deoxycamptothecine等成分可能是穿心蓮抗MIRI主要活性物質，為進一步研究提供了新方向。

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（本文編輯鄒麗）