基于生物信息學分析膿毒癥心肌病差異基因及潛在治療中藥預測

AbstractObjective：Toexplrediferentialgenesinsepticcardomyopathyandpreictionpotetiltherapeutictraditioal medicinesbasedonbioinformatics.Methods：GSE79962chipdatawasdownloadedfromthegeneexpresiondatabase.elevant diferentialyexpressedgeneswerescreenedusingRlanguage，andthediferentiallyexpressedgeneswereanalyzedinthegene ontologyandKyotoEncyclopedia GenesandGenomesdatabases.proteininteractionnetworkwasconstructedthroughthe STRINGwebsite.coregenesthediferentiallexpressedgeneswereanalyzedusingCytoscapestwareanditspluginCytoHuba. coregenesweremutuallymappedwiththemedicalontologinformationretrievalplatform （CoremineMedical）toscreentherelevant traditionalCineedicfrtetreatmentesusAtotal7diftillexpresedgeseresreedoutiding 77up-regulatedgenesand160down-regulated genes.pathwayenrichmentmainlyincludedthetransforminggrowth factorTGF） -β signalingpathwaytheadvancedadvancedglycationendproductAGE）advancedgycationendproductreceptor（RAGE）signling pathwayindiabeticcomplications，etc.Tekeycoregenesscreenedmainlyincludesignaltransducerandactivatortranscrition3 （STAT3），MYC，signaltransductiomolecule3（D3），UNB，serpincadeEmember1（SERPINE1），osphoiostideiae regulatorysubuni）andCAancerndingproteideltaCEBD）elevantrapeuticaditioalCnedii mainlyincludedisengierinsnpaeoelctfloratulptmeric，ubarbpanaxgsngtc.Concusionaalyisf diferentialy expressdgenesandkeycoregenesintissudycouldpromoteteunderstandingthepathogenesisSCMandprovide potentialgenetargetsandresearchanddevelopmentideasforthedevelopmentnewdrugsintraditionalmedicineforthe treatment SCM.

Keywordsseptic cardiomyopathy; bioinformatics; differentially expressed genes; medicine

膿毒癥心肌病（sepsticcardiomyopathy，SCM）是膿毒癥中常見的并發癥之一，往往預示不良預后，顯著提高病人的死亡率1。現代醫學治療SCM以改善病人臨床癥狀、降低再住院率及死亡率為主，但其發病機制復雜，目前尚無特異性治療方法，整體療效欠佳，故進一步探討SCM的發病機制，挖掘潛在作用靶點，探索新的治療方法至關重要。近年來，隨著中醫藥現代化的發展，研究認識到中藥可減輕SCM病人的心肌損傷，改善心功能[2，但在用藥規律方面尚缺乏系統的了解。目前，生物信息學技術已被用于篩選多種心血管疾病潛在生物學標志及調控靶點，但對SCM的研究較少。因此，本研究利用生物信息學技術分析SCM的差異表達基因，進一步探討其可能的發病機制，預測潛在干預中藥，歸納用藥規律。

1資料與方法

1.1基因芯片數據的收集及差異基因的分析

設置關鍵詞為“sepsis-inducedcardiomyopathy”，于美國國家生物技術信息中心（NationalCenterforBiotechnologyInformation，NCBl）中的基因表達綜合（EeneExpressionOmnibus，GEO）數據庫進行檢索。納入芯片標準為：1）臨床SCM病人標本，排除細胞和動物實驗；2）芯片需含有正常及SCM組織標本；3）采用相同平臺的基因芯片。篩選得到數據集GSE79962后，使用R語言limma包對數據集中膿毒癥病人和非膿毒癥病人心肌組織的差異表達基因（differentiallyexpressedgenes，DEGs）進行篩選。

1.2DEGs的基因功能注釋與通路富集分析

對DEGs進行基因本體（GO）富集分析、京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析。

1.3蛋白-蛋白互作（PPI）網絡分析和樞紐基因分析

利用STRING數據庫將篩選得到的DEGs構建成PPI網絡。采用Cytoscape3.8.2軟件中的CytoHubba插件篩選PPI網絡中的關鍵基因，通過聯合“MCC\"算法、“MNC\"算法、“Degree\"算法、“EPC\"算法、“DMNC”算法5種算法進行顯著性節點蛋白篩選，選取5種算法的關鍵基因的交集，篩選DEGs中的樞紐基因（hubgenes）。

1.4樞紐基因的中藥預測分析

將得到的樞紐基因導人醫學本體信息檢索平臺（CoremineMedical）進行檢索，以 Plt;0.05 作為標準篩選獲得具有潛在治療作用的中藥。將所得到的中藥錄入MicrostExcel中，對得到的中藥進行使用頻次、功效、歸經頻數統計，以 Plt;0.05 為差異有統計學意義。

2結果

2.1差異基因的表達

從GEO數據庫中篩選得到符合要求的微陣列數據集GSE79962。根據設置條件校正后 Plt;0.05 和llogFCl gt;1 篩選數據集，最終獲得DEGs有237個，其中77個顯著上調，160個顯著下調。詳見表1、圖1。

2.2DEGs的GO功能注釋分析與KEGG通路富集分析結果

依據基因編碼的蛋白質在細胞中的作用，從生物過程（biologicalprocess，BP）、細胞組分（cellularcomponent，CC）及分子功能（molecularfunction，MF）方面對差異基因進行GO及KEGG分析。在BP中，DGEs主要富集在肽酶活性的調節、內肽酶活性的調節、炎癥反應的正向調節、脂質代謝過程的調節及活性氧的代謝過程；在CC中，主要富集在含細胞外基質（ECM）的膠原蛋白、細胞質囊泡腔、囊泡腔、分泌顆粒腔、血小板顆粒部分；在MF中，主要富集在氧結合、糖皮質激素受體結合、肽酶抑制劑活性、觸珠蛋白結合及晚期糖基化終產物受體（RAGE）結合。KEGG通路富集主要包括糖尿病并發癥中的高級糖基化終產物（AGE）RAGE信號通路、轉化生長因子（TGF）-3信號通路、低氧誘導因子1（HIF-1）信號通路、細胞因子與細胞因子受體的相互作用。詳見表2、圖2、圖3。

2.3 PPI及關鍵基因的預測結果

將DEGs導人STRING數據庫進行PPI網絡分析，以TSV文件格式導出數據，再導入Cytoscape進行PPI網絡圖的構建；利用CytoHubba插件篩選蛋白互作網絡中的關鍵基因，通過聯合“MCC\"\"MNC\"“Degree”“EPC\"“DMNC\"以上5種算法進行顯著性節點蛋白篩選，選取5種算法的共同基因的7個核心基因作為關鍵基因：信號傳導及轉錄激活因子3（STAT3）、MYC、信號轉導分子3（SMAD3）JUNB、絲氨酸蛋白酶抑制劑亞家族E成員1（SERPINE1）磷酸肌醇-3-激酶調節亞基1（PIK3R1）、CCAAT增強子結合蛋白delta（CEBPD）。詳見圖 4～ 圖10。

2.4潛在治療中藥的預測

將以上7個基因與CoremineMedical數據庫映射，以 Plt;0.05 作為標準篩選獲得具有潛在治療作用的中藥：丹參、黃芪、姜黃、大黃、人參、苦參、白芍、三七等多味中藥（見表3）。參考全國高等中醫藥院校規劃教材進行功效歸類頻次統計發現，清熱解毒藥的頻次最高，其次為補益藥、活血藥、利水藥及化痰藥。詳見表4。

3討論

SCM是一種由膿毒癥引起的可逆性雙側心臟功能障礙，在膿毒癥的發病機制中起著重要作用。SCM的發病機制復雜，涉及炎性介質調節失調、線粒體功能障礙、氧化應激、鈣調節紊亂、自主神經調節失調和內皮功能障礙。

本研究從GEO數據庫篩選得到滿足條件的芯片數據集GSE79962，共納入11例正常組織及20例膿毒癥心肌組織。分析得到DEGs共237個，其中包括77個上調差異基因和160個下調基因。將DEGs進行GO分析，DEGs主要富集ECM結構成分、炎癥反應調控、活性氧、脂質代謝等。KEGG富集分析中，TGF- ?{β 、糖尿病并發癥中AGERAGE、HIF-1等信號通路可能導致了膿毒癥心肌病的發生發展。研究表明，TGF- ?β 及TGF-β/Smad信號通路可通過影響免疫細胞及炎性因子參與調節膿毒癥炎癥反應，故抑制TGF-β，/Smads通路可能改善膿毒癥導致的多器官功能障礙[3。此外，動物模型證實，敲除TβR-I、TβR-I或Smad2/3可抑制成纖維細胞的活性，減少ECM相關基因的表達，減輕心肌纖維化，并改善心肌細胞的穩態[4]。相關實驗表明，AGEs/RAGE在高糖環境下，RAGE與AGEs的結合增多或活性增強，通過引起炎癥反應和氧化應激致使血管內皮損傷或心肌損傷[5]。還有研究發現，AGEs和結締組織生長因子（CTGF）水平與心肌纖維化呈正相關[6]。缺氧誘導因子-1α（hypoxia induciblefactor-1α，HIF-1α）可通過激發內源性保護機制促進HO-1的轉錄及表達發揮抗氧化、抗炎、抗凋亡作用[78]。此外實驗研究證實，SCM組大鼠心肌組織中HO-1mRNA、HIF-1αmRNA及其蛋白和炎性因子 TNF-α IL-8表達均明顯升高，表明炎性因子在膿毒癥過程中可通過升高內源性HIF-1α、HO-1發揮抗炎、心肌保護作用[9]。

通過Cytoscape分析，獲得了7個關鍵基因，分別是STAT3、MYC、SMAD3、JUNB、SERPINE1、PIK3R1、CEBPD。其中信號轉導及轉錄激活蛋白3（STAT3）激活后發揮轉錄調節功能，參與細胞的增殖、調亡及炎癥反應等調控環節[10]。STAT3作為膿毒癥細胞內主要信號轉導系統之一，可通過調控miR-223的表達來減輕膿毒癥大鼠的炎癥反應[\"]。此外，STAT3通過誘導內源性心肌保護因子清除自由基和穩定生物膜，發揮保護心臟的作用[12]。SERPINE1作為纖溶酶原激活物抑制劑，已被證實可促進心肌細胞凋亡及纖維化，加劇心臟重塑，由此推測靶向抑制SPRPINE1分泌可能對防治SCM具有重要意義[13]。C-MyC作為原癌家族基因，可參與心肌的增殖、分化及調節心臟特殊基因的轉錄。研究表示，TGF-β/Smad3過表達能夠加快心肌組織纖維化改變，加快心臟膠原及細胞外基質形成，減少蛋白酶合成，增加心肌肥大，導致心臟重塑，惡化病情[1415]。本研究發現，關鍵核心基因大多與炎癥、凋亡相關，由此可見，炎癥、缺氧應激、細胞凋亡等在SCM的發生發展中扮演重要角色。

本研究篩選出作用于SCM病關鍵基因的中藥主要分為清熱類（苦參、黃連、黃芩、黃柏等）補虛類（人參、白術、當歸、黃芪、麥冬等）、活血類（白芍、三七、丹參、郁金、莪術等）利水滲濕類（茵陳、茯苓、防己、雷公藤等）和化痰類（瓜萎、桑白皮、葶藶子）等，其中尤以清熱解毒類藥物居多，其次為扶正補虛及活血化癖藥物。

SCM病因病機錯綜復雜，但總屬本虛標實之病，發病離不開正虛、熱毒、血癡。劉清泉等認為膿毒癥的病機為正虛毒損、絡脈瘀滯，王今達等[17觀點與其相一致，認為邪毒、血瘀、正虛交互為患，正氣虧虛則是貫穿始終的病理基礎，毒互結為疾病發展的關鍵因素。因此，膿毒癥的臨床治療主要以清熱解毒、活血化瘀為主，兼顧益氣扶正，與本研究預測所得到的中藥相一致，其中氧化苦參堿（oxymatrine，OMT）是中藥苦參的主要活性成分，研究發現其顯著抑制膿毒癥大鼠心肌組織中TGF-β和Smad2的活性，降低促炎性因子表達，以減輕心臟組織損傷、改善心功能[18]。人參總皂苷（total ginsenoside，TG）為中藥人參中提取的皂苷類活性物質，吳梅秋等[19發現TG可激活HIF-1α、HO-1基因及蛋白表達，抑制炎癥反應，改善SCM大鼠心肌損傷，為SCM的治療提供潛在價值。此外，研究表明芍藥苷、黃芩苷可通過抑制TGF-β，/Smad通路，減少膠原產生，從而減輕心肌纖維化的發展[20-21]。此外，邪毒侵襲人體，消耗氣血津液，正氣虧損，腎陽虛不能溫化蒸騰水液，脾陽虛不能運化水濕，痰飲內停，上凌心肺，毒瘀痰阻于心脈，加重心臟功能衰竭。故治療上亦要重視溫陽利水，祛濕化痰，以期延緩病程。研究發現，茯苓四逆湯可能通過抑制炎癥反應和免疫麻痹顯著減輕老年膿毒癥大鼠心肌損傷22。許梅等23運用加味苓桂術甘湯合血必凈可抑制SCM病人心肌損傷，改善血流動力學及預后。但目前尚未有研究闡明祛痰化濕類中藥治療SCM的作用機制，這或可為相關的藥理研究提供新思路。

綜上所述，本研究基于生物信息學分析共篩選出了7個可能參與膿毒癥心肌病的發生和發展過程且與其預后密切相關的基因，這些基因可能通過炎癥反應、氧化應激、血管內皮細胞功能異常、細胞凋亡等信號通路發揮作用。而化痰祛濕類中藥可為SCM病人的治療提供新方向。本研究雖對后續研究有一定的參考價值，但研究結果缺乏臨床試驗及動物實驗等支撐，因此未來仍需要深人研究以驗證所得結論。

參考文獻：

[1]RAVIKUMAR N，SAYED M A，POONSUPH CJ，et al.Septiccardiomyopathy：frombasicstomanagementchoices[J].CurrentProblems in Cardiology，2021，46（4）：100767.

[2]中國中西醫結合學會重癥醫學專業委員會，中國醫師協會中西醫結合醫師分會心臟介入專業委員會，郭力恒，等.膿毒性心肌病中西醫結合診治專家共識[J].中國中西醫結合急救雜志，2022，29（1）：1-6.

[3]邢靜，張或.轉化生長因子TGF-β及TGF-β/smad信號通路與膿毒癥的研究進展[C].廣州：2012中國中西醫結合學會急救醫學專業委員會學術年會論文集，2012：266.

[4]KHALIL H，KANISICAKO，PRASAD V，etal.Fibroblast-specificTGF- ??{β -Smad2/3 signaling underlies cardiac fibrosis[J].Jourmal Investigation，2017，127（10）：3770783.

[5]RUSSO I，FRANGOGIANNIS N G.Diabetes-associated cardiacfibrosis：cellular effectors，molecularmechanismsand therapeuticopportunities[J].Joumal Molecular and Celluar Cardiology，2016，90：84-93.

[6]侯改霞，肖國強，習雪峰，等.糖尿病大鼠心肌纖維化與心肌AGEs/RAGE水平的變化[J].中國實驗動物學報，2018，26（4）：461-466.

[7]HE C，ZHANG W，LI S，et al.Edaravone improves septic cardiacfunction by inducing an HIF-1a/HO-1 pathway[J].Oxid Med CellLongev，2018，20（18）：521-538.

[8]HU X N，ZENG WW，YOU X X，et al.Exogenous hydrogen sulfideregulates mycoplasma pneumoniaelipid-associated membraneproteinsto induce expression heme oxygenase-1andproinflammatory cytokines[J].Inflammation，2020，43（3）：847-856.

[9]WANGYF，ZHANGXR，TIANJM，etal.SevluranealleviatesLPS-induced acute lunginjury via the microRNA-27a-3p/TLR4/MyD88/NF-kB signalingpathway[J].Intemational Joumal MolecularMedicine，2019，44（2）：479-490.

[10]XIN P，XU XY，DENG C J，et al. role JAK/STAT signalingpathway anditsinhibitorsindiseases[J].InternationalImmunopharmacology，2020，80：106210.

[11]張嘯，龔園其，藍海兵，等.STAT3通路調控miR-223抑制NLRP3表達對膿毒癥炎癥反應的影響及作用機制[J].中國免疫學雜志，2023，39（9）：1793-1796;1802.

[12］李茜，夏中元.STAT3蛋白在心肌缺血再灌注損傷中的保護作用的研究進展[J].醫學研究雜志，2016，45（2）：5-7.

[13]FLEVARISP，KHANS S，EREN M，et al.Plasminogen activatorinhibitor type lcontrols cardiomyocyte transforming growth factor ?{β （204號andcardiac fibrosis[J].Circulation，2017，136（7）：664-679.

[14]ZHENGP C，FENG XL，DENG QY，et al.Study on the efficacy nanoantibioticsin ratswith sepsis basedon microRNA-195andTGF-β，/smads signaling pathway[J].Journal NanoscienceandNanotechnology，2021，21（2）：1357-1364.

[15]FERIANI A，TIRM，GOMEZ-CARAVACAA M，et al.Zygophyllumalbum leaves extract prevented hepatic fibrosis in rats，by reducingliverinjuryandsuppressingoxidativestress，inflammation，apoptosisand the TGF-β，/Smadssignalingpathways.Exploringbioactive compounds using HPLC-DAD-ESI-QTOF-MS/MS[J].Inflammopharmacology，2020，28（6）：1735-1750.

[16]劉清泉，張偉，姜良鐸.瘀毒傷絡、阻絡病機與膿毒癥[J].中國中醫藥現代遠程教育，2010，8（17）：199-200.

[17]王今達，李志軍，李銀平.從“三證三法\"辨證論治膿毒癥[J].中國危重病急救醫學，2006，18（11）：643-644.

[18]蔣志虎，馬競，王小東，等.氧化苦參堿通過TGF-β/Smad信號通路對膿毒性休克大鼠心肌損傷的保護作用[J].河北醫藥，2022，44（23）：3554-3558;3563.

[19]吳梅秋，邱名耀，林先萍，等.人參總皂苷經HIF-1α/HO-1信號通路減輕膿毒癥大鼠心肌損傷的機制研究［J].中國急救醫學，2021，41（3）：244-249.

[20]朱慶均.黃芩苷與黃芩素治療纖維化疾病研究進展[J].中國中藥雜志，2017，42（7）：1271-1276.

[21]閆娜，楊妮，董晗，等.芍藥苷通過抑制TGF-β，/Smad3通路對急性心肌梗死后心室重塑的作用研究[J].現代中西醫結合雜志，2022，31（5）：624-629

[22]曾圓圓，黃壑霏，彭曉洪，黃亞秀，黃永蓮，陳冬杰，王評.茯苓四逆湯治療膿毒癥心肌病的臨床療效研究[J].中國中醫急癥，2023，32（9）：1548-1551.

[23]許梅，段明明，楊明華，等.祛瘀解毒利水法（血必凈和加味苓桂術甘湯）輔助治療對膿毒癥心肌病患者預后的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2023，29（7）：146-152.（收稿日期：2023-11-04）