纖維素酶及其基因研究進展

趙燕 陳庚華 周衛 侯亞利 楊忠華

（武漢科技大學化學工程與技術學院，武漢 430081）

纖維素是一種長鏈糖類，主要由結晶和非結晶兩種形式構成，是自然界中較為豐富的可再生生物資源，若對其合理廣泛應用，可在一定程度上減輕全球普遍存在的能源危機問題。因此，自1906年纖維素酶從蝸牛消化液中被發掘出來之后，全球開始了對纖維素酶的廣泛研究。雖然自然界中很多生物可以產生纖維素酶，但是面對能源壓力和市場化的需求，如何進一步提高纖維素酶的產量和生產水平，是迫在眉睫的問題。而對纖維素酶基因的研究為此開辟了一條新的可行途徑。

1 纖維素酶與生物能源

由于目前全球性的能源壓力，使很多科研機構和企業嘗試尋找新的可再生能源來代替現有的石化資源。專家普遍認為，緩解能源壓力除了目前新興的以微藻為原料制備第二代生物柴油之外［1］，還可采用酶水解碳水化合物形成糖類，并進一步發酵生成乙醇。甘蔗中含有大量的蔗糖等糖分，其逐漸成為生產生物乙醇的主要原料。而甘蔗制備蔗糖后剩下的甘蔗渣可用于燃燒，提供蒸汽帶動機器運作。但是這種做法并不能使蔗渣得到充分的利用，且燃燒蔗渣等秸稈廢物產生的CO2等氣體，是溫室效應的主要原因。鑒于環境問題和對燃料乙醇產量的需求，在對甘蔗的利用方面，其除產生蔗糖之外，逐漸轉變成酶解提取蔗糖后的廢棄蔗渣（大部分為纖維素），從而得到更多的糖分制備乙醇等能源［2］。纖維素酶水解纖維素制備生物能源，不僅能解決工業生產廢棄纖維素堆積造成的空間污染問題，而且可將廢棄纖維素更合理充分的利用于生產生活以及農畜業。

因此，纖維素作為全球普遍大量存在的可再生多糖資源，應用前景非常廣闊。纖維素生物質可以通過水解發酵分離（SHF）法，采用單一的水解酶將其水解為糖類物質，隨后用另一種酶發酵為液體燃料；也可以通過厭氧菌的水解-發酵耦合方式轉化為燃料乙醇［3］。近年來對于纖維素酶的研究應用主要采用物理或者化學的方法調控植物體內纖維素、半纖維素以及木質素的形成，從而改變纖維素的纖維組成［4］。纖維素酶水解利用生活、森林和農業廢棄纖維素制備生物燃料，具有廣闊的前景，故受到全球關注。大部分的生產工藝為生產乙醇的工藝流程，而Wilson等［5］曾用纖維素酶和纖維素制備可摻雜在汽油里的丁醇，供汽車使用，不但汽油和丁醇的溶合性很好，而且汽車行駛路程也略有增加。

湯斌［6］，李旭東［7］等研究了纖維素酶在稀酸的作用下對秸稈產燃料乙醇的預處理，分別以0.8%（W/W）或質量分數為4 %的稀硫酸處理，得到了最佳效果。江丹等［8］研究發現，利用纖維素酶可處理造紙污泥發酵產生乙醇，發酵條件優化后乙醇的發酵率最高可達到95.97%，具有一定的工業應用前景。

2 纖維素酶商業化趨勢

作為水解纖維素制備生物能源的“工具”，市場上對纖維素酶的質量和需求量日益增高。而由于纖維素酶的用途廣泛，其除了制備生物能源之外，還可以制備成飼料添加劑、織物洗滌劑、造紙工業等有關的酶制劑投入工業生產。Genencor和Novozyme兩家公司是目前生產生物催化轉化型纖維素酶較具代表性的公司。Genencor公司近幾年研發了酶Accelerase?1500，該酶由基因工程改造的里氏木霉分泌，同最初研發的Accelerase?1000相比，在制備生物乙醇方面經濟效益更高，故而被專門用于木質纖維素的生物燃料制備工藝［9］。

Novozyme公司生產和制備的纖維素酶較多元化，如用在紡織業的Cellusoft?AP和Cellusoft?CR，衣物清潔劑中所含的Carezyme?和Celluclean?，低溫清洗石料中用到的Denimax?等針對性的酶制劑。2009年，Novozyme公司聲明其生產的纖維素酶制劑在生物質水解方面具有可應用性。雖然產品的相關信息和市場實用性尚不清楚，但對于纖維素酶的發展有著一定的意義。表1［9］中列舉的是目前世界上生產出售纖維素酶的主要公司以及制備酶的菌種，其中大部分菌種都是經過改造的基因工程菌。

3 纖維素酶工程

纖維素酶在能源方面的優勢及其商業化趨勢使其在生活和生產中的需求量逐漸增加。雖然自然界中很多絲狀真菌可以生產分泌纖維素酶，但是其產酶水平、酶量和酶的性能并不能滿足市場化商業化的需求。?hgren等［10］曾試圖將纖維素酶糖基化與發酵工藝相偶聯，但仍不能體現纖維素的最佳應用效果。影響纖維素應用的主要問題是天然纖維素酶在對纖維素水解的實際應用中沒有可行性或者可行性很低［11］。近10年來，對纖維素酶的研究逐漸轉移到基因方面。過去的研究結果顯示，纖維素酶水解纖維素主要是3個組分的協同作用，各個酶組分之間互相創造合適的結合位點，并解決產物對酶的抑制作用［12，13］，目前國內外都試圖采用基因調控的手段提高產業化纖維素酶各組分的產量和酶學性質。

3.1 纖維素酶結構域功能

3.1.1 真菌纖維素酶結構研究 很多絲狀真菌可以分泌纖維素酶，但目前研究較為深入的是T.reesei纖維素酶體系，已鑒定出其分泌的8種主要纖維素酶，并通過克隆技術成功制備2種葡萄糖苷酶［14］。

1988年，Stahlberg等［15］通過試驗證明，絲狀真菌T. reesei產纖維素酶具有很大的開發潛力，并猜想纖維素酶催化區含有纖維素結合域（CBD），其功能主要是可以自主的結合和脫離結晶纖維素。隨后科研試驗對纖維素酶的研究更多著重于T.reesei及其基因方向。Saloheimo等［16］于1988年發現，自然界中T. reesei內切葡聚糖酶（EG）III的C-末端與纖維素結合域（CBD）之間存在一個由21個氨基酸組成的信號序列。因此推斷，內切葡聚糖酶纖維素結合域（CBDEDIII）編碼區的第一個密碼子不是起始密碼子AUG，而編碼區的最后一個密碼子也并不是終止密碼子UAG。該發現對隨后CBDEDIII基因重組以及在宿主中的表達研究有著重要意義。

隨著對纖維素酶基因的研究，1996年，Linder和Teeri［17］證實，大多數T. reesei都可以產生非催化性質的CBD，而T. reesei的EG III基因重組后對纖維素的親和性是完全可逆的。而Kleman-leyer［18］和GAO等［19］曾先后發現重組纖維素酶對纖維素纖維的解聚去纖能力同天然纖維素酶相比有顯著的提高。2001年山東大學試驗得出，CBDEDIII對結晶纖維素的作用主要是破壞多糖鏈間和鏈內的氫鍵［20］。

表1 商業化纖維素酶生產公司及其產酶菌種［9］

3.1.2 細菌纖維素酶結構 大多數細菌的纖維素酶為內切葡聚糖酶，有些細菌含有一些特殊的編碼基因，如葡萄糖苷酶基因，以及與纖維磷酸化相關的酶基因［21］。侯愛華等［22］2002年對細菌纖維素酶研究認為，一些細菌產生分泌的纖維素酶常聚合形成纖酶小體結構的多酶復合體。細菌生產分泌纖維素酶雖然量少，大多無法作用于結晶纖維素且不是胞外酶，但很多產纖維素酶細菌的CBD區含有的氨基酸大多不帶電荷，羥基氨基酸為主要成分，肽鏈末端半胱氨基酸的位置基本相同［23］。細菌中的纖維素酶小體成簇無規律的分散于細菌細胞內，目前研究較多的是C. thermocellum，其大多數的纖維素酶小體都聚集在cel簇上。2005年時，cip C-cel 48F等12個基因已完全被鑒定出來，并且證實轉錄從cip C起始［24］。Demain［25］研究發現，C. thermocellum的纖維素酶基因中存在纖維素酶小體和非纖維素酶小體兩種基因。

3.2 纖維素酶基因的研究

早在20世紀80年代，DNA重組技術已用來克隆和鑒定微生物體內的纖維素酶基因，研究最多的為編碼Eng和Exg的胞外纖維素酶基因［26］。香港科技大學自1988年開始研究纖維素酶產生菌，目前克隆過Cellulomonas fimi中編碼Eng和Exg的基因：cenA和cex，并成功將其導入多種宿主中［26］。由于Cellulomonas biazotea分泌Cel能力較高，并且與C. fimi具有一定的相關性［27］，該實驗室目前主要研究Cellulomonas biazotea中Cel同Eng和Exg的協同作用。

Kim等［28］將耐熱菌Aquifex aeolicus VF5中編碼耐熱內切葡聚糖酶的基因（Cel8Y）克隆轉導入E. coli XL1-Blue中。通過表達和檢測，該內切葡聚糖酶在80℃時有最大酶活，在100 ℃時酶活可持續2 h。

Hakamada等［29］純化并研究了Bacilluis circulans高等電點堿性葡聚糖內切酶，采用盒式連接對其基因進行PCR，得到的結構基因含有一個單一的開放閱讀框，編碼407個氨基酸，其中包括一條大約有30個氨基酸的信號肽。

蔡勇等［30］利用大腸桿菌作為宿主細胞，從芽孢桿菌CY1-3中克隆表達出具有纖維素酶活性的CelC蛋白。2009年，Rahman等［31］在研究纖維素酶與木糖酶的同源重組性時，提出理想情況下，可以用T. reesei的cbh1啟動子和終止子構建表達載體來制備同源和異源性蛋白質。而通過熒光蛋白標記，對cbh1啟動子的轉錄活性測定可達到細胞水平［32］。

Kitagawa等［33］將Clostridium thermocellum的內切葡聚糖酶基因（Ctcel8A）與質粒相連后轉入酵母二倍體細胞，得到的缺失菌株與野生型菌株相比，內切葡聚糖酶的活力有所提高。在對缺失菌株分類后，經試驗證實vps3Δ和vps16Δ菌株異源性表達產生的β-葡糖苷酶活性很高。

華東理工大學［34］2011年構建了隨機整合型pWEF 31和定點整合型pWEF 32基因表達載體。這兩種基因可以通過農桿菌介導轉入里氏木霉，構建載體后通過紅色標記基因［35］檢測可確定構建的載體的實用性。通過試驗發現pWEF 31比較適合用于隨機性的重組試驗，而pWEF 32則適用于同源性重組。該研究對絲狀真菌基因功能和表達的研究極其有利。

Anthony等［36］2012年報道了一種從Cellulomonas biazotea克隆得到的新型纖維二糖酶基因（cba3），該基因編碼的β-葡萄糖苷酶屬于糖苷水解酶家族1（GH 1），而以往研究和報道C. biazotea的cba3基因編碼得到β-葡萄糖苷酶都是糖苷水解酶家族3的成員，這是首次在C. biazotea中得到GH 1家族的β-葡萄糖苷酶。

到目前為止，以大腸桿菌或者酵母細胞為宿主菌，很多細菌或者真菌的纖維素酶基因得到了表達。李旺等［37］總結，在纖維素酶基因研究和克隆的早期，若想獲得纖維素酶基因較完整的信息，可通過構建DNA文庫和cDNA文庫的方法。而隨著技術的進步，目前可采用人工合成和選擇性的從宏基因組中擴增等方式獲得纖維素酶基因。

這些研究及其成果，使人工構建的重組纖維素酶投入廣泛工業生產應用成為可能。本實驗室目前著手研究綠色木霉中內切葡聚糖酶基因在大腸桿菌中的克隆表達，若成功構建工程菌，對纖維素酶的工業利用有著深遠意義。

4 結語

纖維素除了用于制備生物能源，還可以作為添加劑投入工業生產，如生產可降解塑料等。由于纖維素制備燃料乙醇仍有許多限制，其制備尚不能達到大量工業化的水平［38］。鑒于纖維素酶的實用性和市場前景，國內外對纖維素酶的基因研究和改造取得了很大進展。纖酶小體的發現，使細菌纖維素酶的研究有了很大的進展。然而工程菌的制備對表達體系要求較高，加大了纖維素酶工程菌制備的難度。隨著生物技術的發展，對纖維素酶工程菌研究的逐漸完善以及各級加工工藝的發展，將大大推動纖維素酶的市場化應用。

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