牛蒡子苷元調節(jié)Hippo信號通路對黑素瘤細胞化療耐藥性的影響

[摘要]目的：探究牛蒡子苷元（Arctigenin，ARG）對黑素瘤細胞化療耐藥性的影響以及該過程中對Hippo信號通路的調節(jié)機制。方法：利用不同濃度的維莫非尼（Vemurafenib，VEM）持續(xù)培養(yǎng)A375細胞以獲得耐藥性黑素瘤細胞株A375/VEM；CCK-8檢測不同濃度VEM對A375和A375/VEM細胞的增殖活性以及不同濃度ARG對A375/VEM細胞的毒性；將A375/VEM細胞分為對照組、VEM組、ARG組、ARG+VEM組、ARG+VEM+Hippo抑制劑組，CCK-8法檢測各組A375/VEM細胞的存活率；克隆形成實驗檢測各組A375/VEM細胞的增殖情況；流式細胞術檢測各組A375/VEM細胞的凋亡情況；Western blot檢測各組細胞中Cyclin D1、ERK1/2、p-ERK1/2、AKT、p-AKT及Hippo途經相關蛋白的表達；建立耐藥性黑素瘤小鼠移植模型并觀察腫瘤生長情況。結果：與對照組相比，VEM組、ARG組及ARG+VEM組A375/VEM細胞的存活率、克隆形成數(shù)量、Cyclin D1、p-ERK1/2、p-AKT、Yes相關蛋白（Yes-associated protein，YAP）表達均降低（P＜0.05），且ARG+VEM組低于VEM組和ARG組（P＜0.05），細胞凋亡率、LATS1、p-YAP水平升高（P＜0.05），且ARG+VEM組高于VEM組和ARG組（P＜0.05）；與ARG+VEM組相比，ARG+VEM+Hippo抑制劑組A375/VEM細胞的存活率、克隆形成數(shù)量、Cyclin D1、p-ERK1/2、p-AKT、YAP表達均升高（P＜0.05），細胞凋亡率、LATS1、p-YAP水平降低（P＜0.05）；裸鼠移植瘤體內實驗發(fā)現(xiàn)，ARG+VEM組小鼠腫瘤重量和體積均明顯低于VEM組和ARG組（P＜0.05）；進一步加入Hippo途徑的抑制劑，發(fā)現(xiàn)ARG對A375/VEM細胞耐藥性的抑制作用被逆轉（P＜0.05）。結論：ARG可能是通過激活Hippo途徑來抑制黑素瘤細胞的化療耐藥性。

[關鍵詞]牛蒡子苷元（ARG）；黑素瘤細胞；化療；耐藥性；Hippo信號通路

[中圖分類號]R285" " [文獻標志碼]A" " [文章編號]1008-6455（2025）07-0001-06

Impact of Arctigenin on Chemoresistance of Melanoma Cells by Regulating Hippo Signal Pathway

GAO Yang1， DU Ziwei1， WANG Haifei2

（ 1.Department of Dermatology， Hebei College of Traditional Chinese Medicine， Shijiazhuang 050000， Hebei， China; 2.Department of Dermatology， Luanping County Traditional Chinese Medicine Hospital， Chengde 068250， Hebei， China ）

Abstract： Objective" To explore the impact of arctigenin （ARG） on chemoresistance of melanoma cells and its regulation mechanism on Hippo signaling pathway in this process. Methods" The drug resistant melanoma cell line A375/VEM was obtained by continuously culturing A375 cells with different concentrations of vemurafenib （VEM）. CCK-8 was applied to detect the proliferative activity of VEM at different concentrations on A375 and A375/VEM cells， and the toxicity of ARG at different concentrations on A375/VEM cells. A375/VEM cells were grouped into control group， VEM group， ARG group， ARG+VEM group， and ARG+VEM+Hippo inhibitor group， CCK-8 method was applied to detect the survival rate of A375/VEM cells in each group， clone formation experiment was applied to detect the proliferation of A375/VEM cells in each group， flow cytometry was applied to detect the apoptosis of A375/VEM cells in each group. Western blot was applied to detect the expression of Cyclin D1， ERK1/2， p-ERK1/2， AKT， p-AKT， and Hippo pathway related proteins of cells in each group， the transplantation model of drug-resistant melanoma in mice was established， and the tumor growth was observed. Results" Compared with the control group， the survival rate of A375/VEM cells， clone formation quantity， the expression of Cyclin D1， p-ERK1/2， p-AKT， and Yes-associated protein in the VEM group， ARG group， and ARG+VEM group reduced （P＜0.05）， and the ARG+VEM group were lower than the VEM group and ARG group （P＜0.05）， the apoptosis rate， and the levels of LATS1 and p-YAP increased （P＜0.05）， and the ARG+VEM group were higher than the VEM group and ARG group （P＜0.05）. Compared with the ARG+VEM group， the survival rate of A375/VEM cells， clone formation quantity， the expression of Cyclin D1， p-ERK1/2， p-AKT， and YAP in the ARG+VEM+Hippo inhibitor group increased （P＜0.05）， the apoptosis rate， and the levels of LATS1 and p-YAP decreased （P＜0.05）. In vivo experiments on nude mice transplanted with tumor cells showed that the tumor weight and volume in the ARG+VEM group were obviously lower than those in the VEM and ARG groups （P＜0.05）. Further addition of Hippo pathway inhibitors revealed that the inhibitory effect of ARG on drug resistance in A375/VEM cells was reversed （P＜0.05）. Conclusion" ARG may inhibit the chemoresistance of melanoma cells by activating Hippo pathway.

Key words： arctigenin（ARG）; melanoma cells; chemotherapy; resistance; hippo signaling pathway

黑素瘤主要是黑素細胞發(fā)展而來，紫外線輻射通過其對皮膚的有害影響和直接的DNA損傷而成為皮膚黑素瘤形成的主要因素，加速腫瘤發(fā)生[1-2]。據了解，BRAF基因突變是黑素瘤最常見的突變，BRAF抑制劑維莫非尼（Vemurafenib，VEM）已被用于黑素瘤的治療，但化療后會產生的耐藥性[3]。Hippo途徑是一種腫瘤抑制途徑，其失調會導致下游效應子轉錄輔調節(jié)蛋白Yes相關蛋白（Yes-associated protein，YAP）和具有PDZ結合基序的轉錄輔激活因子（Transcriptional co-activator with PDZ-binding motif，TAZ）過度激活并促進癌癥的發(fā)展和進展，包括皮膚癌[4]。有研究已經證明，Hippo腫瘤抑制通路的激活促進了黑素細胞生長停滯[5]。牛蒡子苷元（ARG）是從牛蒡子的種子中分離的活性成分，具有抗氧化、抗炎、免疫調節(jié)以及對乳腺癌、卵巢癌等多種癌癥的抗腫瘤作用[6-7]，同時另一項研究發(fā)現(xiàn)ARG可在微環(huán)境應激條件下抑制結腸癌細胞對依托泊苷的耐藥性[8]。但其對黑素瘤細胞以及耐藥性的作用尚未明確。因此，本研究旨在探討ARG對黑素瘤細胞耐藥性的影響以及該過程中的具體作用機制。

1" 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物和細胞：SPF級BALB/c Nude裸鼠，雌性，6周齡，（18±2）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2021-0011，將裸鼠在溫度24℃～26℃，濕度60%的環(huán)境中適用性飼養(yǎng)1周。人惡性黑素瘤細胞A375購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.1.2 主要試劑和儀器：牛蒡子苷元（純度：HPLC≥98%）購自四川省維克奇生物科技有限公司；維莫非尼片（規(guī)格：240毫克/片），國藥準字HJ20170124；CCK-8細胞增殖/毒性檢測試劑盒購自艾美捷科技有限公司，貨號KTC011001；Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自上海弗元生物科技有限公司，貨號FY600003；Cyclin D1、ERK1/2、p-ERK1/2、LATS1、YAP、p-YAP兔單抗及AKT、p-AKT兔多抗購自英國abcam公司，貨號ab134175、ab184699、ab278538、ab243656、ab52771、ab76252、ab8805、ab38449；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（H+L）購自上海和元李記生物技術有限公司，貨號AP31L014。SpectraMax Gemini EM熒光酶標儀購自上海美谷分子儀器有限公司；奧林巴斯CKX53倒置顯微鏡購自上海儀景通光學科技有限公司；BD FACS Canto II流式細胞儀購自上海遠耀生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：將A375細胞接種至含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素混合液的DEME培養(yǎng)基中，并放置在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d換一次液并傳代。隨后為了獲得VEM耐藥性細胞株A375/VEM，將A375細胞系以1×104個細胞/毫升的密度接種在60 mm的培養(yǎng)皿中，用1μM濃度的VEM處理細胞6周，每3 d處理一次，然后將VEM的濃度增加至2μM，同樣每3 d處理細胞一次，持續(xù)6周以獲得耐藥性細胞株A375/VEM。接著將VEM的濃度增加至5μM，每周處理細胞兩次以保持耐藥性。A375/VEM細胞的培養(yǎng)方式與A375細胞相同，使用第3代細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2 CCK-8檢測VEM對A375和A375/VEM細胞的增殖活性：將A375和A375/VEM細胞分別接種至96孔板中（1×104個細胞/孔），然后用濃度為0.1、0.5、1、5、10、20μM的VEM處理A375細胞和A375/VEM細胞，每孔100μl。同時設立未用VEM處理的對照組，24 h后，每孔加入10 μl的CCK-8溶液在37℃下繼續(xù)孵育4 h，使用酶標儀檢測490 nm處的吸光度（OD值），并計算細胞存活率及半數(shù)抑制濃度IC50。細胞存活率（%）=（ODVEM處理組-OD空白組）/（OD對照組-OD空白組）×100%。

1.2.3 CCK-8檢測ARG對A375/VEM細胞的毒性：將A375/VEM細胞接種至96孔板中（1×104個細胞/孔），隨后用不同濃度（1、2.5、5、10、20、40 mg/L）的ARG[7]處理細胞，同樣設置未做任何處理的對照組，24 h后按照1.2.2的實驗方法計算細胞存活率及半數(shù)抑制濃度IC50。

1.2.4 A375/VEM細胞分組及處理：將A375/VEM細胞分為對照組、VEM組、ARG組、ARG+VEM組、ARG+VEM+Hippo抑制劑組。VEM組細胞用1μM的VEM培養(yǎng)，ARG組細胞用20 mg/L的ARG培養(yǎng)，ARG+VEM組細胞先后依次加入20 mg/L的ARG和1μM的VEM進行共培養(yǎng)，ARG+VEM+Hippo抑制劑組細胞先用Hippo抑制劑XMU-MP-1處理30 min[9]，然后再加入20 mg/L ARG和1μM VEM進行培養(yǎng)。48 h后按照1.2.2的方法檢測各組A375/VEM細胞的存活率。

1.2.5 克隆形成實驗檢測各組A375/VEM細胞的增殖情況：將A375/VEM細胞接種在6孔板中（1×103個細胞/孔），以1.2.4的分組培養(yǎng)細胞，14 d后，棄去培養(yǎng)液，用4%多聚甲醛固定細胞，并用0.1%結晶紫染色。1 h后，PBS洗滌細胞，在顯微鏡下觀察各組細胞的克隆形成情況，并對克隆細胞進行計數(shù)。

1.2.6 流式細胞術檢測各組A375/VEM細胞的凋亡情況：將A375/VEM細胞接種至6孔板中（1×105個細胞/孔），以1.2.4的分組培養(yǎng)48 h后，收集細胞用預冷的PBS沖洗并用1×結合緩沖液重懸，然后依次加入5μl Annexin V-FITC和5μl PI在室溫下避光孵育15 min，使用流式細胞儀分析細胞凋亡情況，并計算細胞凋亡率。

1.2.7 Western blot檢測各組細胞中Cyclin D1、ERK1/2、p-ERK1/2、AKT、p-AKT及Hippo途經相關蛋白的表達：收集按1.2.4分組培養(yǎng)48 h后的A375/VEM細胞，PBS洗滌后加入蛋白裂解液提取蛋白，并用BCA檢測蛋白濃度。將變性后的蛋白在10% SDS-PAGE中電泳分離，并轉移到PVDF膜上。將膜在5%脫脂牛奶中封閉1 h，TBST清洗后與一抗（Cyclin D1、ERK1/2、p-ERK1/2、YAP、p-YAP比例1∶10 000，AKT、p-AKT比例1∶500，LATS1比例1∶1 000）在4℃冰箱中孵育過夜再與辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二級抗體（1∶3 000）在室溫下孵育1 h，TBST洗滌后用ECL試劑避光孵育10 min，最后蛋白質凝膠成像系統(tǒng)中檢測蛋白表達并拍照，使用Image J軟件對蛋白灰度值進行分析。

1.2.8 移植瘤小鼠模型的建立：將按1.2.4分組培養(yǎng)48 h后A375/VEM細胞重懸并調整至密度為2×106個細胞/毫升，將小鼠隨機分為對照組、VEM組、ARG組、ARG+VEM組、ARG+VEM+Hippo抑制劑組，每組6只。然后按分組皮下注射1 ml細胞懸液至無胸腺裸鼠的右前肢下以形成異種移植腫瘤，每天觀察腫瘤生長情況，并利用游標卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），每周測量3次，并計算腫瘤體積（V），V（mm3）=（ab2）/2。3周后，將所有小鼠用1%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉后斷頸處死，取出腫瘤組織并稱重。

1.3 統(tǒng)計學分析：Graphpad prism 8.0軟件對數(shù)據統(tǒng)計分析，計量資料以表示，兩組比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩多重比較采用Tukey's檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2" 結果

2.1 不同濃度VEM對A375和A375/VEM細胞增殖的影響：0.1、0.5、1、5、10、20μM VEM處理后的A375細胞存活率低于未處理組（P＜0.05），1、5、10、20μM VEM處理后A375/VEM細胞存活率低于未處理組（P＜0.05），且同一濃度下的A375細胞的存活率明顯低于A375/VEM細胞（P＜0.05）；A375/VEM細胞的IC50（56.76μM）明顯高于A375細胞的IC50（1.40μM）。其中VEM濃度為1μM時對A375/VEM細胞有較小的抑制作用，因此后續(xù)實驗選擇1μM的VEM，見表1。

2.2 不同濃度ARG對A375/VEM細胞增殖的影響：與未處理組相比，2.5、5、10、20、40 mg/L ARG處理后的A375/VEM細胞存活率降低（P＜0.05）；且ARG處理A375/VEM細胞48 h后的IC50為20.05 mg/L。因此，本實驗選擇濃度為20 mg/L作為后續(xù)實驗ARG處理細胞的最佳濃度，見表2。

2.3 ARG對各組A375/VEM細胞存活率及克隆形成能力的影響：與對照組相比，VEM組、ARG組和ARG+VEM組細胞的存活率和克隆形成數(shù)量均降低（P＜0.05），且ARG+VEM組細胞存活率和克隆形成數(shù)量低于VEM組和ARG組（P＜0.05）；與ARG+VEM組相比，ARG+VEM+Hippo抑制劑組細胞的存活率和克隆形成數(shù)量升高（P＜0.05），見圖1、表3。

2.4 ARG對各組A375/VEM細胞凋亡的影響：與對照組相比，VEM組、ARG組和ARG+VEM組細胞凋亡率升高（P＜0.05），且ARG+VEM組細胞凋亡率高于VEM組和ARG組（P＜0.05）；與ARG+VEM組相比，ARG+VEM+Hippo抑制劑組細胞凋亡率降低（P＜0.05），見圖2、表4。

2.5 ARG對各組A375/VEM細胞中Cyclin D1和ERK1/2、AKT及其磷酸化蛋白表達的影響：與對照組相比，VEM組、ARG組和ARG+VEM組細胞中Cyclin D1、p-ERK1/2、p-AKT表達均降低（P＜0.05），且ARG+VEM組Cyclin D1、p-ERK1/2、p-AKT表達低于VEM組和ARG組（P＜0.05）；與ARG+VEM組相比，ARG+VEM+Hippo抑制劑組細胞中Cyclin D1、p-ERK1/2、p-AKT表達均升高（P＜0.05），見圖3、表5。

2.6 ARG對各組A375/VEM細胞中Hippo途經相關蛋白表達的影響：與對照組相比，VEM組、ARG組和ARG+VEM組細胞中LATS1、p-YAP表達升高，YAP表達降低（P＜0.05），且ARG+VEM組LATS1、p-YAP表達高于VEM組和ARG組，YAP表達低于VEM組和ARG組（P＜0.05）；與ARG+VEM組相比，ARG+VEM+Hippo抑制劑組細胞中LATS1、p-YAP表達降低，YAP表達升高（P＜0.05），見圖4、表6。

2.7 ARG對移植瘤小鼠的腫瘤生長情況的影響：與對照組相比，VEM組、ARG組和ARG+VEM組小鼠的腫瘤組織重量、體積均減小（P＜0.05），且ARG+VEM組腫瘤重量和體積均小于VEM組和ARG組（P＜0.05）；與ARG+VEM組相比，ARG+VEM+Hippo抑制劑組腫瘤組織重量、體積均升高（P＜0.05），見表7。

3" 討論

黑素瘤仍然是皮膚癌導致死亡的主要原因，易發(fā)生轉移和侵襲，且發(fā)病率和死亡率逐年升高。BRAF突變黑素瘤占黑素瘤患者的50%以上，其中V600E突變占70%～90%[10]。目前，BRAF抑制劑VEM被批準用于黑素瘤治療，主要通過特異性靶向V600E突變的BRAF，顯示出明顯的抗腫瘤活性，并提高了BRAF V600E突變黑素瘤患者的存活率[11]。盡管VEM具有快速的療效和良好的反應率，但大多數(shù)黑素瘤患者在治療8～9個月后出現(xiàn)腫瘤耐藥性，嚴重影響了患者的生存和預后[12]。因此，克服BRAF抑制劑耐藥性對提高患者存活率具有重要意義。本研究利用VEM持續(xù)誘導獲得人黑素瘤耐藥細胞株A375/VEM，并通過不同濃度的VEM分別處理A375和A375/VEM細胞，結果發(fā)現(xiàn)VEM處理后A375細胞的IC50明顯低于A375/VEM細胞，提示A375/VEM細胞對VEM的敏感性降低，VEM耐藥性黑素瘤細胞株A375/VEM誘導成功。

ATG是牛蒡的主要活性成分，已被證明具有較強的抗癌活性，該活性主要歸因于在乳腺癌、肺癌和結腸癌等癌細胞中誘導由線粒體破壞和細胞周期停滯介導的凋亡[13]。研究顯示ATG可通過激活自噬來增強結直腸癌順鉑耐藥細胞的敏感性[14]。但對黑素瘤細胞耐藥性的作用還未了解。本研究結果顯示，與對照組和VEM組相比，ARG處理A375/VEM細胞后存活率、克隆形成數(shù)量降低，細胞凋亡率升高，而ARG和VEM共同處理細胞后存活率、克隆形成數(shù)量明顯低于ARG組，凋亡率高于ARG組，提示ARG能夠提高A375/VEM耐藥細胞對VEM的敏感性，即抑制其耐藥性。

據報道，BRAF是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑中的關鍵蛋白，主要調節(jié)細胞增殖、分化、遷移和凋亡等功能[11]。已知MAPK/細胞外信號調節(jié)激酶（ERK）途徑和磷酸肌醇3-激酶（PI3K）-AKT途徑的再激活是BRAF抑制劑耐藥的分子機制[15]。細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）是由CCND1基因編碼的一種重要的細胞周期調節(jié)因子，研究顯示Cyclin D1的過度表達可能使BRAF突變的黑素瘤細胞對VEM產生耐藥性[16]。本研究結果顯示，ARG組A375/VEM細胞中Cyclin D1、p-ERK1/2、p-AKT表達低于VEM組，而ARG+VEM組細胞中Cyclin D1、p-ERK1/2、p-AKT表達低于ARG組，揭示了ARG可以抑制Cyclin D1蛋白的表達，同時可以抑制MAPK/ERK和PI3K/AKT通路激活，進而抑制細胞的增殖及對VEM的耐藥性。

Hippo途徑是一個進化上保守的級聯(lián)，該途徑核心成分包括絲氨酸/蘇氨酸激酶（Mammalian sterile 20 like kinase，MST1/2）、大腫瘤激活因子1/2（Large tumor suppressor kinase，LATS1/2）和主要下游介體YAP/TAZ。MST和LATS兩種激酶的激活導致YAP/TAZ磷酸化，限制了它們的穩(wěn)定性、核定位和轉錄活性[17]。在BRAFV600E突變的黑素瘤細胞系中延長VEM治療可誘導肌動蛋白細胞骨架重塑，增加YAP核定位并促進耐藥性和癌細胞活力[18]。因此，YAP的核定位被認為是癌癥患者的不良預后。為了防止YAP的增殖活性，通過激活Hippo途徑中LATS1，隨后磷酸化途徑效應子YAP，并驅動YAP從細胞核轉移到細胞質中滯留和降解[19]。研究顯示，泛素特異性肽酶22的過表達導致黑素瘤中YAP蛋白水平升高，促進黑素瘤細胞對VEM的耐藥性[20]。本研究結果顯示，ARG組A375/VEM細胞中LATS1和p-YAP水平高于VEM組，YAP表達低于VEM組，而ARG+VEM組細胞中LATS1和p-YAP水平高于ARG組，YAP表達低于ARG組，揭示了ARG可以通過激活耐藥細胞A375/VEM中的Hippo途徑中LATS1的表達，促進YAP的磷酸化，進而使YAP降解并失活。為了明確Hippo途徑在ARG抑制A375/VEM細胞耐藥性過程中的作用，進一步加入Hippo途徑的抑制劑，結果顯示ARG對A375/VEM細胞耐藥性的抑制作用被逆轉，提示了ARG抑制黑素瘤細胞耐藥性的作用機制可能與Hippo信號通路被激活有關。最后本研究通過裸鼠移植瘤實驗，進一步驗證了ARG可以抑制體內黑素瘤細胞對VEM的耐藥性。

綜上所述，ARG可能是通過激活Hippo途徑來抑制黑素瘤細胞的耐藥性。本研究為黑素瘤細胞對BRAF抑制劑的耐藥性提供了新的治療藥物和抗耐藥機制。但黑素瘤細胞的耐藥機制比較復雜，本研究僅選擇一種BRAF抑制劑進行實驗，關于黑素瘤細胞對其他化療藥物的耐藥性還需更多的研究進行探索。

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[收稿日期]2023-08-10

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