天津地區魚源氣單胞菌耐藥性及耐藥基因分布特征

中圖分類號：S941.42

文章編號：1002-0659（2025）04-0014-06

文獻標識碼：A

氣單胞菌是一類革蘭氏陰性桿菌，在水環境中廣泛存在，是一種條件致病菌，能引起多種水生動物疾病，如氣單胞菌敗血癥、腸炎、打印病等，尤其以細菌性敗血癥最為嚴重，該病暴發迅速，一旦暴發往往造成巨大損失。目前，氣單胞菌可分為20多個種，常見的有嗜水氣單胞菌（Aeromonashyd rophilae）、維氏氣單胞菌（A.veronii）、溫和氣單胞菌（A.sobria）、豚鼠氣單胞菌（A.caviae）、殺鮭氣單胞菌（A.sa Im onicida）等。

抗生素是治療水產養殖動物細菌性疾病的一種主要藥物。在實際使用藥物過程中，由于盲目、濫用、超劑量使用抗生素或者休藥期不合規等問題，導致水產養殖動物出現耐藥性和藥殘超標等現象經常發生。水產養殖環境中的細菌在抗生素選擇性壓力的誘導下逐漸表現出耐藥性、多重耐藥性以及交叉耐藥性[4。在防治水生動物由氣單胞菌引起的細菌性疾病時，抗菌藥物仍然是防治這類病害的重要選擇，這導致氣單胞菌的耐藥性問題日益嚴重，并且產生了多重耐藥菌株，嚴重影響水產品質量安全，對水環境及人體健康造成危害，同時也給水產養殖業帶來了嚴重的經濟損失。因此，細菌耐藥性監測和研究細菌耐藥性機制仍然是水產業發展的重要課題。

隨著天津地區水產養殖業的發展，人們越來越重視綠色健康的水產養殖模式，但對于以氣單胞菌為代表的細菌性疾病的頻繁暴發，漁民對治療此類病害仍然以抗菌藥物為首選，這導致天津地區水產養殖源氣單胞菌長期產生耐藥性，并因地域不同而存在差異。由于氣單胞菌對抗菌藥物抗性的增強，且具有耐藥性增強和多重耐藥的趨勢，因此，急需分析天津地區氣單胞菌的耐藥性特征，以提高防治的針對性。本研究以天津地區魚源氣單胞菌為對象，對其藥物敏感性、最小抑菌濃度（MIC）、耐藥基因分布特征進行分析，旨在掌握天津地區水產養殖過程中氣單胞菌的耐藥情況，有針對性地指導漁民科學精準用藥，為預防控制天津地區水產養殖源氣單胞菌提供參考。

1材料和方法

1.1試驗材料

在天津市寧河區、寶坻區、薊州區、靜海區、北辰區、東麗區、西青區、津南區、武清區的水產養殖池塘，共收集行動緩慢、體色發紅的草魚、鯽魚、鯉魚、觀賞魚、血鸚鵡等30 個樣本作為試驗材料，涉及每種魚類取腎臟、肝臟、脾臟組織樣本（表1）。

表1調查樣本信息

1.2試驗方法

1.2.1細菌的分離與鑒定在無菌條件下解剖魚類樣本，取肝、脾、腎部位，于腦心浸液瓊脂（BHIA）培養基上進行劃線分離，28C恒溫培養 18h ，觀察培養基中的菌落形態，挑取優勢單菌落，在營養瓊脂（NA）平板上純化，獲得單菌落純培養物，采用梅里埃VITEK2微生物鑒定系統對其進行生化鑒定。

1.2.2氣單胞菌藥物敏感性測定采用K-B紙片擴散法對菌株進行6類8種抗菌藥物敏感性測定。挑取純化后的單個菌落放入無菌生理鹽水中，將菌懸液調至0.5個麥氏濁度（相當于 ），使用滅菌好的棉拭子蘸取菌懸液將其均勻涂抹在MHA培養皿上，用無菌鑷子夾取藥敏紙片，分別輕輕貼于涂有菌懸液的培養基表面，置于28℃恒溫培養箱中培養24h，測量并記錄抑菌圈直徑大小，根據8種抗菌藥物含量及判定標準[5]（表2）進行氣單胞菌藥物敏感性測定。

表2K-B紙片擴散法藥敏試驗結果判定標準

1.2.3病原菌最低抑菌濃度的測定采用復星診斷科技（上海）有限公司生產的藥敏板對病原菌進行恩諾沙星等8種藥物MIC的測定，并以大腸埃希菌（Escherichiacoli）ATCC25922作為質控菌株。

使用SPSS軟件計算各抗菌藥物對分離菌株的最低抑菌濃度（ MIC₅₀ 和 MIC_90. ）。參照CLSLM100S（第26版）的判斷標準（表3）判定細菌對抗菌藥物的感受性。

1.2.4氣單胞菌耐藥基因的檢測采用水煮法進行DNA模板的制備。取 滅菌超純水放入離心管，挑取純化后的單個菌落，放入盛有滅菌超純水的離心管中，混勻制成菌懸液，在沸水浴中加熱 10m in，用 5000r?min^-1 離心機離心 3m in，取上清液作為模板備用。使用PCR方法對氣單胞菌耐藥基因進行檢測，所用引物見表4。

表3抗菌藥物體外敏感性判定折點 單位： μg?mL^-1

表4耐藥基因引物序列

PCR反應體系 mastem ix （2×） ， ；Nuclease-Free水， ；F （10μM ）， 2.5μL ; C （10μM ）， ；DNA模板， 。

PCR反應條件：94℃預變性 5m in；94℃變性 40s ；退火 40s ：， 延伸 1m in，變性、退火和延伸循環30次； 終延伸 10m in。

所有PCR產物均用 1%～1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量（電壓110V， 30m in），在凝膠成像系統中觀察并拍照記錄，送至蘇州金唯智生物科技有限公司天津分公司測序，測序結果在 GenBank 中進行BLAST對比分析。

2結果與分析

2.1氣單胞菌生化鑒定結果

從天津地區養殖魚類中共分離出氣單胞菌30株。經生化鑒定，30株氣單胞菌中，溫和氣單胞菌為11株，嗜水氣單胞菌為9株，維氏氣單胞菌為5株，豚鼠氣單胞菌為5株（圖1）。

圖1調查樣品氣單胞菌分類統計

2.2氣單胞菌藥物敏感性測定結果

從分離出的30株氣單胞菌的藥敏試驗結果來看，僅有2株氣單胞菌對8種抗菌藥物沒有產生耐藥性，有11株氣單胞菌對1種藥物耐藥，占全部菌株的 36.67% ；對2種及2種以上抗菌藥物耐藥的氣單胞菌共有17株，占全部菌株的 56.67% ；對3種及3種以上抗菌藥物耐藥的氣單胞菌占全部菌株的 26.67% （表5、圖2），說明氣單胞菌在天津地區已經出現耐藥甚至多重耐藥的情況。

表5調查樣品氣單胞菌藥敏試驗結果

圖2調查樣品氣單胞菌耐藥種數統計

2.3病原菌最低抑菌濃度的測定結果

根據MIC值判定氣單胞菌對抗菌藥物的感受性（表6）。研究顯示，氣單胞菌對新霉素和多西環素的敏感率最高，均為 90.00% ，其次為對甲氧芐啶/磺胺甲惡唑和恩諾沙星的敏感率，分別為 86.67% 和 83.33% ，對磺胺間甲氧嘧啶的敏感率最低，為 43.33% 。氣單胞菌對磺胺間甲氧嘧啶和甲礬霉素的耐藥率較高，分別為 56.67% 和 30.00% ，其次為對氟苯尼考的耐藥率，為 20.00% ，對恩諾沙星、新霉素、多西環素耐藥率最低，均為 6.67% ，且30株氣單胞菌對恩諾沙星、多西環素、新霉素的M IC₉₀ 分別為 1.44? 3.89? 4.20μg?mL^-1 。以上數據表明，恩諾沙星、新霉素、多西環素3種藥劑均可用來治療由氣單胞菌引起的魚類疾病。

表6調查樣品氣單胞菌對不同抗菌藥物的MIC50和MI90

2.4調查樣品氣單胞菌耐藥基因的檢測結果

對30株氣單胞菌的耐藥基因檢測發現，喹諾酮類 耐藥基因檢出率最高，為 60.00% ：其次是氯霉素類耐藥基因floR和抗葉酸類耐藥基因sul2，檢出率為 40.00% 和 33.33% 。此外，四環素類耐藥基因tetA檢出率為 23.33% ，te tC檢出率為 13.33% ，喹諾酮類耐藥基因qnrA檢出率為 13.33% ，氨基糖苷類耐藥基因strA-strB檢出率為 3.33% 。未檢出 β 類酰胺類耐藥基因blaSHV 、 bla0XA 和 、四環素類耐藥基因tetB、喹諾酮類耐藥基因qnrB和抗葉酸類耐藥基因sull（圖3）。

在30株氣單胞菌中，有1株氣單胞菌所攜帶的耐藥基因最多，為5種，占全部菌株的3.33% ，此菌株是從寶坻區養殖鯽魚中分離出的溫和氣單胞菌；有5株氣單胞菌未檢測出耐藥基因，占全部菌株的 16.66% ；攜帶1種耐藥基因的氣單胞菌最多，有8株，占全部菌株的26.66% ；攜帶2種及2種以上耐藥基因的氣單胞菌有17株，占全部菌株的 56.67% 。

圖3調查樣品氣單胞菌基因組耐藥基因的檢出率

3結論與討論

大部分淡水魚類細菌性敗血癥的主要病原是氣單胞菌屬細菌，普遍認為氣單胞菌感染會導致魚類敗血癥、潰瘍和出血性疾病，引發魚類的大量死亡，從而損害水產養殖業的經濟效益。本試驗分離出的30株氣單胞菌在天津地區各個涉漁區均有分布，對天津地區的水產養殖業影響較大。從30株氣單胞菌對8種抗菌藥物的耐藥率來看，對磺胺甲惡唑和新霉素的耐藥率最高，均為 53.33% ，其次是對恩諾沙星的耐藥率，為 43.33% ，對氟苯尼考的耐藥率為23.33% ，對磺胺異惡唑的耐藥率為 16.67% 。從整體上看，氣單胞菌對 β- 內酰胺類抗菌藥物耐受濃度低，對氨基糖類和某些磺胺類抗菌藥物耐受濃度高。本研究顯示，大部分氣單胞菌對磺胺類抗菌藥物不敏感，北京市、江蘇省等地試驗表明，氣單胞菌對磺胺類抗菌藥物也有很高的耐藥性，與本研究結論一致，這可能與平時養殖時使用大量磺胺類抗生素有關。林居純等研究表明，氣單胞菌對β-內酰胺類抗菌藥物已產生嚴重的耐藥性，但本研究發現，氣單胞菌對β-內酰胺類抗菌藥物最敏感，說明不同地區分離的氣單胞菌對同一藥物的敏感性不同。因此，應有針對性地科學使用抗菌藥物。

對30株氣單胞菌的MIC分析顯示，30株氣單胞菌對恩諾沙星、多西環素和新霉素的M IC₉₀ 分別為1.44、3.89、 ，且30株氣單胞菌對新霉素、多西環素的敏感度最高，耐藥率最低，對恩諾沙星的敏感度次之，對磺胺間甲氧嘧啶、甲砜霉素比較耐藥。趙賢亮等[0]研究表明，嗜水氣單胞菌HNAh01對恩諾沙星等出現敏感性，對磺胺類抗生素均表現出較高的耐藥性；張仁展等[1試驗結果顯示，氣單胞菌菌株對恩諾沙星敏感率較高。本試驗與其他地區的研究結果一致。

本研究結果顯示，攜帶2種及2種以上耐藥基因的氣單胞菌有17株，占全部菌株的56.67% 。對喹諾酮類耐藥基因qnrS的檢出率最高，其次為氯霉素類耐藥基因floR和抗葉酸類耐藥基因suI2，由此可見，喹諾酮類、氯霉素類、抗葉酸類基因在天津地區水產養殖源氣單胞菌中的檢出率較高。王巧煌研究發現，酰胺醇類floR為氣單胞菌的主要耐藥基因，檢出率為100% 。國內外關于氣單胞菌耐藥基因的相關研究表明，喹諾酮類、氯霉素類、抗葉酸類基因在水產養殖源氣單胞菌中也具有優勢，與本研究結果基本一致[3]。將氣單胞菌的耐藥表型與基因型進行對比發現，除β-內酰胺類外，所有氣單胞菌菌株的耐藥表型與其耐藥基因型之間均存在差異，氨基糖苷類、抗葉酸類抗菌藥物的基因型陽性菌株均比耐藥表型陰性菌株多，具體原因仍需進一步探討。

本研究表明，對2種及2種以上抗菌藥物耐藥的氣單胞菌菌株高達 56.667% ，說明氣單胞菌已經在天津地區出現耐藥和多重耐藥的情況，需引起水產養殖業的高度重視。由此建議使用新霉素和多西環素來防治天津地區水生動物因氣單胞菌引起的疾病最為合適，其次為恩諾沙星藥物。

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