西瓜枯萎病拮抗菌Pseudomonasaeruginosa的鑒定及防病促生作用

中圖分類號：S651 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2025）07-1557-11

Abstract： 【Objective】 Watermelon fusarium wilt， caused by Fusarium oxysporum f. sp. niveum （Fon1），is a serious disease that causes significant yield lossand threatens the development of watermelon industry.Effectivenessof chemical pesticides in control of watermelon fusariumwilt is currently not satisfactory.Thus，there is an urgent demand to explore other effective strategies.This study aimed to screen outeffective antagonistic strains for biocontrol of watermelon wilt disease.【Methods】Antagonistic bacterial strains were isolated from watermelon rhizosphere soil.The antagonistic effect of the isolated strains on Fon and other pathogenic fungi was detected using a plate confrontation test. Pot experiments were conducted to investigate the biocontrol capacity of the bacterial strains against watermelon wilt disease.Growth- promoting activity of the antagonistic strains was also explored in terms of plant height，leaf number，dry and fresh weights of both aboveground and underground parts of the plant. The obtained antagonistic bacterial strains were identified using molecular tools and biochemical assays. 【Results】The strain K5 had a significant impact on hyphae in dish，and the inhibition rate ofFon-1 was （204號 75.31% . K5 had a significant inhibitory effect on seven other watermelon and melon crop pathogens in dish.The poted experiments showed that the K5 had a good antagonistic effect on Fon， with a control effect of 78.95% . The pot experiment showed that K5 had a 78.95% control effect on Fon-1，and had a significant growth-promoting effect. The plant heights，leaf numbers，aboveground and underground dryweights，root lengths，and aboveground and underground fresh weights increased significantly， while there was no diference in stem thickness.Analysis of phylogenetic trees showed that the strain K5 was Pseudomonas aeruginosa based on the 16S rDNA and rpob gene sequences.Biological characteristics analysis revealed that K5 produced siderophores and hydrogen cyanide.It also had enzymatic activities such as cellulase， chitinase，and β. -1-3 glucanase. Moreover， the genes related to hydrogen cyanide，phenazine-1-carboxamide， and nitropyrrolin were amplified from the K5 genome. 【Conclusion】 In summary，K5 had a good control eect on watermelon wilt disease and promoted the growth of watermelon seedlings.It willbe a highly potential strain for developing a biocontrol agent.

Key Words： Watermelon; Fusarium oxysporum f. sp. niveum （Fon-1）; Pseudomonas aeruginosa; Biological control

西瓜是中國重要的經濟作物之一，但連年種植易導致西瓜枯萎病危害加劇，發病率顯著升高，嚴重時超過 50%^[1] 。西瓜枯萎病由尖孢鐮孢菌西瓜專化型（Fusarium oxysporum f.sp.niveum，Fon）侵染引起，是典型的土傳病害2。西瓜整個生育期都能發病，其中伸蔓期到結瓜期發病最嚴重。發病時，西瓜植株萎蔫，莖基部變褐，嚴重時整株枯死[3。目前化學藥劑防治效果不佳，因此開發具有抗菌活性的生防菌株對西瓜枯萎病的防治具有重要意義。

拮抗菌對西瓜枯萎病的抗病研究近年來有不少報道。枯草芽孢桿菌IBFCBF-4盆栽條件下西瓜枯萎病的發病率下降 51.1%^[4] ；枯草芽孢桿菌YZU-S149可產嗜鐵素、纖維素酶和蛋白酶，盆栽試驗對西瓜枯萎病的防治效果達 75.87%^[5] ；枯草芽孢桿菌HBKYB-5對西瓜枯萎病菌的抑菌率達 56.82% ，同時顯著提高幼苗株高、莖粗、地上部與地下部鮮（干）質量、葉綠素含量及根系活力。此外，芽孢桿菌XY-13和熒光假單胞菌P4組合能夠提高西瓜枯萎病抗性，并促進西瓜幼苗生長，提高土壤有效性養分。貝萊斯芽孢桿菌WB株系能夠誘導西瓜對枯萎病的系統抗性[8。解淀粉芽孢桿菌DHA6通過激發抗氧化酶活性從而產生對西瓜枯萎病的抗性，并且對西瓜幼苗具有明顯的促生作用。盡管銅綠假單胞菌作為生防菌已有不少研究報道[10-18]，但其針對西瓜枯萎病的拮抗作用尚未見相關研究。

筆者從西瓜連作大棚根際土壤中篩選對西瓜枯萎病菌有優異拮抗性能的菌株，分析其抑菌作用，明確其對西瓜枯萎病菌的防病作用及對西瓜的生長促生效果，通過分子生物學鑒定其種類，并在此基礎上分析其生物學特性、探究其可能的抗菌作用，以期為西瓜枯萎病的生物防治提供理論依據和技術基礎。

1 材料和方法

1.1材料

土樣采集：從連作超過10a（年）的西瓜塑料大棚中采集西瓜枯萎病發病植株的根際土壤。

供試西瓜品種：早佳8424。

病原菌：尖孢鐮孢菌西瓜專化型（Fusariumoxysporumf.sp.niveum）生理小種Fon-1。

1.2 方法

1.2.1病原菌的活化、根際土壤拮抗菌株分離及純化病原菌活化：取 ?^-80°C 保存的Fon-1，置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板培養基（PotatoDextroseAgar，PDA）上， 28^°C 培養。

菌株分離：土樣過篩，用梯度稀釋涂布法分別稀 釋至 ψ.1×10^-1，1×10^-2，1×10^-3，1×10^-4，1×10^-5，1×10^-6，1×

10^-7 ，分別取 100μL 的 1×10^-3，1×10^-4，1×10^-5 的土壤稀釋液均勻涂布于含有 50μg?mL^-1 重鉻酸鉀的高氏一號培養基平板、含 （50μg?mL^-1， 利福平的PDA培養基平板；將 100μL1×10^-5，1×10^-6，1×10^-7 的土壤稀釋液均勻涂布于NA培養基上， 28^°C 培養箱中倒置培養，隨時觀察挑出備用。

菌株的純化：采用劃線分離法純化菌株，挑取固體平板培養基上不同顏色、形態的單菌落劃線接種于NA培養基、高氏一號培養基、PDA培養基上重新培養， 28^°C 培養至長出單菌落[19]。

1.2.2拮抗菌株的篩選拮抗菌株篩選：采用平Ⅲ對崎法，以Fon-1為靶標菌，將Fon-1菌餅 （D=5mm ）接種在PDA平板中心，純化后培養的菌液接種于靶標菌中心上下左右 2.5cm 處，以接種菌株Fon-1菌餅為對照，每個處理3次重復。倒置培養在 28^°C 培養箱中，待對照菌株生長至滿皿時，挑選對Fon-1有顯著抑菌效果菌株。

菌絲生長抑制率 1%=1 （對照菌落半徑一處理菌落半徑）/（對照菌落半徑 -2.5mm）×100^[20] 。

1.2.3菌株K5對西瓜枯萎病菌菌絲抑制作用及抑菌譜測定菌株K5對西瓜枯萎病菌菌絲皿內抑制效果：將Fon-1置于PDA平皿中心，在距靶標菌2.5cm 處按照“十\"字形接種拮抗菌，以單獨接種Fon-1為空白對照。在 28^°C 培養箱中倒置培養，然后置于超深景顯微鏡下觀察，記錄菌絲特征。

抑菌譜測定：選取瓜類作物上常見的病原菌，按照上述方法進行K5的抑菌譜測定，每種病原菌5次重復，置于 28^°C 培養箱中倒置培養，待對照長滿培養血后計算抑菌帶寬。供試病原菌為瓜類腐皮鐮孢菌（Fusarium.solani）、多主棒孢病菌（Corynespora.cassiicola）、輪枝鐮孢菌（Fusariumverticillioides）、尖孢鐮孢菌甜瓜專化型（Fusarium oxysporum f.sp.melonis，Fom）、甜瓜疫霉（Phytophthoramelonis）、菜豆殼球孢（Macrophominaphaseolina）及瓜類炭疽病菌（Colletotrichumorbiculare）。

1.2.4菌株K5對西瓜幼苗的溫室防病、促生效果培育西瓜幼苗，待長到兩葉一心時，選擇長勢一致的西瓜幼苗采用蘸根法處理。每個處理30棵西瓜苗，3次重復。設置4個處理分別為（1）清水對照；（2）菌株K5懸浮液 （OD₆₀₀=1.0） ;（3）Fon-1培養液對照（濃度為 1.0× 10⁷CFU?mL^-1） ；（4）菌株K5懸浮液 （OD₆₀₀=1.0）+ Fon-1培養液對照（濃度為 1.0×10⁷CFU?mL^-1） 0

接種處理后第7天開始記錄發病情況，當只接種Fon-1培養液的植株發病率 550% 時開始調查各個處理植株的發病情況、生物量，計算病情指數、發病率和相對防效等。病害分級參照文獻[19]相關標準，共6個等級，分別為：0級，西瓜植株無任何發病癥狀；1級，西瓜植株整體生長良好，子葉邊緣黃化、皺縮，莖基部輕微變黃；2級，西瓜植株子葉萎蔫，莖基部變黃褐，莖部良好，能直立生長；3級，西瓜植株子葉明顯萎蔫，莖中度變褐萎蔫；4級，西瓜植株嚴重萎蔫，子葉、莖明顯萎蔫，莖部出現明顯變褐癥狀；5級，西瓜植株整株萎蔫、枯死或出苗晚，出苗后病死或長出菌絲。

病情指數 [各發病等級 × 各個級別發病株 數）/（植株總數 .× 最高病級數） 0

防治效果 1%=1 （對照病情指數一處理病情指數）/對照病情指數 ×100 0

1.2.5菌株K5在不同培養基上的形態特征及生物學特性參照東秀珠等[2的方法對菌株K5進行生物學特性鑒定，主要指標有：固氮能力、產蛋白酶能力、產纖維素酶能力、產氫氰酸（HCN）能力、產嗜鐵素能力、分解有機磷能力、分解無機磷能力及產IAA能力。

1.2.6菌株K5分子生物學檢測使用天根生化科技（北京）有限公司生產的細菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株K5的基因組DNA，選用16SrDNA基因通用引物（27F：5'-AGAGTTTGATCMTGGCT-CAG-3/1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）和rpob基因（rpob-F：5'-TGGCCGAGAACCAGTTCC-GC-3/rpob-R：5'-CGGCTTCGTCCAGCTTGTTC-3'）進行PCR擴增。PCR反應體系：DNA模板 2.0μL 2× TaqPCRMasterMix（諾唯贊P222-02） 12.5μL ， 正反向引物各 1.0μL ，加 至 25μL 。PCR反應條件： 95°C 3min C3min;95^°C30s;56^°C30s 72^°C30s（35 個循環）； 72^°C5min 。 1% 瓊脂糖電泳檢測，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將測序結果與NCBI中GenBank數據庫進行Blast比對分析，用MEGA11軟件的N-J法構建16SrDNA與rpob基因序列的系統發育樹。

1.2.7菌株K5抗生素合成基因分析、鑒定（1）引物設計。從菌株K5基因組中擴增抗生素2，4-DAPG合成基因、PCA相關的phzCD基因、吩嗪-1-甲酰胺（PCN）相關基因、硝吡咯菌素PRN相關基因及氫氰酸HCN相關基因，參照已發表的相關引物序列[21]（表1），并在生工生物工程（上海）股份有限公司合成。（2）抗生素合成基因的擴增與檢測。以菌株K5基因組為模板，利用表1引物擴增相關基因。PCR擴增體系 （25.0μL） 為： 2× TaqPCRMasterMix 12.5μL 10μmol ·L正反向引物各 1.0μL ，DNA模板 2.0μL 補 至 25μL 。PCR反應條件： 95^°C 預變性3min 95^°C 變性 退火 延伸40s（ 95^°C 變性、 58^°C 退火、 72^°C 延伸共35個循環）；72^°C 延伸 8min^[22] 。隨后用 1% 瓊脂糖水平電泳檢測，送公司測序。

1.2.8 數據處理 用Excel 和Graphpad prism進行數據處理，進行t-test檢測分析差異顯著性。

2 結果與分析

2.1土壤樣品拮抗菌株的分離、篩選

利用梯度稀釋法從連作10多年的西瓜土壤中

分離篩選菌株，通過平Ⅲ對峙獲得部分對西瓜枯萎病菌抑制效果好的菌株（圖1），筆者選取菌株K5深入研究。

2.2 菌株K5的抑菌作用

2.2.1 菌株K5對西瓜枯萎病菌的抑制作用菌株

K5對西瓜枯萎病菌的抑制作用明顯（圖2）。當Fon-1對照組平均半徑為 27.33mm 時（圖2-A），K5對西瓜枯萎病菌的抑制平均半徑僅約 8.63mm （圖2-B），Ⅲ內抑制率達 75.31% 。

2.2.2菌株K5對西瓜枯萎病菌菌絲的影響通過超景深三維立體顯微鏡觀察菌絲形態，發現經K5拮抗處理的菌絲出現菌絲扭曲變形、某些部位菌絲會斷裂或集結成團（圖3-A），局部可見菌絲出現膨大、縊縮、變粗等畸形形態（圖3-B）。對照組菌絲光滑、平直、整齊、有序、發散狀生長、粗細均勻（圖3-C～D）。對照菌絲直徑平均值約 3.57μm ，拮抗處理后菌絲直徑平均值約 5.49μm 。分析菌絲直徑的差異發現K5處理后的菌絲直徑與對照組菌絲在 plt; 0.0001水平上差異顯著（圖3-E）。

2.2.3菌株K5抑菌譜菌株K5對多種瓜類病原菌 孢菌 （F. solani）皿內抑制率為 99.99% 、對多主棒孢有明顯的抑制作用（圖4）。菌株K5對瓜類腐皮鐮 病菌（C.cassiicola）皿內抑制率為 85.88% 、對輪枝鐮

孢菌（ ?F. verticillioide）Ⅲ內抑制率為 83.41% 、對尖孢鐮孢菌甜瓜專化型血內抑制率為 70.46% 、對甜瓜疫霉（P.melonis）的皿內抑制率為 96.63% 、對菜豆殼球孢（M.phaseolina）Ⅲ內抑制率為 64.43% 、對瓜類炭疽病菌（C.orbiculare）Ⅲ內抑制率為 89.26% （表2）。

2.3菌株K5對西瓜幼苗的防病與促生效果

2.3.1菌株K5對西瓜幼苗的防病效果以枯萎病感病品種早佳8424為試驗品種，測定了菌株K5對西瓜枯萎病的防病效果（圖5）。Fon處理的植株病情指數為38，而菌株 K5+Fon 處理的西瓜幼苗的病情指數僅為8，防治效果達 78.95% 。2.3.2菌株K5對西瓜植株的促生效果 菌株K5#u的0e 福

對西瓜幼苗的促生試驗的結果顯示K5處理植株的高度明顯高于對照植株（圖6）。菌株K5處理的西瓜幼苗的根長、地上部鮮質量、地下部鮮質量與對照相比在 plt;0.05 水平上差異顯著，地上部干質量和地下部干質量與對照相比在 plt;0.01 水平上差異顯著；差異最為顯著的是株高、葉片數，在 plt;0.0001 水平上差異顯著；而莖粗的比較發現K5處理和對照間差異不顯著（表3）。株高、莖粗、葉片數、根長、地上部鮮質量、地下部鮮質量、地上部干質量、地下部干質量各項指標與對照相比分別增加 71.77% 、5.68%?36.21%?41.42%?26.47%?97.22%?23.40% 132.78% ，表明菌株K5對西瓜幼苗促生作用明顯。

2.4菌株K5分子生物學檢測

將16SrDNA和rpob基因的測序結果與GenBank中已登錄的核苷酸序列進行同源性比較，菌株K516SrDNA與銅綠假單胞菌 （P_? aeruginosa）（HQ537785.1、AB680318.1、AF094713.1、LC069033.1的同源相似度均為 100% ；rpob基因與（ （P_? aeruginosa，CP092846.1）的同源相似度為 100% 。利用MEGA11軟件構建菌株K5的16SrDNA（圖7-A）和rpob基因（圖7-B）的系統發育樹分析表明，菌株K5與 P. ae-ruginosa聚為一個分支（圖7），所以K5被確定為Pseudomonasaeruginosa。

2.5菌株K5的生物學特征

菌株K5在嗜鐵素試驗、固氮試驗、解無機磷試驗、幾丁質利用試驗、纖維素酶試驗、β-1-3葡聚糖酶試驗、HCN試驗中呈現陽性（圖8）。該菌株可產生嗜鐵素，有固氮、解無機磷的作用，具有纖維素酶、幾丁質酶和 β -1-3葡聚糖酶的活性，不產生生長素、不具備解鉀和解有機磷的能力（表4）。

2.6菌株K5抗菌物質合成相關基因的擴增

以菌株K5的基因組為模板，可擴增出氫氰酸A.β-1-3葡聚糖酶檢測培養基;B.嗜鐵素檢測培養基;C.HCN驗證培養基;D.纖維素酶檢測培養基;E.解無機磷鑒定培養基;F.幾丁質酶鑒定培養基；G.解有機磷鑒定培養基；H.固氮鑒定培養基。

HCN（587bp）、吩嗪-1-甲酰胺（PCN） 2000bp 和硝吡咯菌素基因PRN（786bp），但未擴增出吩嗪-1-羧酸 1100bp ）和2，4-二乙酰基間苯三酚（2，4-DAPG）中 745bp ）相關基因（圖9）。將擴增出的片段送樣測序、比對測序結果與原始設計引物的模板基因一致性均在 98% 以上，表明擴增的基因片段為目的基因片段，說明該引物可以作為檢測銅綠假單胞菌K5中4種抗生素相關基因的特異引物。該結果說明K5菌株可產生氫氰酸、吩嗪-1-甲酰胺和硝吡咯菌素。

3討論

西瓜一般在主產區連續多年栽培，所以普遍存在連作障礙現象[23]。連作后土壤中有益微生物種群數量減少，導致作物病害加重[24]。研究表明，土壤中有益微生物種群豐富且穩定是保障植物正常生長的重要條件[25]。自然界中生防微生物資源豐富且分布廣泛，許多功能多樣的有益微生物既可以抑制病原菌的生長和繁殖2，還能產生多種次級代謝產物促進植物的生長。生防微生物及代謝產物防病、促生長、對環境友好且可以減弱病原菌抗性[2。本研究從西瓜連作土壤里篩選到一株對西瓜枯萎病菌抑制作用明顯的菌株（K5），基于16SrDNA和rpob基因序列系統進化分析發現該菌是銅綠假單胞菌菌株。

假單胞菌屬的許多菌株不僅促生作用明顯，且具有較好的防病效果[28]。菌株K5與其他假單胞菌一樣，也具有固氮、解無機磷的作用[29]，其固氮能力可提高植物對氮源的吸收利用能力，促進植物生長[30。菌株K5明顯的促生作用可能與產生這些物質相關。此外，K5的抗病作用也很好，從其基因組中擴增出氫氰酸、吩嗪-1-甲酰胺和硝吡咯菌素三類抗菌物質基因，且從生物學特性發現該菌可產生氫氰酸物質。此外，假單胞菌主要產生酚嗪-1-羧酸、硝吡咯菌素、藤黃綠膿菌素和2，4-二乙酰基間苯三酚等[29]，K5和其他的假單胞菌相同，可能存在吩嗪-1-甲酰胺和硝吡咯菌素等抗菌物質的合成途徑。假單胞菌產生嗜鐵素、纖維素酶和蛋白酶等物質抑制病原菌的生長繁殖[3，K5亦可產生嗜鐵素，具有纖維素酶、幾丁質酶和 β -1-3葡聚糖酶的活性；蛋白酶、纖維素酶、嗜鐵素和HCN可單獨或復合抑制病原菌的擴展[32]，誘導植物激活免疫應答反應[33]。推測這些酶或許可破壞菌絲的結構，使菌絲不能更好地侵染，從而起到防治病害的作用。這種基于酶解作用的抗真菌機制，在分子水平上揭示了K5菌株通過干擾病原菌形態建成過程實現生物防治。

生防菌成為潛在菌肥資源的重要前提是具有較好的拮抗效果。銅綠假單胞菌M18可抑制甜瓜蔓枯病菌生長[34]，且該菌浸泡黃瓜種子以及灌根試驗中，使黃瓜枯萎病的病害發生率降低 70%～80%^135] 。銅綠假單胞菌Bc1-20促進甜瓜生長，且對甜瓜幼苗枯萎病的相對防治效果為 52.34%^[11] 。相較之下，K5對西瓜幼苗枯萎病的盆栽防治效果可達 78.95% 。此外，菌株K5對西瓜幼苗的促生效果顯著，其處理使株高、莖粗、葉片數、根長、地上部鮮（干）質量及地下部鮮（干）質量等各指標顯著升高，尤其在地下部生物量積累方面表現突出。結合K5對多種瓜類病原菌的廣譜抑菌活性，其展現出開發為復合生物菌劑的潛力。后續需進一步驗證其田間防效，并深入解析其對枯萎病菌的分子防控機制，以推動西瓜枯萎病的精準防控策略構建。

4結論

本研究篩選出1株對西瓜枯萎病菌具有顯著拮抗作用的銅綠假單胞菌菌株（K5）。該菌株可導致病原菌菌絲畸形膨大、扭曲，具有明顯的促生和防病作用，且具有多種生物學特性，是一株極具開發潛力的生防菌劑候選菌株，為構建基于拮抗微生物的植物病害生物防治技術體系提供了理論依據。

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