不同精液稀釋液配方對湖羊精液保存效果的影響研究

中圖分類號：S826

文獻標識碼：A

綿羊人工授精技術能精準控制綿羊輸精時間和精液質量，提高優異種公羊的使用價值和精液使用范圍，是實現羊只擴繁、提高羊群質量、促進羊產業振興等的重要手段[。在綿羊人工授精過程中，精液保存是其中的重要環節，對綿羊人工授精質量有決定性影響。綿羊精液長效保存方法主要有低溫（ ）液態保存和超低溫（-196℃）冷凍保存2種。冷凍保存是綿羊精液最直接有效的方法，但該方法經濟投入較大，對操作人員的專業能力要求較嚴格，并且綿羊精子質膜富含不飽和脂肪酸，其頂體膜和原生質對溫度敏感，易在降溫時發生冷休克，導致綿羊精液冷凍損傷和受精能力下降[-3]。受冷凍保存技術限制及成本因素的影響，當前綿羊精液長期保存多采用低溫保存方法，即將綿羊原精液與精液稀釋液（用于人工授精或精子保存的專用溶液，其成分通常包括能源物質、緩沖物質、抗菌物質等）按一定比例等溫稀釋混勻后，用棉花或紗布包裹，置于恒低溫條件下保存。研究表明，4℃低溫保存可顯著抑制綿羊精子代謝，通過優化精液稀釋液配方（添加益母草堿、維生素C等）和保存條件（篩選保存管、降溫程序等）措施，能有效延長綿羊精子存活時間，且溫度恢復后，綿羊精子代謝功能與受精能力可逆-7]。但 10° 以下易誘發綿羊精子冷休克，需在精液稀釋液中添加保護劑以減輕綿羊精子的低溫損傷]。

綿羊精液低溫保存的調控因素主要有精液稀釋液滲透壓、pH、降溫速率及微生物污染等。國內外在綿羊精液低溫保存稀釋液配方上存在差異，其核心成分（如能源物質、緩沖物質、抗菌物質等）旨在維持綿羊精子活率、活力并延長保存時間8-9]，使綿羊精子能夠有效保存（20 3～8d ，活力仍不低于 0.6^[10-11] 。湖羊是中國特有的地方綿羊品種，具有耐粗飼、抗病性強等特點，本研究旨在通過探討不同精液稀釋液配方對湖羊精子活力、頂體及質膜完整率等指標的影響，篩選出4℃條件下湖羊精液保存最優、成本較低且操作簡便的精液稀釋液配方，以期為實際應用提供參考。

1材料和方法

1.1試驗材料

1.1.1試驗動物湖羊，由基地飼養并提供。

1.1.2主要儀器設備全自動精子質量分析儀與配套顯微鏡，由廣東豬仙子繁育科技有限公司生產；智能恒溫水浴鍋，由貴州恩誼科技有限公司生產。

1.1.3主要試劑葡萄糖、檸檬酸鈉、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、果糖等，均由北京索萊寶科技有限公司生產；卵黃，取自新鮮雞蛋；鹽酸林可霉素，由華中藥業股份有限公司生產；成品精液稀釋液0ptidyl（以下簡稱“成品精液稀釋液”），由上海卡蘇生物科技有限公司生產;吉姆薩染液，由上海碧云天生物技術股份有限公司生產。

1.2試驗設計

試驗共設5個湖羊精液稀釋液配方，分別為配方1：葡萄糖 3.77g 、檸檬酸鈉 1.57g 、卵黃 14mL 、鹽酸林可霉素 、蒸餾水 85.9mL ；配方2：葡萄糖 3.10g 、檸檬酸鈉 1.40g 、卵黃 20mL 、鹽酸林可霉素100μL 、蒸餾水 79.9mL ；配方3：葡萄糖 1.14g ，檸檬酸鈉 1.55g 、Tris 3.04g 、卵黃 20mL 、鹽酸林可霉素 100μL 、蒸餾水 79.9mL ；配方4：葡萄糖 3.10g 、檸檬酸鈉 1.40g 、鹽酸林可霉素 、蒸餾水 99.9mL ；配方5（對照，CK）：成品精液稀釋液。其中配方1、配方2、配方3、配方4均為本試驗自制的湖羊精液稀釋液（表1）。

表1湖羊精液稀釋液配方成分

1.2.1成品精液稀釋液不同稀釋比例對湖羊精子品質的影響試驗設4個成品精液稀釋液比例，即湖羊精液原液與成品精液稀釋液比例分別為：1：7.1：28.1：56.1：112 ，檢測成品精液稀釋液不同稀釋比例對湖羊精子品質的影響。

具體做法：將試驗所用的成品精液稀釋液提前放入37℃水浴鍋中預熱（與湖羊精液原液溫度保持一致），將采集并檢測合格的湖羊精液原液充分混勻，分別取 100μL 混勻的湖羊精液原液置于不同的離心管中，按1.2.1設計分別進行等溫稀釋混勻，放置于 水浴鍋中穩定3m in，用全自動精子質量分析儀檢測湖羊精子活率、活力、A級精子數以及B級精子數。

1.2.2不同配方精液稀釋液不同保存時間對湖羊精子活力的影響試驗采取二因素隨機區組設計，精液稀釋液設配方1、配方2、配方3三種自制稀釋液及成品精液稀釋液（對照，CK）4個處理，湖羊精液保存時間設0、24、48、72h4個處理。

具體做法：將試驗所用的不同配方湖羊精液稀釋液提前放置于37℃水浴鍋中預熱，按1.2.2設計，將湖羊精液原液分別與4種配方精液稀釋液按 1：3 的比例等溫稀釋，即每處理取 0.5mL 湖羊精液原液，置于2mL無菌離心管中，分別緩慢加入 1.5mL 四種配方精液稀釋液，混勻后冷卻至室溫。用棉花將稀釋后的湖羊精液樣品進行多層包裹，置于4C冰箱中緩慢降溫備用，按1.2.2設計分別保存0、24、48、72h 后，采用全自動精子質量分析儀檢測湖羊精液中的精子活力。

1.2.3不同配方精液稀釋液對湖羊精子形態的影響試驗設2個精液稀釋液處理，分別為配方2稀釋液、成品精液稀釋液（對照，CK）。

具體做法：將試驗所用的2種配方精液稀釋液提前放置于37℃水浴鍋中預熱，按1.2.3設計將湖羊精液原液分別與2種配方精液稀釋液按 1：3 的比例等溫稀釋，混勻后冷卻至室溫。用棉花將稀釋后的湖羊精液樣品進行多層包裹，置于4℃冰箱中緩慢降溫備用。保存 72h 后，分別檢測湖羊精液中精子頂體完整率和質膜完整率。

1.2.4添加卵黃的精液稀釋液及不同保存時間對湖羊精子活力的影響試驗采取二因素隨機區組設計，精液稀釋液配方設2個處理，分別為配方2（添加卵黃）、配方4（未添加卵黃），湖羊精液保存時間設0、24、48、72h4個處理。

具體做法：將試驗所用的2種配方精液稀釋液提前放置于37℃水浴鍋中預熱，按1.2.4設計將湖羊精液原液分別與2種配方精液稀釋液按 1：3 的比例等溫稀釋，混勻后冷卻至室溫。用棉花將稀釋后的湖羊精液樣品進行多層包裹，置于4℃冰箱中緩慢降溫備用。按1.2.4設計分別保存0、24、48、72h后，用全自動精子質量分析儀檢測湖羊精液中的精子活力。

1.3試驗管理

1.3.1精液采集選取3只健康狀況良好、2歲齡、體質量相近的湖羊作為試驗對象，每次均使用假陰道法采集湖羊精液，采集完成后快速觀測精液色澤、精液量，隨后立即置于37℃保溫箱內避光保存，并于 10m in內送至實驗室進行精子活力和密度檢測，精子活力 ?0.8 （或80% ）、精子密度 ?2×10⁹ 個·mL^-1 的精液為合格精液，合格精液可作為試驗材料。

1.4測定指標及方法

1.4.1精子品質從湖羊精液原液樣品中各取30μL 精液原液，與各組試驗設計的 400μL 相應配方的精液稀釋液等溫混勻，稀釋至檢測密度（約 0.4×10⁸ 個 ?mL^-1 ），隨后將湖羊精液混合液置于37℃水浴鍋中 3min ，再次搖勻后，取出 6μL 湖羊精液混合液樣品滴加于潔凈載玻片上，緩慢傾斜蓋上蓋玻片，確保載玻片下無氣泡。將制備好的載玻片樣本置于帶熱臺的光學顯微鏡下，采用全自動精子質量分析儀檢測湖羊精子活力、活率、A級精子數（ 時，精子平均路徑速度 、B級精子數（ 時， 25μm?σ^-1gt; 精子平均路徑速度 。

1.4.2精子頂體完整率分析 采用姬姆薩（G iem sa）染色法分析精子頂體完整率。將湖羊精液原液稀釋50倍后，取 10μL 均勻涂布于載玻片上，制備成涂片。涂片自然晾干或烘干后，用 10% 福爾馬林溶液固定 10m in，隨后沖洗膠頭滴管，自然晾干。將晾干的涂片平放，取 400μL 姬姆薩染液均勻涂抹在載玻片上，染色 1.5～2h ，后用蒸餾水沖洗，自然條件下晾干。將制備好的載玻片置于顯微鏡下觀察，統計至少200個精子中頂體完整的數量，計算其占總精子數的比例。每組樣品重復測定3次，取平均值。精子頂體完整率計算公式：

頂體完整的精子數精子頂體完整率 （%）= ×100 總精子數

1.4.3精子質膜完整率分析利用低滲腫脹試驗（H0ST）對精子質膜的完整性進行分析。低滲液配制方法：分別稱量檸檬酸鈉 0.25g 、果糖0.45g ，加入適量雙蒸水，充分攪拌至完全溶解后，使用 0.22μm 無菌濾膜過濾，定容至 50mL 容量瓶中，制成低滲液。將湖羊精液原液稀釋50倍后，取 20μL 稀釋后的精液置于1mL離心管中，再緩慢加入 200μL 等溫低滲液，在37℃水浴鍋中孵育 30m in。孵育結束后，取10μL 混合液均勻涂布于載玻片上，自然晾干。將干燥后的載玻片置于顯微鏡下觀察，統計至少200個精子中出現彎尾現象的精子數量，計算其占總精子數的比例。每組樣品重復測定3次，取平均值。精子質膜完整率計算公式：

彎尾精子數精子質膜完整率（ （% ）= ×100 總精子數

1.5數據統計及分析

采用SPSS22.0軟件進行方差分析（ ）；采用最小顯著性差異法（LSD）進行多重比較，結果以“平均值 ± 標準差”表示， Plt;0.05 表示差異顯著， Plt;0.01 表示差異極顯著； Pgt;0.05 表示差異不顯著。

2結果與分析

2.1成品精液稀釋液不同稀釋比例對湖羊精子品質的影響

成品精液稀釋液不同稀釋比例對湖羊精子質量的影響較顯著，湖羊精液稀釋比例過小或過大時，均對湖羊精子活力產生顯著影響（ Plt; 0.05）（圖1）。其中，當湖羊精液原液用成品精液稀釋液稀釋7倍和28倍時，由于精子密度相對較大，精子運動空間受限，使湖羊精子活力偏低；而當湖羊精液原液用成品精液稀釋液稀釋112倍時，視野中的精子數量較少，精子活率、活力及A級精子數均顯著下降（ Plt; 0.05），B級精子數則顯著升高（ ）；當湖羊精液原液用成品精液稀釋液稀釋56倍時，精子之間的運動干擾較小，且精子活力達到最高值 92.30% ，此時對應的精子密度約為0.4億個·mL^-1 。

圖1成品精液稀釋液不同稀釋比例對湖羊精子品質的影響

注：圖中肩標不同小寫字母表示差異顯著（ ）；不同大寫字母表示差異極顯著（ Plt;0.01 ）；無肩標表示差異不顯著（ ）。

2.2不同配方精液稀釋液不同保存時間對湖羊精子活力的影響

湖羊精子活力隨保存時間延長而逐漸降低（圖2）。在分別保存0、24、48、72h后，配方2與成品精液稀釋液處理比較，二者的湖羊精子活力均無顯著差異（ ?Pgt;0.05 ），而配方3處理的湖羊精液在保存時間為0h時，其精子活力已極顯著下降（ ），保存 24h 后，其精子活力幾乎降為0。在保存時間為0h時，配方1和配方2與成品精液稀釋液處理比較，湖羊精子的活力沒有差異（ Pgt;0.05 ）；當保存時間延長至 72h 時，配方1、配方2、成品精液稀釋液處理的湖羊精子活力均高于0.6，滿足湖羊鮮精輸精標準，但配方2處理的湖羊精子活力為 71.08% ，而成品精液稀釋液處理的湖羊精子活力為 71.12% 。與成品精液稀釋液比較，配方2更接近實際保存效果，且其成分簡單、易配制，因此后續研究選擇配方2作為湖羊精液稀釋液。

圖2不同配方精液稀釋液不同保存時間對湖羊精子活力的影響

注：圖中肩標不同小寫字母表示差異顯著（ ；不同大寫字母表示差異極顯著（ ?Plt;0.01 ）；無肩標表示差異不顯著（ ?Pgt;0.05 ）。

2.3不同配方精液稀釋液對湖羊精子形態的影響

由圖3可知，在湖羊精液稀釋液保存 72h 后，配方2處理的湖羊精子頂體完整率為80.39% ，質膜完整率為 60.72% ；成品精液稀釋液處理的湖羊精子頂體完整率為 78.87% ，質膜完整率為 61.28% 。2個配方精液稀釋液處理比較，二者的湖羊精子頂體完整率和質膜完整率均無顯著差異（ （Pgt;0.05 ），這說明在4℃保存條件下，本研究自制的配方2稀釋液可以替代成品精液稀釋液來保存湖羊精液。

圖3不同配方精液稀釋液對湖羊精子形態的影響

2.4添加卵黃的精液稀釋液及不同保存時間對湖羊精子活力的影響

由圖4可知，在保存0、24、48、72h后，配方2處理（添加卵黃）的湖羊精子活力分別為92.30% 、 84.64% 、 78.02% 、 75.20% ，配方4（未添加卵黃）處理的湖羊精子活力分別為 85.70% 168.46%，53.16%，27.78% ，添加卵黃的配方2處理均極顯著高于未添加卵黃的配方4處理（ Plt;0.01 ）。數據表明，在精液稀釋液中添加卵黃能顯著提高湖羊精子在低溫保存過程中的活力，對精子具有良好的保護作用。

圖4添加卵黃的精液稀釋液及不同保存時間對湖羊精子活力的影響

注：圖中肩標不同小寫字母表示差異顯著（ ）；不同大寫字母表示差異極顯著（ Plt;0.01 ）；無肩標表示差異不顯著（ ?Pgt;0.05 ）。

3結論與討論

3.1成品精液稀釋液不同稀釋比例對湖羊精子品質產生顯著影響

本試驗結果顯示，當湖羊精液原液用成品精液稀釋液稀釋7倍和28倍時，盡管湖羊精子的密度遠高于稀釋56倍的密度，但湖羊精子活力反而降低，這可能是當湖羊精液原液稀釋比例較低時，精子較為密集，導致精子運動空間不足，精子尾部的鞭打運動增加了精子之間碰撞的概率，使得活精子與死精子之間的相互干擾增大，無活力的精子因受到撞擊而發生移動，從而導致精子活力檢測值高于實際值，影響檢測結果的準確性[2]。當湖羊精液原液用成品精液稀釋液稀釋112倍時，精子活力顯著下降，這可能是湖羊精液原液稀釋比例過高，導致湖羊精液中的天然保護物質被過度稀釋，削弱了其維持環境穩定（如pH、滲透壓、溫度等）的能力，使湖羊精子產生了較大的應激反應。此外，在采用成品精液稀釋液逐級稀釋湖羊精液原液的過程中，湖羊精子可能會遭受更多的機械損傷，導致精子活力及運動速度下降。本研究結果表明，湖羊精子的最佳檢測密度約為0.4億個·mL^-1 ，即湖羊精液原液用成品精液稀釋液稀釋56倍效果較好。

3.2不同配方精液稀釋液不同保存時間對湖羊精子活力的影響

精液稀釋液的質量關系到精子的體外存活時間[3]。因此，在配制精液稀釋液時應嚴格遵循無菌操作、適宜pH、充足能量供應等原則。在本研究中，檸檬酸鈉在維持湖羊精液稀釋液pH 穩定和調節滲透壓方面表現突出，且經濟實用[4，被選為所有試驗組湖羊精液稀釋液的緩沖物質。與其他配方比較，低溫條件下，配方3稀釋液保存的湖羊精子活力最低，這可能是配方3使用的緩沖物質Tris添加量相對較大，導致精液稀釋液滲透壓過高。此外，在使用假陰道法采集湖羊精液過程中，可能會對湖羊精液造成不同程度的污染。

在綿羊精液長期低溫保存期間，微生物的增殖會消耗綿羊精液以及稀釋液中的營養物質，并產生次級有害代謝物，從而降低綿羊精液保存品質[5]。因此，本研究選擇成本較低的鹽酸林可霉素作為抗菌物質，而非雙鏈霉素（青霉素、鏈霉素）。精液稀釋液中常用的糖類物質主要包括單糖和雙糖，以及某些植物來源的特有糖類。由于不同糖類物質在不同物種、不同保存方式下表現出的效果存在差異，目前尚未確定哪種糖類及其配比效果最優[5-16]。本研究配方2選用較為便宜的葡萄糖，并與檸檬酸鈉等成分配伍，結果表明其能夠有效支持湖羊精液在低溫下長期保存。

有研究表明，當湖羊精液原液與稀釋液按1：3 比例混合，在常溫下保存4d后的精子活率高于其他濃度的處理組，過高和過低的稀釋比例均不利于湖羊精液的保存[7-18]。因此，本研究選擇湖羊精液原液與精液稀釋液比例為1：3 ，并在4℃條件下保存。

3.3不同配方精液稀釋液對湖羊精子形態的影響

綿羊精子頂體的完整性對于綿羊精子的受精能力非常重要。Abadjieva等[9]研究表明，公羊精液在低溫條件下保存超過24h后，其精子的頂體完整率會降低，導致其受胎率下降。綿羊精子質膜是一種重要的膜結構，在受精過程中幫助精子進入卵子。活精子的質膜具有半透性，允許水分子自由通過，因此，活精子數量越多，精子的質膜完整率就越高[5]。本研究結果表明，在4℃條件下保存 72h 后，配方2精液稀釋液與成品精液稀釋液（對照，CK）能夠同樣有效延長湖羊精子的保存時間，并保護精子質膜完整率及頂體完整率，且差異均不顯著（ Pgt;0.05 ）。

3.4卵黃對湖羊精液保存效果的影響

國內外關于卵黃在不同物種或者不同精液保存方式上的應用已有較多報道。趙建清[20]和張柳明等[1]的研究表明，卵黃作為一種動物源性低溫保護劑，因其脂蛋白含有磷脂，能夠穩定綿羊精子細胞膜并阻止綿羊精子頂體膜破裂，從而提供最佳的低溫保護效果。此外，卵黃也可作為能源和營養物質，在綿羊精液保存過程中為綿羊精子代謝提供能量和營養，維持其活性，尤其在保存后期發揮了有益作用，22]。本研究中，由于配方4不含卵黃，在用配方4稀釋湖羊精液原液，并在低溫保存 0、24、48、72h 后，其保存效果均顯著低于配方2處理，且在保存72h 后湖羊精子活力下降尤為顯著，這一研究結論與前人的研究結果一致。本研究結果表明，含有 20% 卵黃的配方2精液稀釋液與成品精液稀釋液（對照，CK）在保存湖羊精液效果上相同，且低溫保存效果更好。

本研究結果顯示，配方2精液稀釋液在湖羊精液保存中具有成本低、配制簡單、易操作、便于推廣應用的優勢，不僅能有效保護湖羊精子在低溫環境下的活力、頂體完整性和質膜完整性，還能延長精子的有效保存時間，進而提高優質種公羊的精液利用率。

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