靶向葉酸受體 α(FRα) 的程序性細胞死亡受體1敲低型嵌合抗原受體T細胞殺傷肝癌細胞的效果分析

摘要：目的探究靶向葉酸受體 α（FRα） 嵌合抗原受體（CAR）的程序性細胞死亡受體1（PD-1）敲低型T細胞（si-PD-1-CAR-T）對肝癌細胞的清除能力。方法應用生物信息學數據庫TCGA分析FRα抗原在肝癌及正常肝組織中的表達情況，以及FRα表達與肝癌患者生存期的關系。分別將編碼靶向FRα抗原的CAR結構的mRNA及mRNA聯合靶向PD-1基因的小干擾RNA（siRNA）使用電穿孔儀轉導入T細胞，制備FRα-CAR-T和si-PD-1-CAR-T。流式細胞術分析FRα-CAR的表達效率和PD-1的敲低效率。體外培養肝癌細胞系JHH-1和HepG2，采用流式細胞術分析 FRα 在腫瘤細胞表面的表達情況，將FRα-CAR-T、si-PD-1-CAR-T及空載體轉導的T細胞（MockT）作為效應細胞，JHH-1和 作為靶細胞，CCK-8法檢測在不同效靶比（1：1、2.5：1、5：1、10：1、20：1）時對靶細胞的殺傷效率;采用ELISA法分別檢測效應細胞與靶細胞（10：1）共培養上清中 IFN-γ 和IL-2的分泌情況。計量資料符合正態分布時，兩組間比較采用成組 χ_t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK檢驗。采用Kaplan-Meier法分析比較患者生存差異。結果TCGA數據庫分析顯示，FOLR1在肝癌組織中表達水平明顯升高，FOLR1高表達肝癌患者的總生存期顯著低于FOLR1低表達者（ P=0.013） 。將mRNA轉導入T細胞后，FRα-CAR在CAR-T和si-PD-1-CAR-T中的表達率可達 89.8% 和 84.7% ，使用mRNA和siRNA共轉染可將T細胞的PD-1下調并維持至少7天的PD-1低表達狀態。FRα抗原在JHH-1細胞中表達率為 100% ，而在HepG2細胞中呈陰性表達。CCK-8結果顯示，si-PD-1-CAR-T對JHH-1細胞殺傷效率顯著高于FR α -CAR-T細胞（ Plt;0.05： ;ELISA結果顯示， FRα -CAR-T細胞與JHH-1細胞共培養時，IL-2分泌量較MockT細胞顯著增加[ （1032.50±135.90）pg/mL Vs ） pg/mL Plt;0.001 」， IFN-γ 分泌量顯著增加[ 11430.56± vs Plt;0.001 ];si-PD-1-CAR-T與JHH-1細胞共培養后， IFN-γ 和IL-2的釋放水平較FRα-CAR-T均顯著提高 [P 值均 lt;0.05 。結論 FRα 是肝癌治療的潛在靶點，敲低T細胞PD-1可顯著提高FRα-CAR-T在體外的殺傷活性。

通信作者：葉學帥，yexueshuai@hebeu.edu.cn（ORCID：0009-0000-3665-3394）

關鍵詞：癌，肝細胞；嵌合抗原受體；葉酸鹽受體1；程序性細胞死亡受體1基金項目：河北省自然科學基金（H2024402005）

Efficacy of chimeric antigen receptor T-cellwith programmed cell death-1 knockdown targeting folate receptor alphain killinghepatoma cells

WEN Junye’，ZHANGJunqi2，REN Hang2，ZHANG Haiqiang3，YE Xueshuai2 1.DepartmentofepatobliaryurgeryHbeiGeralHspital，zangOohina；2fceofisciplieevelontd GraduateEducation，TheAfliatedHospital/ClinicaledicalCollgeofHebeiUniversityofEngineering，Hndan，Hebei560， China;3.DepartmentofGastrointestinalSurgery，heSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity，ShjzhuangO5oChina Corresponding author： YE Xueshuai ， yexueshuai@hebeu.edu.cn （ORCID： 0009-000O-3665-3394） Abstract：ObjectiveToinvestigatetheabilityofchimericantigenreceptor T-cell withprogrammedcell death-1（PD-1） knockdown（si-PD-1CAR-T）targeting folatereeptor alpha（FRα）toeliminate hepatomacels.MethodsThebioinformatics database TCGA was used to analyze the expression level of FRα antigen in liver cancer tissue and normal liver tissue and the associationbetweenFRαexpressionandthesurvivaloflivercancerpatients.ThemRNAencodingtheCARstructure targetingFR antigenandthesmall interferingRNA（siNA）targetingthePD-1genewere transducedintoTcellsusinganelectroporatorto prepare FR α -CAR-T and si-PD-1-CAR-T cells.Flow cytometry was used to analyze the expression efficiency of FRα -CAR and the knockdown effciencyofPD-1.HepatomacellinesJHH-1and Hep-G2werecultured invitro，andflowcytometrywasusedto analyze the expressionofFRαon the surfaceof tumor cels.With FRα-CAR-T，si-PD-1CAR-T，and mock vector-transduced T cells（Mock T）usedas efectorcellsandwith JHH-1and Hep-G2cellsastarget cels，CCK-8assay was used to measure the killigflo：.：：： used to measure the secretion of interferon gamma（IFN- γ ）and interleukin-2（IL-2） in the supernatants from co-cultures of effector and target cells（10：1）.The independent-samples t test was used for comparison of normally distributed continuous data between two groups，whileaone-wayanalysisofvariance wasusedforcomparisonbetween multiple groups，andtheSNKtest wasused for furthercomparisonbetweentwogroups.The Kaplan-Meiermethodwasused forcomparisonofsurvival diferences.ResultsThe analysisoftheTCGAdatabaseshowedthattherewasasignificantincreaseintheexpresionlevelofFOLR1inlivercancertisseand livercancerpatientswithhighexpressionofFOLR1hadasignificantlysorteroverallsurvivalthanthose withlowexpresion（ P =0.013）. After transduction of mRNA into Tcells，the expression rate of FRα -CAR reached 89.8% in CAR-T and 84.7% in si-PD-1 CAR-T cells， andco-transfectionwithmRNAandsiRNAcoulddowregulatePD-1inTcellsandmaintainalowexpressonstateforatleast7das. The expression rate of FRα antigen was 100% in JHH-1 cells，while it showed negative expression in Hep-G2 cells.CCK-8 assay showed thatthe killing effciencyof si-PD-1-CAR-Tagainst JHH-1cells wassignificantlyhigher than thatagainst FRα -CAR-Tcells （ Plt;0.05 ）. ELISA showed that compared with Mock T cells，FR α -CAR-T cells co-cultured with JHH-1 cells showed significant increases in the secretion ofIL-2（1 032.50±135.90 pg/mL vs 50.26±7.87 pg/mL， Plt;0.001 ）and IFN- γ （1 430.56±184.20 pg/mL vs89.05 ± （20號 11.26pg/mL，Plt;0 .001），and in addition，the release levels of IFN- γ and IL-2 after co-culture of si-PD-1-CAR-T and JHH-1 cells were significantly higher than the release level of FRα -CAR-T （ Plt;0.05 ）.ConclusionFR α is a potential target for liver cancer treatment， and PD-1 knockdown in Tcells cansignificantly enhance theinvitro killing activity of FR α -CAR-T cells.

Key Words：Carcinoma，Hepatocelllar;Receptors，ChimericAntigen;olateReceptor1;ProgrammedCellDeath1Receptor Research funding：Natural Science Foundation of Hebei Province（H2O24402005）

肝細胞癌（HCC）是最我國常見的消化系統腫瘤之二[1]。當前的治療手段主要為局部和系統治療，包括手術、經動脈放射栓塞、化療栓塞或消融治療、靶向免疫治療和中醫藥治療等[2-3]。由于其起病隱匿，患者早期癥狀不明顯，多數患者就診時已失去手術指征。嵌合抗原受體T細胞（chimeric antigen receptor Tcell，CAR-T）可通過主要組織相容性復合體非限制性途徑識別并殺傷腫瘤細胞[4]，具有親和力高、特異性強、殺傷效果顯著等特點，當前國內外已有數個靶向CD19等血液系統惡性腫瘤相關抗原的CAR-T療法獲批上市[5]。盡管實體腫瘤組織表達多種腫瘤相關抗原（tumor associated antigen，TAA），但多數TAA在正常組織中也有不同程度的表達，因此，CAR-T可以攻擊表達相應TAA的正常組織細胞，造成\"脫靶\"效應，這極大限制CAR-T療法的應用[6。葉酸 ∝ 受體（folatereceptor α ，FRα）是由FOLR1基因編碼的一種糖基化蛋白，在多種腫瘤組織中高表達[7]。靶向FRα 的抗體藥物偶聯物（antibody-drugconjugate，ADC）和CAR-T療法已在多項臨床研究中得到應用[8-9]，但其在肝癌的治療中還尚未報道。本研究旨在探究FRα抗原在肝癌組織中的表達情況，通過使用mRNA聯合小干擾RNA（smallinterferingRNA，siRNA）技術制備了靶向FRα的程序性細胞死亡受體1（programmeddeath1，PD-1）沉默的CAR-T，初步研究其抗腫瘤活性，評估靶向FRα的PD-1沉默的CAR-T療法在肝癌治療中的可行性。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器RPMI1640培養基、DMEM培養基、胎牛血清（FBS）及PBS緩沖液均購自美國Gibco公司；淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物科技有限公司；人CD8⁺T 細胞分離試劑盒購自德國Miltenyi公司；人白細胞介素2（IL-2）、CD3單克隆抗體（OKT-3）、CD28單克隆抗體購自北京義翹神州科技股份有限公司；青霉素/鏈霉素購自北京索萊寶生物科技有限公司；抗人FOLR1-APC、抗人PD-1-FITC流式標記抗體均購自美國Biolegend公司；FITC-LabeledHumanFOLR1購自北京百普賽斯生物科技股份有限公司。 Transfection System 電穿孔儀購自美國Invitrogen公司；流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2實驗方法

1.2.1基因表達及肝癌患者預后分析從TCGA數據庫下載泛癌樣本與正常樣本的基因表達譜及臨床數據，比較FOLR1mRNA在泛癌中的表達特點。通過單變量Cox分析和LASSO-Cox回歸分析構建生存預后模型，將肝癌患者按FOLR1mRNA表達水平分為FOLR1高表達組和FOLR1低表達組，通過Kaplan-Meier生存曲線進行分析。1.2.2細胞系的培養人肝癌細胞系JHH-1和HepG2均購自美國模式培養物集存庫（ATCC），兩種細胞系均培養于含 10% 胎牛血清和 1% 青霉素/鏈霉素的DMEM培養基中，在 37°C.5%.0₂ 條件下培養。

1.2.3CAR-mRNA的制備本研究靶向 FRα 抗原采用包含一個共刺激因子的第二代CAR結構，命名為FRα-CAR，其結構示意圖如圖1所示。其中， FRα 特異性scFv（克隆號：MOv19）、CD8鉸鏈及跨膜區、CD28共刺激因子和CD3按圖示結構串聯，編碼CAR結構的基因經密碼子優化后交由TriLink公司全基因合成。將上述基因克隆到DNA體外轉錄載體并獲得 5^′ 加帽和poly（A）尾的CAR-mRNA，保存于-80℃冰箱備用。

1.2.4靶向PD-1的siRNA設計和合成PD-1siRNA及其陰性對照siRNA（NCsiRNA）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，PD-1siRNA序列如下：正義鏈 5^′ -AUUAUAAUAUAAUAGAACCAC- ?3^′ ，反義鏈 5^′ 1GGUUCUAUUAUAUUAUAAUUA- ?3^′ 。

1.2.5FRα-CAR-T和si-PD-1-CAR-T的制備使用淋巴細胞分離液密度梯度離心，分離外周血單個核細胞（PBMC），在添加 10% 胎牛血清、 1% 青霉素/鏈霉素、2mmol/L 谷氨酰胺和 100IU/mL 重組人IL-2的RPMI1640培養基中培養， 37°C、5%CO₂ 條件下孵育2h，使單核細胞貼壁。使用人 CD8⁺T 細胞磁珠分離試劑盒，從非貼壁細胞中分離收獲 CD8⁺T 細胞，并在培養基中加入 1μg/mL 的CD3/CD28單克隆抗體、 300U/mL IL-2激活 48h 使用電穿孔緩沖液R（NeonTransfectionSystemKits）以每 100μL 中 2×10⁶ 個細胞的體系混勻細胞。在電轉體系中分別加人 10μg 的FRa-CARmRNA和 5μL10μmol/L 的對照siRNA或 10μg 的FRa-CAR mRNA 和 5μL10μmol/L 的PD-1siRNA以制備 FRα -CAR-T和si-PD-1-CAR-T，使用程序24（ 1600V ， 10ms ，3個脈沖）下電擊。MockT在電轉體系中僅加入 5μL μL10μmol/L 的對照siRNA，電穿孔完成后立即將細胞轉移至預熱的 1mL 不含IL-2的完全培養基中繼續培養。

1.2.6流式細胞術人肝癌細胞系JHH-1和HepG2使用抗人FOLR1-APC抗體孵育后進行表面 FRα 抗原表達分析。T細胞轉染后第4天，每 10⁶ 個細胞使用FITC-LabeledHumanFOLR1標記后進行表面 FRα -CAR表達分析，使用抗人PD-1-FITC持續檢測T細胞表面PD-1的表達情況。

1.2.7體外殺傷實驗使用CCK-8試劑盒測定CAR-T的細胞毒性，靶細胞（JHH-1和HepG2）以每孔 1×10⁴ 個細胞的密度接種于96孔板，培養貼壁后將效應細胞（ FRα -CAR-T、si-PD-1-CAR-T、MockT）按不同效靶比 依次加入，每組設置3個復孔，共培養 24h 。使用PBS清洗未貼壁細胞后每孔加入含 10μL CCK-8的相應完全培養基繼續培養 ^4h ，使用酶標儀在 450nm 波長處測OD值，按照如下公式計算靶細胞裂解百分比：殺傷效率 =[1- （實驗組OD值-空白孔OD值）/（對照組OD值-空白孔OD值） |×100% 。

1.2.8ELISA檢測共培養上清中IFN- γ 和IL-2的水平將靶細胞（JHH-1和 HepG2 以每孔 5×10⁴ 個細胞的密度接種于96孔板，培養貼壁后將效應細胞（ FRα -CAR-T、si-PD-1-CAR-T、MockT）按10：1效靶比加人，共培養 24h_? （22收集共培養上清后使用人IFN- ?γ IL-2ELISA檢測試劑盒測定IFN- ?γ 、IL-2水平。

1.3統計學方法所有實驗至少進行了3次獨立的實驗操作，應用GraphPadPrism9.0對數據進行統計學分析。采用Shapiro-Wilk法對計量資料進行正態分布檢驗，資料符合正態分布時以 表示，兩組間比較采用成組 χ_t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK檢驗。采用Kaplan-Meier法比較患者生存差異。 Plt;0.05 為差異有統計學意義。

2結果

2.1FOLR1基因表達分析首先探討FOLR1基因在泛癌尤其是肝癌中的表達情況。通過對TCGA數據庫中泛癌及正常組織的分析，FOLR1mRNA在正常組織中幾乎不表達，而在卵巢癌、膽管癌、宮頸癌、辜丸癌、子宮內膜癌、腎癌、肝癌、乳腺癌、結腸癌、胃癌、肺癌、食管癌、膀胱癌等腫瘤組織中表達豐度顯著升高（圖2），提示FRα抗原在多種腫瘤組織中表達上調，是腫瘤治療的潛在靶點。

2.2FOLR1表達與患者預后分析基于TCGA數據庫中362例肝癌患者的FOLR1mRNA表達和預后情況，分析FOLR1基因表達與肝癌患者總生存期的關系，結果顯示，FOLR1高表達肝癌患者的總生存期顯著低于FOLR1表達低者（ _P=0.013 ）（圖3）。

2.3FRα-CAR-T和si-PD-1-CAR-T細胞的制備 本研究采用電穿孔法將編碼CAR結構（圖1）的mRNA和siRNA遞送轉染T細胞，電轉后5天，流式細胞術結果顯示，T細胞表面FRα-CAR表達率分別為 89.8% 和 84.7% （圖4）。隨著培養時間延長，MockT和 FRα -CAR-T的PD-1表達水平逐漸上調，而使用siRNA可以顯著下調PD-1的表達并維持至少7天的PD-1低表達（圖5）。

2.4FRα-CAR-T在體外表現出對腫瘤細胞特異且高效的靶向殺傷活性通過流式細胞術檢測肝癌細胞系JHH-1和 HepG2 細胞表面 FRα 抗原的表達，結果顯示JHH-1表面 FRα 表達水平為 100% ，而 HepG2 為陰性表達（圖6）。因此，在接下來的CCK-8試驗以及ELISA檢測細胞因子分泌的試驗中將JHH-1作為靶細胞，HepG2作為陰性對照組。

CCK-8試驗顯示，隨著效靶比的提高， FRα -CAR-T對JHH-1細胞的殺傷效果逐漸增大，當效靶為 20：1 時，FRα-CAR-T的殺傷效率為 81.00%±3.64% FRα -CAR-T對 FRα 表達陰性的 HepG2 細胞的殺傷則未觀察到顯著變化（ Pgt;0.05） ；而MockT對兩種腫瘤細胞的殺傷作用在各效靶比下均未觀察到顯著統計學差異（ Pgt;0.05 （圖7）。

ELISA法檢測效靶比10：1共培養液中細胞因子分泌水平，與體外殺傷實驗觀察到的趨勢一致， FRα -CAR-T細胞與JHH-1細胞共培養時，IL-2分泌量較MockT細胞顯著增加[ （1032.50±135.90） pg/mL VS （50.26±7.87 ） pg/mL Plt; 0.001];IFN- ?γ 分泌量顯著增加[ （1430.56±184.20）pg/mL Vs（20 （89.05±11.26）pg/mL，Plt;0.001] （圖8）。以上結果提示， FRα CAR-T對靶細胞的殺傷呈FRα抗原依賴和劑量依賴。

2.5PD-1沉默可增強CAR-T的靶向殺傷活性使用siRNA沉默PD-1的 FRα -CAR-T細胞（si-PD-1-CAR-T）與靶細胞共培養，CCK-8試驗顯示，si-PD-1-CAR-T同樣表現出抗原依賴和劑量依賴的殺傷作用，并且在效靶比為20：1時，其殺傷效率為 92.25%±2.64% ，同 FR∝ -CAR-T相比差異有統計學意義 （Plt;0.05） （圖7）。

在效靶比10：1時si-PD-1-CAR-T與靶細胞共培養，其IFN-γ[（1815.40±233.90）pg/mL VS （1430.56±184.20）pg/mL ，P=0.027] 和IL- 2[（1411.40±173.60）pg/mL vs （1032.50± 135.90）pg/mL，P=0.034. 分泌量較FRα-CAR-T均顯著提升（圖8），提示si-PD-1-CAR-T在細胞因子分泌和對靶細胞的清除率方面均顯著提高。

3討論

近年來，過繼細胞免疫療法如腫瘤浸潤淋巴細胞[10]、T細胞受體改造的T細胞[1I-12]和CAR-T[13]等被廣泛應用于臨床治療惡性腫瘤。其中，靶向CD19、CD20和B細胞成熟抗原（B-cell maturationantigen，BCMA）的CAR-T療法在血液系統惡性腫瘤治療中的取得顯著成效。目前，國內外已有數十個靶向CD19或BCMA靶點的CAR-T療法上市，用于血液系統惡性腫瘤的治療[14]。

實體腫瘤呈團塊樣生長，一方面，腫瘤細胞與基質細胞、免疫細胞共同作用可形成腫瘤免疫抑制微環境[15]。腫瘤細胞可通過PD-1/PD-L1等免疫檢查點途徑抑制機體自身免疫對腫瘤細胞的清除作用[16-17]。因此，如何打破腫瘤微環境中的“免疫耐受”，對于提升免疫細胞抗腫瘤能力，具有極大的研究價值。另一方面，腫瘤細胞具有異質性[18]，使得單一抗原很難完全覆蓋所有腫瘤細胞；同時，腫瘤相關抗原不僅在腫瘤細胞上表達，也在部分正常組織中表達，這意味著正常組織也可能受到CAR-T攻擊，從而造成“脫靶效應”[19]。因此，篩選合適的靶點是靶向治療和細胞治療的基礎。當前，已有多個靶點如磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC-3）、黏蛋白1（MUC1）CD44、自然殺傷細胞組蛋白2樣配體（NKG2DL）間皮素（MSLN）、表皮生長因子受體（EGFR）應用于HCC的臨床前和臨床研究[20-22]，但這些抗原在正常組織中均有不同程度的表達。所以，針對上述抗原的CAR-T療法在應用中可能導致CAR-T細胞攻擊正常組織，靶向上述靶點的CAR-T療法在臨床應用存在有一定的風險。

本研究中選擇的FRα抗原是一種糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定的細胞表面糖蛋白，在正常組織中表達水平有限，但在某些腫瘤組織中過度表達，如卵巢癌[23]乳腺癌（尤其是三陰性乳腺癌）[24]，使其成為CAR-T治療的理想靶點。目前，已有針對FRα的CAR-T療法的臨床前研究用于治療卵巢癌、三陰性乳腺癌等實體腫瘤[25。從分子機制上看， FRα 可以高親和力地結合并介導葉酸進入肝癌細胞，參與細胞代謝、影響細胞自噬，以及DNA合成和修復。一方面，葉酸結合FRα可通過GP130共受體介導的JAK依賴性過程誘導STAT3激活[26]。另一方面，FRα在小窩囊泡中內化形成內小體，內小體降解后與溶酶體融合釋放FRα和葉酸。FRα被轉移到細胞核，并直接作為轉錄因子發揮調節某些腫瘤相關基因表達的作用[27]

本研究通過對TCGA數據庫分析和流式細胞術檢測部分肝癌細胞系發現，FRα在肝癌組織和部分腫瘤細胞株中過表達，且其在正常組織中僅有低水平的表達。同時，生存分析也顯示，高表達FRα的肝癌患者預后較差，提示 FRα 抗原在肝癌的發生發展中可能發揮調控作用。因此，FRα抗原可能是CAR-T療法治療HCC潛在的理想靶點。

CAR結構是CAR-T療法發揮抗腫瘤作用的分子基礎，本研究構建了包含結合FRα的單鏈抗體、CD28共刺激因子及免疫受體酪氨酸活化基序CD3的第二代CAR。CAR中的CD28可延長修飾后的CAR-T激活后的存留時間，并增加IL-2、IFN- ?γ 的分泌[28]。當前制備CAR-T的基因遞送工具主要有慢病毒載體、逆轉錄病毒載體、質粒DNA、mRNA以及轉座子系統[29-30]，盡管各類遞送工具都可實現CAR結構在T細胞中的表達，但慢病毒載體、逆轉錄病毒載體和轉座子系統均通過將編碼CAR結構的基因插入T細胞基因組以實現CAR的持續表達，存在因基因隨機插入而導致的原癌基因激活等潛在的致瘤風險。

當前，使用mRNA遞送基因已被廣泛研究，由于mRNA不需要進人細胞核且mRNA分子自身的不穩定性，通過電穿孔技術遞送mRNA可以實現在T細胞中快速但非持續性地表達CAR。mRNACAR-T的持久性上不及慢病毒或逆轉錄病毒載體制備的CAR-T，這在一定程度上限制了CAR-T療效的持續性。同時，mRNA在體外具有不穩定性，制備與保存mRNA條件相對嚴苛，這在一定程度上增加了CAR-T制造的成本。但基于mRNA制備CAR-T細胞可能具有以下優勢：首先，mRNA可以具有轉染靜止或慢速增殖細胞的能力，且其轉導效率高[31]；其次，mRNA在翻譯過程中沒有基因組整合，因此不會造成基因組的隨機插入[32]，進而提升CAR-T細胞的長期安全性；最后，使用mRNA制備CAR-T可以為新設計的CAR分子提供更快的調控途徑來評估新CAR-T潛在腫瘤反應性，幫助快速篩選安全的靶標抗原[33]。同時，其在體內的存留時間較短的劣勢可通過多次輸注CAR-T細胞來解決。

綜上所述， FR∝ 是一個很有前景的肝癌治療靶點，使用mRNA載體制備靶向 FRα 的CAR-T細胞在體外表現出高效、特異的清除FRα陽性的肝癌細胞的能力，通過敲低PD-1在FRα-CAR-T中的表達，可進一步增強CAR-T細胞抗腫瘤能力。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：溫軍業、葉學帥負責課題設計，資料分析，撰寫論文；張浚琪、任行、張海強參與收集數據，修改論文；溫軍業、張海強、葉學帥負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。

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收稿日期：2024-11-04：錄用日期：2025-01-21本文編輯：劉曉紅引證本文：WEN JY，ZHANG JQ，REN H，et al.Efficacy ofchimericantigenreceptorT-cellwithprogrammedcelldeath-1knockdowntargetingfolatereceptoralphainkillinghepatomacells[J].JClinHepatol，2025，41（6）：1128-1134.溫軍業，張浚琪，任行，等.靶向葉酸受體α（FRα）的程序性細胞死亡受體1敲低型嵌合抗原受體T細胞殺傷肝癌細胞的效果分析[J].臨床肝膽病雜志，2025，41（6）：1128-1134