混合培養對破囊壺菌中Aurantiochytrium sp.生物量的影響

中圖分類號：Q939.97 文獻標志碼：A 文章編號：1004—6755（2025）08—0028-04

Abstract：This study investigated co- culture strategies for enhancing biomass production in the oleaginous marine protist Aurantiochytrium sp. S3D， comparing algal- protist （Chlorella sp.）and protist一protist （Talaromyces sp. and A . sp. S3E） systems under varying light conditions and nutrient sources. While light significantly stimulated S3D growth （ ΔPlt;0.01 ），algal co-culture showed no synergistic effects. Optimal biomass yields were achieved in glycerol/YE medium with S3D一 T_δ sp （11.41±0.25） 1 g/L ，and S3D-S3E coculture at 1：4 ratio in glucose/YE medium （12.62±0.67）g/L .These findings demonstrate that conspecific co一 culture with organic nitrogen maximizes S3D productivity.

Key words： Thraustochytrid;microalgae;mixed culture; heterotrophic protists

破囊壺菌（Thraustochytrid）是一類異養原生生物[1]，主要包含Thraustochytrium、Schizochytri-um、Aurantiochytrium、Botryochytrium、Japonochytrium、Monorhizochytrium、Parietichytrium、Sicyoi-dochytrium等[2]。破囊壺菌的生物質可用作飼料添加劑，顯著提高海水魚和家禽產品的品質3；破囊壺菌油脂還可用于生物柴油的生產，這一應用有助于緩解能源短缺的問題[4]

破囊壺菌能夠廣泛利用葡萄糖、甘油等多種碳源進行高效的脂質合成5，混合培養能夠優化微生物的代謝途徑，實現微生物油脂的高效生產，為解決當前面臨的能源短缺和環境污染問題提供了可行方案[。本研究以產油微生物A．sp.S3D為研究對象，考察了光照、碳源（葡萄糖/甘油）、氮源（酵母提取物/氯化銨）及藻—菌共培養和菌一菌共培養對破囊壺菌生長的影響，以期為產油微生物混合培養提供科學指導。

1材料與方法

1.1 藻種與菌種來源

菌株S3D與S3E分離自溫州近海紅樹林落葉，經形態學和分子生物學鑒定為 A .sp.S3D和A.sp.S3E。Talaromyces sp.Y1o1A分離自秦皇島市近海水體，Chlorellasp.購買自中科院海洋所。所有菌種均保存于科研中心。

1.2 培養基的制備

試驗采用以下培養基：MMV培養基含 5g/L 谷氨酸鈉和 10g/L 葡萄糖， f/2 培養基含 75g/L 硝酸鈉、 5g/L （204號 KH₂PO₄ 、維生素溶液7、微量元素溶液。菌—菌混合培養的培養基成分見表1。

表1菌一菌混合培養的培養基成分

單位：g/L

1.3種子液的制備與發酵培養

藻—菌混合培養采用MMV與 f/2（1：1） 混合培養基，初始接種密度為 5×10⁴ cells/mL，接種量為 10%（V/V），25°C 培養 _9d 。光照組光強為 60μmol/（m²?s） ，光照周期為 ^14h 光照/ ^10h 黑暗 （14L/10D 。菌—菌混合培養中， A .sp.S3D與酵母菌混合培養采用表1中 A-D 四種培養基，與同屬菌株混合培養采用A、C兩種培養基， 25°C.180rpm 振蕩培養 6d 。

1.5 生物量測定

采用恒重法測定生物量。將離心管使用105^°C 烘箱烘干至恒重；取 10mL 菌液，經5 000rpm 離心 5min 去除上清，用滅菌超純水洗滌菌體3次；將菌體于 -20^°C 預凍 ^12h 后，轉移至冷凍干燥機中凍干 ^48h ；將樣品轉至干燥器平衡 30min 后稱量凍干總質量，并計算生物量。

1.6 統計學分析

數據統計采用IBMSPSSStatistics26軟件進行處理，數據以（平均值 ± 標準差）的形式表示。

2結果

2.1光照對菌株生長的影響

試驗結果表明，光照顯著促進 A .sp.S3D生長 ∵0.01 。在單獨培養時，光照組生物量達到 （0.98±0.02）g/L ，較暗培養組提高 9.00% ：見圖1。雖然藻一菌混合培養組在光照條件下的生物量顯著高于無光照組（ Plt;0. 01 ，但A．sp.S3D單獨培養時表現出最優生長性能，其生物量積累極顯著高于共培養組 （Plt;0.01） 。

圖1不同光照條件下菌體的生物量變化

2.2破囊壺菌與酵母菌混合培養對生物量積累的影響

試驗采用葡萄糖、甘油作為碳源，酵母提前物、氯化銨作為氮源，比較了單獨培養和酵母菌—破囊壺菌共培養體系下的生物量差異，見圖2。結果表明，碳源影響 A .sp.S3D的生長周期和生物量積累（ Plt;0. 05） 。當葡萄糖為碳源時，A ：sp.S3D生物量在第6天達到峰值，在添加酵母提取物的培養組中， A ．sp．S3D生物量達到（9.94±0.80）g/L ，見圖 2a 。甘油作為碳源時，A．sp.S3D生物量在第4天達到峰值，在添加了酵母提取物的培養組中， A .sp.S3D生物量達到0 11.33±0.31）g/L ，見圖 2b 。在兩種氮源條件下，酵母提取物作為氮源時 A ．sp.S3D生物量均顯著高于氯化銨培養組 （Plt;0.05） 。

破囊壺菌與酵母菌的共培養時，葡萄糖一酵母提取物培養條件下，各組間生物量無顯著差異中 ?Pgt;0.05） ，見圖 2a 。甘油一酵母提取物培養組中，共培養的生物量達到最高值（ ∥11.41±0.25）g/L ，但各組間生物量無顯著差異1 Pgt;0.05） ，見圖 2b 。

在氯化銨為氮源的培養組中，各組菌體生物量較酵母提取物組明顯降低。葡萄糖一氯化銨培養組中，培養至第6天時， A .sp．S3D生物量達到 （5.01±0.26）g/L ，共培養組生物量為 （6，27± 0.26）g/L ，極顯著高于 A .sp.S3D單獨培養組（ Plt;0.01 ，見圖 2a 。甘油一氯化銨培養組中，各組生物量在第4天達到峰值， A .sp.S3D單獨培養生物量達到 （5.42±0.03）g/L ，共培養組生物量達到 （6.43±0.06）g/L ，極顯著高于 A .sp.S3D單獨培養（ Plt;0.01? ，見圖 2b 。

2.3破囊壺菌與破囊壺菌混合培養對生物量的影響

破囊壺菌 A ，sp.S3D與 A 、sp.S3E在不同碳源條件下的生長特性及其混合培養效果如圖3所示。在葡萄糖—酵母提取物培養條件下（圖3a），A ：sp.S3D單獨培養的生物量達到 （9.94±0.82） g/L ，顯著高于 A .sp.S3E單獨培養的生物量（2號 （7.94±0.78）g/L （ Plt;0. 05） ，表明 A .sp. S3D對葡萄糖具有更優的轉化率。 A sp.S3D與A．sp.S3E接種比例為 1：1 和 1：4 的共培養組生物量分別達到： （11.52±0.57）g/L 和（12.62±0.67）g/L ，兩組間生物量無顯著性差異（ ，其中 1：4 比例共培養組相較于A .sp.S3D單獨培養生物量顯著提升 27%L ?Plt;0.05） ，表明該混合培養比例有助于A．sp.S3D生物量積累。

在甘油一酵母提取物培養條件下， A. sp.S3D的生物量在第4天達到峰值，與第6天無顯著差異（Pgt;0.05） ，見圖 3b 而 A. sp.S3E和混合培養組生物量則在第6天達到峰值。在第6天時， A. sp. S3D單獨培養的生物量達到（ 11.29±0.11）g/L ，極顯著高于 A_? ：sp.S3E單獨培養的生物量 （8.01±0.58）g/L （Plt;0.01） 。結果顯示 A_? ：sp.S3D對甘油具有更高的轉化能力。 A .sp.S3D與 A .sp.S3E接種比例為 1：1 和 1：4 的共培養組生物量分別達到（ 和 （10.40±0.60）g/L ，與A．sp.S3D單獨培養相當 （Pgt;0.05）

3討論

本研究發現，光照顯著促進 A .sp.S3D的生長 Plt;0.01） ，這一結果與Kubo等[8的研究形成對比，表明不同破囊壺菌菌株對光照的響應存在差異。同時發現，采用 1：1 接種比例的藻一菌共培養未顯現協同效應。破囊壺菌 A ．sp.菌株最適生長pH值為 6～8^[9] 。而小球藻光合作用會使培養環境呈堿性（pH值 gt;8 ）[7]，堿性環境會顯著抑制破囊壺菌生長[10]，這可能是導致共培養效果不佳的關鍵環境因素。

在碳源利用方面，A．sp.S3D單獨培養時，S3D在甘油一酵母提取物培養條件下生物量達到（11. 33±0.31）g/L 極顯著優于葡萄糖碳源1 .Plt;0.01 ，甘油展示出比葡萄糖更優的培養效果，這一現象與文獻報道一致[11]。而A．sp.S3E在兩種碳源中的生長表現無顯著差異，這一結果不僅驗證了Bagul等[12]關于營養環境影響菌株特性的結論，更凸顯了破囊壺菌科的代謝多樣性。雖然A.sp. S3D與 A ：sp.S3E都能利用甘油和葡萄糖，但在不同碳源中生長性能和產物積累方面存在差異，這與吳克剛等13人的結論一致。氮源試驗證明，有機氮源較無機氮源能極顯著促進菌體生長（ Plt;0.01） 。這一結論與Chen等[14-的結論相符。

本研究進一步揭示了破囊壺菌混合培養的協同效應具有明顯的營養依賴性。不同于傳統的藻—菌混合培養體系[15]， A ．sp.S3D與酵母菌混合培養時，在無機氮源條件下，共培養顯著提升破囊壺菌生物量（ Plt;0. 01 ），這種營養條件依賴性的協同效應，可能源于共培養過程中，酵母菌代謝產生的酶類、維生素和糖肽類等物質，為破囊壺菌提供了關鍵的促生長因子。

4總結

本研究探索了藻—菌和菌—菌混合培養體系，以為產油微生物 A .sp.S3D的高效培養提供新的方案。研究結果表明，光照對破囊壺菌單獨培養具有顯著促進作用（ ΔPlt;0. 05Δ 。結合碳氮源單因素影響試驗進行菌一菌混合培養研究，結果表明，破囊壺菌的生長具有顯著的營養條件依賴性。甘油作為碳源時， A .sp.S3D單獨培養的生長性能顯著優于葡萄糖（ Plt;0. 05） ，且有機氮源酵母提取物極顯著提升 A ：sp.S3D生物量0 （Plt;0.01） 。混合培養效果具有顯著氮源依賴性，無機氮條件中 A ．sp.S3D與酵母菌共培養時，破囊壺菌生物量極顯著提高（ Plt;0. 01） 。而有機氮條件下， A sp.S3D與 A .sp. S3E以 1：4 的比例混合培養對生物量的積累效果更優。

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