鹿茸菇液體培養基配方優化及菌絲體多糖抗氧化活性研究

科技特派員服務成效

生態園藝科技特派員團隊人員5人，其中高級職稱3名，中級職稱2名，人員結構合理，分工明確。團隊聚焦泉州果樹與食用菌產業發展需求，開展種質資源收集、評價和利用；生態栽培、保鮮與特色種質挖掘；植物微生物共生及植物功能活性成分分離、鑒定與開發等工作。通過創新驅動、示范基地建立、技術培訓，助推地方園藝產業鏈高質量發展。團隊長期深入田間地頭，扎根泉州大地，累計指導農業相關企業數十家，培訓果農500多人次，協助企業建立了示范基地1000多畝，推廣應用2000多畝；培養碩士研究生50多名；團隊成員獲評為泉州市創新創業導師、福建省“科創中國”博士創新站領銜專家；榮獲2024年度泉州市級實施“千村示范引領、萬村共富共美”工程成績突出個人等榮譽稱號。

DOI： 10.20023/j.cnki.2095-5774.2025.02.014

摘要：【目的】研究鹿茸菇液體培養基最佳配方及菌絲體多糖的抗氧化活性，為鹿茸菇液體菌種生產及菌絲體產品開發提供理論依據。【方法】采用液體培養技術開展單因素試驗和Box-Behnken響應面試驗，優化得到鹿茸菇液體培養基的最佳配方，并測定其多糖的抗氧化活性。【結果】鹿茸菇液體培養的最佳條件為 21.56g/L 蔗糖、4.92g/L 蛋白脈、 2.68g/L 磷酸二氫鉀、 0.5g/L 硫酸鎂、 10mg/L 維生素 ΔB₁ 、溫度 24^°C 、轉速 180r/min_c 。在該條件下培養6d，鹿茸菇菌絲體干重最大為 0.51mg/mL ，且多糖濃度在 50mg/mL 時對DPPH自由基、ABTS自由基的最高清除率均達到 90% 以上。【結論】采用單因素試驗和Box-Behnken響應面試驗優化鹿茸菇液體培養條件的方法可行，優化后能夠提高鹿茸菇菌絲體的干重，且供試菌株菌絲體多糖具有一定的抗氧化活性。

關鍵詞：鹿茸菇；液體培養；抗氧化活性；多糖；Box-Behnken響應面法中圖分類號：S646.9 文獻標識碼：A 文章編號：2095-5774（2025）02-0215-07

Optimization of Lyophyllum decastes liquid culture medium formula and antioxidant activity of mycelium polysaccharides

Li Yan1，Peng Huihan1，Yu Hailingl*，Wang Mingyuan1，Li Xuyun2，Liu Jianfu1，Yang Miao （1.Instituteof Horticulture Science and Engineering，Huaqiao University，Xiamen，Fujian361O21，China; 2.Anxi Agricultural Product Quality and Safety Center，Quanzhou，Fujian 3624Oo，China）

Abstract：【Objective]Theoptimal liquid culture medium formulaandtheantioxidant activityof polysaccharides in the myceliumof Lyophylum decastes wereexploredtoprovideatheoreticalbasis forthe productionofliquid strains and the development of mycelium products.【Method】A single-factor test and Box-Behnken responsesurface test were employed to optimizethe liquid culture medium formula.Theantioxidantactivityoftheextracted polysaccharides wassubsequently evaluated.【Result】 The optimal liquid culture conditions were determined as follows： 21.56g/L sucrose，4.92 g/L peptone， 2.68 g/L KHPO4， 0.5g/L MgSO4， 10mg/L VB1， 24^° C and agitation speed of 180r/min .After6 days of cultureunder these conditions，the maximum mycelium dry weight of L. decastes reached O.51 mg/mL.Furthermore，thepolysaccharides（50 mg/mL）exhibited potent antioxidant activity，achieving gt; 90 % scavenging rates against both DPPH and ABTS radicals. 【Conclusion】The optimization strategy combining single-factor testand Box-Behnken response surface test were feasible method for optimizing liquid culture conditions of L_* decastes.Optimized methods could effectively increased mycelium dry weight of L_* decastes.The mycelial polysaccharides demonstrated significant in vitro antioxidant capacity.

Keywords：Lyophyllum decastes;；liquid culture； inoxidizability；polysaccharide；Box-Behnken response surface methodology

鹿茸菇（Lyophyllumdecastes），又稱荷葉離褶傘、荷葉蘑，隸屬于傘菌目（Agaricales）、白蘑科（Tricholomataceae）、離褶傘屬（Lyophyllum）。因其子實體菌蓋外觀似鹿茸切片，同時又像鹿茸一樣具有藥用價值而得名為鹿茸菇[1]。鹿茸菇菌肉肥厚細膩，含有豐富的膳食纖維，口感脆，長時間煮制烹飪不改變性質，加工后的干品香味濃郁且脆性不減，素有“聞則松茸蘑，食則鹿茸菇”的美譽。鹿茸菇富含的蛋白質、氨基酸等營養物質[2]，對先天性糖尿病、特異性皮膚炎等具有很好的抑制效果，具有降血脂、預防癌癥等功效[3]，是一種營養豐富、兼具食藥兩用功效的珍稀食用菌，市場應用前景十分廣闊。菌菇多糖具有的高抗氧化性一直受到人們的青睞[4-5]，胡文森等[6]研究表明食用菌生物活性與其含有多糖的結構有著十分密切聯系，江和棟等證實了靈芝的孢子多糖具有一定的抗氧化能力。但鹿茸菇菌絲體多糖是否具有抗氧化活性還未得到具體驗證。

在食用菌栽培技術中，菌種可分為固體菌種和液體菌種兩類。與傳統的固體菌種相比，液體菌種在生產上具有更多優勢。目前，多種食用菌的生產已采用液體菌種培養，這不僅提高了食用菌的品質和產量，還顯著縮短了生產周期，極大地提升了食用菌的產量與質量，經濟效益也得到顯著改善[8]

Box-Behnken響應面法是近年來國內外生物藥學工作中常用的一種試驗設計方法[9-10]。它能夠對試驗的各個水平進行連續分析[1]。在藥物研發中，Box-Behnken響應面法可用于優化配方，提高藥物的溶解度和穩定性。在生物學研究中，該方法可用于確定最佳反應條件和培養配方。Box-Behnken響應面法基于多元線性回歸主動收集數據，以獲得具有良好特性的回歸方程，因此在模擬和系統動力學中得到廣泛應用[12-13]。單因素試驗與Box-Behnken響應面試驗相結合，能夠得到更為精確的最佳液體培養基的配方濃度[14]。

因此，本次研究采用Box-Behnken響應面法，通過探究不同碳源、氮源、無機鹽以及其不同濃度等因素對鹿茸菇菌絲體生長情況的影響，對鹿茸菇液體培養基配方進行優化，為鹿茸菇液體菌種生產提供參考依據，并進一步探究鹿茸菇菌絲體多糖的抗氧化活性，為鹿茸菇在保健品以及藥用產品的使用方面提供理論基礎。

1材料與方法

1.1供試菌株

鹿茸菇菌株‘LA-F3A’由廈門如意食用菌生物高科技有限公司提供。

1.2培養基配置

PDA平板培養基： 40g 馬鈴薯葡萄糖瓊脂粉末，加入蒸餾水 1000mL 溶解， 121^°C 高壓滅菌30min ，冷卻倒平板，備用。

碳源篩選基礎培養基： 20g/L 碳源、 4g/L 蛋白 陳、 2g/L 磷酸二氫鉀、 0.5g/L 硫酸鎂、 10mg/L 維生素 B₁ 。

氮源篩選基礎培養基： 20g/L 蔗糖、 4g/L 氮源、 2g/L 磷酸二氫鉀、 0.5g/L 硫酸鎂、 10mg/L 維生素 B₁ 。

無機鹽篩選基礎培養基： 20g/L 蔗糖、 4g/L 蛋白脈、無機鹽 2g/L ！ 0.5g/L 硫酸鎂、 10mg/L 維生素 B₁ 。

1.3菌種活化

在超凈工作臺上，將鹿茸菇菌株接種到PDA平板培養基中， 28°C 電熱恒溫培養箱中培養2周，備用。

1.4最佳培養基配方篩選

在超凈工作臺上用小刀在PDA培養基上取2塊長度為 1cm 的正方形已活化的鹿茸菇菌塊，分別接種至不同營養成分的液體培養基中，并置于24^°C 、 180r/min 振蕩培養箱中培養6d，將發酵液于 4^°C 、 12000r/min 離心 20min ，沉淀菌絲體經蒸餾水洗滌3次后， 65^°C 烘干至恒重，得到菌絲體干重。所有單因素試驗均重復3次。

1.4.1培養基配方成分篩選

分別以 20g/L 葡萄糖、蔗糖、淀粉作為碳源，加入碳源篩選基礎培養基；分別以 4g/L 蛋白脈、酵母粉、牛肉浸膏作為氮源，加入氮源篩選基礎培養基；分別以 2g/L 磷酸二氫鉀、硫酸鈣、硫酸亞鐵作為無機鹽，加人無機鹽篩選基礎培養基中。均培養6d，根據最終菌絲體干重大小，明確培養基配方的最佳碳源、氮源及無機鹽種類。

1.4.2培養基配方濃度試驗

將篩選出的最佳碳源分別以16、18、20、22、24g/L 的濃度加入碳源篩選基礎培養基；最佳氮源以2、3、4、5、6g/L的濃度加入氮源篩選基礎培養基；最佳無機鹽以1.0、1.5、2.0、2.5、 3.0g/L 的濃度加入無機鹽篩選基礎培養基中，培養6d，測定菌絲體干重大小，確定最佳碳源、氮源及無機鹽的添加量。

1.4.3Box-Behnken響應面優化設計

在上述單因素試驗結果的基礎上，采用 Box^-Behnken響應面法，以菌絲體干重為響應值，設計分析試驗，對鹿茸菇液體培養配方進行優化。利用Excel2019軟件分析單因素試驗數據，根據單因素試驗篩選出的最佳碳源、氮源、無機鹽及其最佳添加量，采用Design-Expert軟件進行響應面試驗。

1.5菌絲體多糖的提取

對安雪菲等[5的方法進行部分改進：將培養液過濾得鹿茸菇菌絲體， 65^°C 干燥箱中烘干至恒重，粉碎處理，取菌絲體于離心管，加水于 60^°C /800W條件下超聲波提取 10min ，離心取上清液，重復提取3次后合并提取液，水提醇沉法[16得到鹿茸菇菌絲體多糖。

1.6菌絲體多糖抗氧化活性測定

將1.5中提取的菌絲體多糖配置成0.1、0.5、1、5、10、 50mg/mL 的溶液，以 v_c 作為陽性對照，在 517nm 下測定其吸光值。按照下方公式分別計算各濃度鹿茸菇菌絲體多糖對1- （1，1-二苯基-2-三硝基苯肼基） -2- 苯基肼自由基（DPPH自由基）及 ^2，2′ -聯氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽自由基（ABTS自由基）的清除率。同時，利用Excel2019軟件計算出自由基清除率為 50% 時的多糖濃度，即 IC₅₀ 。

自由基清除率

式中， A₁ 為樣品組吸光值， A₂ 為對照組吸光值， A₀ 為空白組吸光值。

2結果與分析

2.1不同培養基配方對鹿茸菇菌絲體生長的影響

鹿茸菇液體培養基配方篩選的單因素試驗結果顯示（圖1），液體培養6d，以蔗糖為碳源時，鹿茸菇菌絲體的干重最高，為 0.37mg/mL （圖1A）；以蛋白脈為氮源時，鹿茸菇菌絲體的干重最高，為 0.36mg/mL （圖1B）；當培養基中添加磷酸二氫鉀作為無機鹽時，鹿茸菇菌絲體的干重最高，為 0.36mg/mL （圖1C），此3種配方成分均與同組的其他處理差異達顯著水平。

2.2不同培養基濃度對鹿茸菇菌絲體生長的影響

在確定鹿茸菇液體培養基最佳碳源為蔗糖、氮源為蛋白脈、無機鹽為磷酸二氫鉀后，各分5個梯度進一步對其添加量展開研究。結果表明，液體培養6d，當蔗糖濃度為 22g/L 時，鹿茸菇菌絲體干重最高，為 0.50mg/mL （圖2A）；蛋白陳含量為 5g/L 時，菌絲體干重最高，為 0.51mg/mL （圖2B）；磷酸二氫鉀濃度為 2.5g/L 時，菌絲體干重最高，為 0.53mg/mL （圖2C）。

2.3Box-Behnken響應面優化結果

根據液體培養基配方成分及其濃度篩選結果，設計蔗糖（A）、蛋白陳（B）、磷酸二氫鉀（C）3因素3水平試驗（表1），以菌絲體干重為響應值，采用Box-Behnken響應面法對鹿茸菇培養條件進行優化，共分為17個試驗組（表2）。根據表2所列蔗糖、蛋白肺、磷酸二氫鉀的濃度組合，分別添加至鹿茸菇液體培養基中，并置于 24^°C 、 180r/min 振蕩培養箱中培養6d，測定菌絲體干重。

表2Box-Behnken響應面設計及結果

根據表2所得的響應結果，將3個因素（蔗糖、蛋白肺、磷酸二氫鉀的濃度）作為自變量，菌絲體干重作為因變量，經Design-Expert軟件分析，得到二次回歸方程： Y=0.5000-0.018×A- 0.0074×B+0.0260×C+0.0023×AB-0.0100×AC +0.0010×BC-0.0510×A²-0.0470×B²-0.0380× C² 。由表3可以看出，該試驗模型極顯著（ Plt; 0.001），失擬項不顯著。該試驗模型 R²=0.9924 ，R²Adj=0.9826 ，證明該回歸方程擬合度好，用該模型對鹿茸菇液體培養條件優化分析具有可信度。由方差分析可以看出，蔗糖、蛋白脈、磷酸二氫鉀對模型影響顯著，通過 F 值判斷，磷酸二氫鉀 F 值最大，其對模型的影響高于蔗糖與蛋白脈。

響應面圖的陡峭程度可直接反映各影響因素交互作用強弱，由圖3可知，蔗糖與磷酸二氫鉀的陡峭程度（圖3B）高于蛋白陳與蔗糖（圖3A）、蛋白陳與磷酸二氫鉀（圖3C），說明蔗糖與磷酸二氫鉀的交互作用顯著，蔗糖與蛋白脈、蛋白肺與磷酸二氫鉀的交互作用不顯著。對模型進行分析預測，得到鹿茸菇最佳液體培養基采用 21.56g/L 蔗糖、 4.92g/L 蛋白肺、 2.68g/L 磷酸二氫鉀，培養6d后菌絲體干重為 0.51mg/mL 。

2.4鹿茸菇菌絲體多糖抗氧化活性能力分析

在波長 517nm 處測定不同濃度鹿茸菇菌絲體多糖對DPPH自由基和ABTS自由基的清除率，并以 v_c 作為陽性對照。結果表明，隨著濃度的增加，鹿茸菇菌絲體多糖對DPPH自由基和ABTS自由基的清除率逐漸增強。當菌絲體多糖濃度為0.1mg/mL 時，其對DPPH自由基和ABTS自由基的清除率分別為 10.88% 和 2.58% ；濃度為 10mg/mL 時，對兩種自由基的清除率分別為 85.20% 和78.94% ；濃度為 50mg/mL 時，對兩種自由基的清除率分別為 90.99% 和 91.50% ，均達 90% 以上（圖4），說明鹿茸菇菌絲體多糖有較好的抗氧化活性，其對DPPH自由基清除率的 IC₅₀ 值為 1.26mg/mL 對ABTS自由基清除率的 IC₅₀ 值為 5.95mg/mL 。

3小結與討論

目前食用菌多采用固體菌種和液體菌種進行栽培，由于固體菌種萌發速度較慢，而且有很大幾率受到污染，故目前多采用液體菌種培養的方式進行食用菌栽培，而液體培養基成分對鹿茸菇菌種生長影響很大。宋琪等[17]提出氮素在基質中通過促進菇類菌絲細胞中酶、輔酶、核酸等物質合成的數量進而影響其新陳代謝與營養元素的吸收轉化速度。盛思遠等[18]的研究發現，向液體發酵培養基質中添加磷酸二氫鉀能夠顯著提高菌絲體中的抗氧化酶活性，增強菌絲活力，延長菌絲老化時間，因此液體培養基中無機鹽的添加也很有必要。本研究對鹿茸菇液體培養基配方進行優化，研究結果表明培養基中最佳碳源為蔗糖、氮源為蛋白肺、無機鹽為磷酸二氫鉀，其最佳添加量分別為 22g/L 、 5g/L 、 2.5g/L ；同時采用Box-Behnken響應面法進一步優化了鹿茸菇液體培養基碳源、氮源及無機鹽的組合配比，結果表明在蔗糖 21.56g/L 、蛋白脈 4.92g/L 、磷酸二氫鉀 2.68g/L 的組合條件下進行液體培養，培養6d后鹿茸菇菌絲體生物量最大為 0.51mg/mL ，此優化條件可為鹿茸菇液體菌種培養提供參考。

在多糖抗氧化性方面，王俊龍等[19]采用酶輔助離子液體（EDTA）提取大球蓋菇粗多糖，并測定了其粗多糖對DPPH自由基、ABTS自由基清除率分別可達 82.54% 、 51.62% 。陳蕾等[20]采用超聲波輔助從姬菇中提取多糖，檢測發現其對ABTS清除率達到 50% ，具有一定的抗氧化性。吳夢園等[21]探究了黃綠卷毛菇產胞外多糖的最佳條件，并測定其對于DPPH清除率達到了 71.0% 。本研究發現鹿茸菇菌絲體多糖對DPPH、ABTS自由基的清除能力隨多糖濃度的增加而逐漸增強，當多糖濃度為 50mg/mL 時，對DPPH、ABTS自由基的清除率均可達到 90% 以上，說明鹿茸菇多糖具有一定的抗氧化能力。

綜上，本研究通過設置單因素試驗分別探討液體培養基3種不同的碳源、氮源、無機鹽對鹿茸菇菌絲體生長的影響，確定了適宜于鹿茸菇液體菌種生長的培養基成分為蔗糖、蛋白陳、磷酸二氫鉀。并進一步通過響應面法優化了鹿茸菇液體培養的條件，在 21.56g/L 蔗糖、 4.92g/L 蛋白陳、 2.68g/L 磷酸二氫鉀、 0.5g/L 硫酸鎂、 10mg/L 維生素B1、溫度 24^°C 、轉速 180r/min 的條件下培養至6d時，菌絲體干重達 0.51mg/mL 。同時采用水提醇沉法提取鹿茸菇菌絲體多糖并研究其抗氧化能力，結果表明鹿茸菇菌絲體多糖在0.1～50mg/mL 濃度范圍內，對DPPH、ABTS自由基的清除能力隨多糖濃度的增加而增強，當多糖濃度為 50mg/mL 時，自由基清除率最高可達 90% 以上。

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（責任編輯：許玲）

收稿日期：2025-03-01

基金項目：福建省星火項目（2021S0036）；福建省廈門市科技計劃項目（3502Z20226030）

作者簡介：*為通訊作者，于海玲（1989—），女，講師，博士，主要從事園藝植物栽培與管理研究，E-mail：yuhl@hqu.edu.cn。李妍（2001—），女，碩士研究生，主要從事生物學研究，E-mail：1943029717@qq.com