波羅蜜花粉生活力測定與花粉萌發培養基的優化

中圖分類號：S667.8 文獻標識碼：A 文章編號：2095-5774（2025）02-0148-07

Determination of pollen viability and optimization of pollen germination medium in Artocarpus heterophyllusLam.

He Hui， Wu Weihao，Luo Zhongjun，Tan Qiaoru， Feng Feng* （College of Coastal Agricultural Sciences，Guangdong Ocean University，Zhanjiang， Guangdong ，China）

Abstract：【Objective】This studyaimed to screentheoptimalmedium formulationfor in vitro germinationofArtrocarpus heterophylusLam.pollenandtoevaluate theapplicabilityofrapid staining methodfordetectingpollenviability.【Method] Pollen of‘Siji’A.heterophylus was used as experimental material to measure pollen germinationrateandoptimize polln culture medium composition by single factor test and orthogonal test.【Result】The effects of sucrose， H₃BO₃ ， CaCl₂ and MgS0₄ on pollen germination rate were significant， with CaCl₂ ranking first，followed by sucrose， H₃BO₃ ，and MgSO₄ . The optimummedium formulawas 5% sucros Ω³+150mg/LH₃BO₃+100mg/LCaCl₂+150mg/LMgS0₄ ，and the germination rate was72.39%，which was significantly higher than other treatments.The optimum germination temperature was 27% ： Both theMTTstaining method（10 min staining，62.99%viability）andthe TTC staining method（45 min staining， 78.58% （20 viability）couldbeusedforrapid detectionof pollen viability.The MTTstaining method was more eficientand had better contrast ratio while the magenta acetate and I₂ -KI methods were not applicable.【Conclusion】The results provide a theoreticalbasisandpracticalsupportforpollenviabilitydeterminationandartificialpolination technology inA. heterophyllus.crossbreeding.

Keywords：Artocarpus heterophylus；polen；viability；germination；medium；MT（2，5-diphenyl monotetrazolium bromide）staining; TTC（triphenyl tetrazolium chloride） staining

波羅蜜（ArtocarpusheterophyllusLam.）為桑科（Moraceae）波羅蜜屬（Artocarpus）典型的熱帶果樹，別名木菠蘿、樹菠蘿等，英文名Jackfruit[1]原產于印度西高正山脈的雨林，現世界各地廣泛栽培，主要分布于南亞、東南亞和澳大利亞等地[2。波羅蜜用途廣泛，兼具食用、藥用與經濟價值，是我國南方重要的優稀果樹之一[3]。盡管波羅蜜具有諸多優勢，但作為經濟作物的普及度卻十分有限，研究人員嘗試通過培育具有高質量波羅蜜品種進行推廣普及[4]。

波羅蜜是雌雄同株、異花授粉的果樹，不同品種間的開花模式不一致，是育種計劃的主要障礙[5，其中花粉的活力和萌發特性是波羅蜜雜交育種的關鍵介質，國外通常采用Brewbakers和Kwack的培養基配方對波羅蜜花粉進行活力檢測，再利用低溫保存花粉實現波羅蜜新優品種的育種計劃[6]。國內目前僅見吳鈿等[7]、余慶等[8]對波羅蜜花粉進行萌發培養，所用的培養基配方以蔗糖、 H₃BO₃ 和 CaCl₂ 為主?，F有的研究對波羅蜜花粉萌發的研究較少，有必要進一步優化波羅蜜花粉培養基進行優化。此外，通過染色法快速鑒定花粉生活力的方法已在其它熱帶果樹上有效驗證，但是在波羅蜜花粉生活力檢測上未見報道[9]。因此，本研究以一年多次開花結果的‘四季波羅蜜品種為試驗材料，使用廣泛應用于花粉萌發用的培養基因素（蔗糖、 H₃BO₃ 、 MgSO₄ 和 CaCl₂ ）對波羅蜜花粉進行單因素萌發試驗；篩選出各因素最佳的濃度配方后，再結合正交試驗設計篩選出最佳的波羅蜜花粉萌發培養基配方；最后將最佳培養基配方的萌發效果與染色法進行比較，篩選出快速精準的波羅蜜花粉生活力檢測法。研究結果為生產實踐中的波羅蜜人工輔助授粉和雜交育種計劃提供思路和理論依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗材料來自廣東省波羅蜜種質資源圃（廣東海大）內種植的‘四季波羅蜜’品種（粵審果2009019）?！募静_蜜’可四季成花坐果、全年結果，是優良的波羅蜜授粉樹，其花粉萌發和活力測定對波羅蜜育種有重要意義。于2025年1月5日，選擇長勢良好、無病蟲害和開花旺盛的3株波羅蜜作為采粉樹，每株從不同方位取10個即將開放的雄花，立即帶回試驗室，使用干凈毛筆將波羅蜜花穗上的花粉輕輕刷在硫酸紙上，收集花粉混勻，去除明顯雜質，依據試驗設計，現配配方培養基開展試驗。

1.2試驗方法

1.2.1花粉培養基單因素試驗

設計‘四季波羅蜜’花粉萌發培養基單因素試驗，篩選最佳的蔗糖、 H₃BO₃ 、 CaCl₂ 、 MgSO₄ 濃度以及適宜的溫度，見表1。單因素試驗方法根據殷陳陳等[10]的辦法改動，即除了按照試驗計劃改變待測因素外，其他條件都與序號3條件保持一致。

1.2.2花粉培養基正交試驗

依據1.2.1方法的試驗數據，開展四因素三水平的正交試驗設計，各因素和水平見表2，于單因素試驗中測出的最佳溫度內進行培養。每組重復5次，統計不同培養基配方下的波羅蜜花粉萌發率。

表2正交試驗水平中的各因素和水平

1.2.3花粉萌發培養與觀測方法

本試驗設計現配培養基，取適量液體培養基滴于凹面載玻片的凹槽部位，用毛筆將新鮮花粉均勻地灑在液體培養基上，將載玻片放置在底部墊有濕潤紗布的培養皿內，于 28^°C 人工氣候箱中培養 ^2h 。每張載玻片隨機觀察5個視野，每個視野統計不少于30粒花粉，統計花粉萌發數，計算萌發率，花粉管長度大于等于花粉粒直徑即判斷為萌發，花粉萌發率 萌發的花粉數/每個視野總花粉數 ×100% [11]

1.3花粉生活力快速檢測方法

醋酸洋紅染色法參考王清蕓等[1]的方法配制；I₂-KI （碘-碘化鉀）染色法參考宋靜等[13的配制；MTT（二苯基四氮唑溴鹽）染色法參考李緒杰等[14]的方法配制；TTC（氯化三苯四氮唑）染色法參考Sutthinon等[15]的方法配制。將波羅蜜花粉均勻撒在凹面載玻片上，滴上不同染色液進行觀察。

1.4統計分析

花粉試驗在光學顯微鏡下400倍放大倍數下觀察并拍照，利用Excel2010、SPSS26.0對數據進行統計分析，用GraphPadPrism10繪制圖表。

2結果與分析

2.1波羅蜜花粉離體萌發培養基的優化

2.1.1不同培養基與溫度對波羅蜜花粉的影響

單因素試驗結果表明，各因素條件范圍下波羅蜜花粉萌發呈顯著差異。圖1（A）結果表明，波羅蜜花粉的萌發會受到蔗糖濃度的顯著影響，其中低濃度蔗糖有助于其萌發，而高濃度蔗糖則會起到抑制作用。隨著蔗糖濃度的提高，花粉萌發率呈顯著上升后顯著下降的趨勢，在 5% 的蔗糖濃度條件下，花粉的萌發率達到了峰值，為 47.84% 。從圖1（B）可以看出， H₃BO₃ 對花粉的萌發具有一定的促進效果，在不添加 H₃BO₃ 的情況下，花粉依然可以萌發，達 29.06% ；隨著培養基 H₃BO₃ 濃度的提高，花粉萌發率顯著上升，在濃度為 150mg/L 時萌發率達到最高值，為 50.24% ，隨后花粉萌發率顯著下降。圖1（C）結果表明，隨著培養基 MgSO₄ 的濃度升高，花粉萌發率顯著升高，在 150mg/L 下達到最高值，為 46.52% ，隨后顯著下降。圖1（D）結果表明，隨著 CaCl₂ 的濃度升高，花粉萌發率顯著升高，在 100mg/L 時花粉萌發率達到最高值，為41.59% ，隨后顯著下降。由圖1E可知，花粉萌發最適溫度為 27% ，在 21^qC 時花粉萌發率萌發率為21.84% ，表明波羅蜜花粉的萌發需要一定溫度，溫度不足會影響花粉萌發，在 33^°C 下花粉萌發率僅為13.01% ，表明過高的溫度會抑制花粉的萌發。

注：A，蔗糖濃度；B， H₃BO₃ 質量濃度；C， MgSO₄ 質量濃度；D， CaCl₂ 質量濃度;E，溫度。顯著性差異用不同小寫英文字母表示 （Plt;0.05） 。

Note：A，sucrose concentration；B， H₃BO₃ mass concentration；C， MgSO₄ mass concentration；D， CaCl₂ concentration；E，temperatures.Differentlowercase lettersshowsignificant differences（ _Plt;0.05 ）

Figure1Effects of diferent culture conditions on pollen germination rate of Artocarpus heterophylus Lam.

2.1.2正交試驗結果

正交試驗結果揭示了波羅蜜花粉萌發的差異性（見表3），結果表明在不同培養基中花粉萌發率存在顯著不同。其中6號培養基 ?A₂B₃C₁D₂? 下的花粉萌發率最高，達 68.74% ，顯著高于其它培養基；其次是9號培養基（ |A₃B₃C₂D₁ ）和2號培養基 （A₁B₂C₂D₂） ，花粉萌發率分別為 51.08% 和48.85% ；而3號培養基（ （A₁B₃C₃D₃ ）下的花粉萌發率最低，僅 13.58% ，顯著低于其它培養基，兩者相差 55.16% 。

對表3的波羅蜜花粉離體萌發正交試驗結果進行極差分析和方差分析。極差分析表明（表4），4個因素對波羅蜜花粉萌發率的影響主次關系依次為C（ CaCl₂ ）、A（蔗糖）、B（ H₃BO₃ ）、D（MgSO₄） 。最適宜的波羅蜜花粉培養基為 A₂B₃C₂D₂ 即 5% 蔗糖、 150mg/LH₃BO₃ 、 100mg/L （204號 CaCl₂ 150mg/LMgS0₄ 。但試驗結果表明 A₂B₃C₁D₂ 為波羅蜜花粉最佳萌發率組合，即 5% 蔗糖、 150mg/L H₃BO₃ 、 50mg/LCaCl₂ 、 150mg/LMgS0₄ ，因此，需要通過方差分析進一步驗證。

結果表明，波羅蜜花粉的萌發率受到蔗糖、H₃BO₃ 、 CaCl₂ 、 MgSO₄ 極顯著的影響，它們是波羅蜜花粉萌發的主要影響因素。影響波羅蜜花粉萌發率的因素排序為（F值大?。?C（CaCl₂ 、A（蔗糖）、B （H₃BO₃） 、D （MgSO₄） ，驗證了極差分析結果。

極差分析和方差分析（表5）結果表明，對波羅蜜花粉的萌發率具有顯著影響的主要因素為CaCl₂ 。多重比較結果表明， CaCl₂ 濃度對萌發率影響效果表現為 100mg/Lgt;50mg/Lgt;150mg/L ，其中前兩者和 150mg/L 濃度之間存在顯著差異，說明一定的 CaCl₂ 濃度有利于波羅蜜花粉的萌發，較高的 CaCl₂ 濃度反而會抑制波羅蜜花粉的萌發。蔗糖濃度對萌發率影響效果表現為 5%gt;10%gt;0% ，表明一定的蔗糖濃度可以促進波羅蜜花粉的萌發，較高的蔗糖會抑制波羅蜜花粉的萌發，各水平呈現不顯著差異與單因素試驗結果相近，可能是蔗糖濃度篩選梯度范圍不夠大，沒有體現出顯著差異。H₃BO₃ 濃度對萌發率影響效果表現為 150mg/Lgt; 100mg/Lgt;50mg/L ，表明隨著 H₃BO₃ 濃度的提高，有利于波羅蜜花粉的萌發，其中 150mg/L 與 50mg/L 呈現出顯著差異。 MgSO₄ 濃度對萌發率影響效果表現為 150mg/Lgt;100mg/Lgt;200mg/L ，表明適量的MgSO₄ 能夠促進花粉的萌發，然而 MgSO₄ 濃度過高則會對花粉萌發產生抑制作用，其中 150mg/L 和 100mg/L 濃度與 200mg/L 呈無顯著差異。綜上所述，波羅蜜花粉萌發的最佳培養組合為A₂B₃C₂D₂ ，即 5% 蔗糖 +150mg/LH₃BO₃+100mg/L CaCl₂+150mg/LMgSO₄

2.1.3最佳花粉萌發培養基驗證

單因素試驗顯示 5% 蔗糖（萌發率為 47.84% ）、150mg/LH₃BO₃ （萌發率為 50.24% ）、 100mg/L CaCl₂ （萌發率為 41.59% ）、 150mg/LMgS0₄ （萌發率為 46.52% ）分別為最佳；在正交試驗部分，A₂B₃C₁D₂ 配方 5% 蔗糖 +150mg/LH₃BO₃+50mg/L CaCl₂+150mg/LMgSO₄ （萌發率為 68.74% ）效果最好，進一步根據多重比較得出波羅蜜花粉萌發的最優培養組合為 A₂B₃C₂D₂ ，即 5% 蔗糖 +150mg/L H₃BO₃+100mg/LCaCl₂+150mg/LMgSO₄° 但A₂B₃C₂D₂ 的實際培養基效果還不清楚，因此需進一步驗證。驗證試驗結果表明（圖2）， A₂B₃C₂D₂ 能有效促進波羅蜜花粉的萌發，平均發芽率達 72.39% O這一結果中的各因素水平與單因素中各因素的最佳水平一致，但是單因素的配方是建立在除了按照試驗計劃改變待測因素外，以 10% 蔗糖 +150mg/LH₃BO₃+100mg/LCaCl₂+150mg/L MgSO₄ 的基礎培養基配方下進行的。正交試驗下的萌發率顯著高于單因素的各個水平，雖然各因素間是否交互作用尚不清楚，需要對各因素進行更深入的研究來明確各因素的最佳水平。然而，在本試驗條件下， A₂B₃C₂D₂ 組合表現出了最高的波羅蜜花粉萌發率，因此可以認為它是當前試驗條件下的最優組合。

2.2花粉生活力快速檢測方法篩選

采用醋酸洋紅染色法、TTC染色法、MTT染色法、 -KI染色法4種染色法對波羅蜜花粉進行染色。結果表明，醋酸洋紅染色法和 I₂-KI 均不能用于波羅蜜花粉染色，前者將花粉全部染色，后者全部無法染色（圖3），重復試驗結果，結果依然不能染色。其中TTC染色法可以使波羅蜜花粉變紅，但是顏色較淡，但是染色時間較久，需要45min以后才可以染色，花粉生活力為 78.58% ，相對最佳培養基萌發法的 72.39% 偏高。MTT染色法可以快速使花粉變成藍紫色，顏色對比度較高，平均 10min 即可染色，平均染色率為 62.99% ，比最佳花粉培養基的萌發率較低。因此，采用TTC法和MTT法均可以快速檢測波羅蜜花粉生活力，MTT法效率更高，染色對比度較高，更適合在實際生產上應用。

3討論

體外花粉萌發與花粉生活力檢測為加速波羅蜜育種遺傳改良提供了一種新的方法和策略。這是一種非常方便和有效的技術，用于研究花粉生物學的基本和許多應用方面[16]。本研究通過單因素試驗和正交試驗系統篩選了波羅蜜花粉離體萌發的最佳培養基配方，并對比了多種染色法在花粉生活力檢測中的適用性，為波羅蜜雜交育種和人工輔助授粉提供了理論依據和技術支持。

各種萌發培養基測試和培養條件可能影響特定物種的花粉萌發，例如，濕度、溫度、基因型差異、植物活力和生理階段以及用于萌發的基質成分（鈣、硫酸鎂、硝酸鉀和硼酸等）都會影響花粉萌發[16]。在本研究中，波羅蜜花粉的萌發受到CaCl2的顯著影響，其最適宜的濃度為 100mg/L 此與鈣離子在花粉管生長過程中的信號傳導功能緊密相關，鈣離子在觸發花粉萌發和控制花粉管生長等方面扮演著重要角色[17-18]。適量的外來鈣離子對花粉萌發和花粉管生長有益，但鈣離子濃度過高則會抑制花粉萌發[19]。蔗糖在培養基中的補充至關重要，因為它在花粉萌發和花粉管形成過程中充當主要營養來源[16]。然而，在本研究中即便缺少蔗糖，萌發率也達到了 36.37% ， 5% 蔗糖顯著提高了萌發率，但當濃度提升至 10% 至 20% 時，萌發率卻有所降低。 H₃BO₃ 和 MgSO₄ 分別通過促進糖代謝和酶活性對萌發起正向作用，但其效應弱于 CaCl₂ ，表明波羅蜜花粉萌發對鈣離子的依賴性較高。單因素試驗表明， 27% 為波羅蜜花粉萌發的最適溫度，花粉萌發率隨溫度升高出現先上升后下降的趨勢，這一結果與殷陳陳等[對風鈴木花粉生活力的研究的一致。

在本研究中，由正交試驗篩選出的最佳配方為 5% 蔗糖 +150mg/LH₃BO₃+100mg/LCaCl₂+ 150mg/LMgS0₄ ，與余慶等[篩選出波羅蜜最佳培養基為 100g/L 蔗糖 +0.12g/L 硼酸 +0.10g/L 氯化鈣相近，與吳鈿等[8]篩選出的 160g/L 蔗糖和0.25g/L 硼酸混合溶液差異較大。這種差異可能與所選用的蔗糖濃度范圍、波羅蜜不同品種花粉含糖量等因素有關。

染色法作為檢驗花粉活性的技術，因其速度快捷和操作簡單而備受青睞，對于雜交育種工作有著重要意義[19]。Luo等[20]通過栗樹（CastaneamollissimaBlume）和錐栗[Castaneahenryi（Skam）Rehderamp;Wilson」的花粉生活力測定研究，篩選出了最佳培養基和最佳花粉生活力檢測染色劑用于改善它們的育種計劃。在本研究中，醋酸洋紅和 I₂ -KI染色法未能有效區分波羅蜜花粉生活力，可能與染色機制及花粉細胞壁特性有關，花粉體內的淀粉含量不足可能是導致 I₂-KI 無法著色的原因[21]。盡管TTC能夠染色花粉，但所需時間較長且顏色淺淡，這可能是因為波羅蜜花粉呼吸作用產生的脫氫酶量較少所致[19]。MTT能快速有效的將波羅蜜花粉生活力檢測出來，與Luo等[20]MTT染色與體外萌發有顯著相關性，MTT染色深度的比例接近發芽率的試驗結果一致。然而，MTT法測得的活力（ 62.99% ）低于離體萌發法（ 72.39% ，TTC法則顯著高估活力（ 78.58% ）。這種差異可能源于染色法僅反映代謝活性，而萌發法直接表征花粉的功能性能力。因此，建議將MTT法作為快速初篩手段，結合離體萌發法進行精準驗證，以平衡效率與準確性。

4結論

本研究通過單因素試驗結合正交試驗確定波羅蜜花粉離體萌發的最優培養基為 5% 蔗糖 +150 mg/L Δ?H₃BO₃+100mg/LCaCl₂+150mg/LMgSO₄ ，萌發率達 72.39% 。其中 CaCl₂ 對萌發率影響最為顯著，其濃度過高（ gt;100mg/L ）會抑制萌發，表明鈣離子在花粉管伸長中具有雙重調控作用。MTT法染色快速（ 10min， ）、對比度高，與萌發法結果相關性較強，適合作為初篩手段；TTC法雖染色較慢且高估活力，但仍具參考價值。醋酸洋紅和 I₂ -KI法因染色機制與花粉特性不匹配而失效。研究結果為波羅蜜雜交育種提供了可靠的萌發培養基配方和高效的活力檢測方法，結合MTT法與離體萌發法可平衡效率與準確性，助力人工授粉及品種改良。未來可進一步擴大蔗糖濃度梯度，并探究花粉細胞壁特性對染色法的潛在影響。

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