二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶1(DGAT1)基因促進(jìn)滯育態(tài)七星瓢蟲(chóng)的脂質(zhì)積累

摘要

七星瓢蟲(chóng)Coccinella septempunctata是一種典型的優(yōu)良捕食性天敵昆蟲(chóng)，廣泛應(yīng)用于害蟲(chóng)生物防治領(lǐng)域。該昆蟲(chóng)以滯育態(tài)成蟲(chóng)越冬，滯育態(tài)雌蟲(chóng)腹部脂質(zhì)大量積累，存活時(shí)間顯著延長(zhǎng)。脂質(zhì)積累是昆蟲(chóng)進(jìn)入滯育狀態(tài)的主要生理特征之一，積累的脂質(zhì)為昆蟲(chóng)種群在滯育期和滯育解除后的基本代謝活動(dòng)提供營(yíng)養(yǎng)和能量，以應(yīng)對(duì)能量物質(zhì)匱乏的不利環(huán)境，從而確保其在惡劣環(huán)境中的生存。本試驗(yàn)的前期研究發(fā)現(xiàn)，滯育態(tài)七星瓢蟲(chóng)腹部積累的脂質(zhì)主要是三酰甘油（triacylglycerol，TAG）。二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶（diacylglycerolOacyltransferase，DGAT）是TAG合成最后一步的催化酶，也是唯一限速酶。然而，人們對(duì)昆蟲(chóng)中的DGAT知之甚少。本研究從七星瓢蟲(chóng)基因組中篩選到了一個(gè)注釋為二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶1（diacylglycerol acyltransferase 1，DGAT1）的基因序列。以七星瓢蟲(chóng)為研究對(duì)象克隆了二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶1基因（CsDGAT1）的ORF閱讀框序列，并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，利用RTqPCR分析了該基因在滯育誘導(dǎo)雌蟲(chóng)和非滯育雌蟲(chóng)中的表達(dá)特征;利用RNAi技術(shù)干擾CsDGAT1基因，測(cè)量了干擾后雌蟲(chóng)體內(nèi)TAG含量。研究結(jié)果表明：七星瓢蟲(chóng)CsDGAT1蛋白與異色瓢蟲(chóng)的CsDGAT1蛋白親緣關(guān)系較近，并且含有8個(gè)保守的活性組氨酸位點(diǎn)。在非滯育條件下，CsDGAT1基因在雌蟲(chóng)脂肪體和卵巢中表達(dá)量較高;在滯育誘導(dǎo)條件下，CsDGAT1在雌蟲(chóng)脂肪體和中腸中表達(dá)量較高。與非滯育條件下的雌蟲(chóng)相比，CsDGAT1基因在滯育誘導(dǎo)的雌蟲(chóng)的脂肪體和中腸中表達(dá)量顯著增加。RNA干擾CsDGAT1基因后，雌蟲(chóng)體內(nèi)TAG含量顯著降低，脂肪積累減少。本研究發(fā)現(xiàn)CsDGAT1基因在滯育態(tài)七星瓢蟲(chóng)的脂質(zhì)積累中發(fā)揮重要作用，為深入探究七星瓢蟲(chóng)滯育的脂肪積累機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。為開(kāi)發(fā)誘導(dǎo)天敵昆蟲(chóng)滯育等技術(shù)提供理論支撐，對(duì)推進(jìn)天敵昆蟲(chóng)在生物防治中的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用具有重要作用。

關(guān)鍵詞

七星瓢蟲(chóng); 二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶1; 脂質(zhì)積累; 滯育; 表達(dá)特征; RNA干擾

中圖分類(lèi)號(hào)：

S 476.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2024395

DiacylglycerolOacyltransferase 1 gene promotes lipid accumulation in diapausing Coccinella septempunctata

CHEN Junjie1#， HAN Shunda1，3#， DONG Wenjing1， GUO Penghui1， LIU Xiaoxiao1，LIU Zhaohan1， ZHANG Lisheng1，2*

（1. State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests， Key Laboratory of Natural Enemy Insects， Ministry

of Agriculture and Rural Affairs， Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193，

China; 2. Shanghai Veterinary Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Shanghai 200241， China;

3. College of Horticulture and Gardening， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300392， China）

Abstract

Coccinella septempunctata is widely used predatory natural enemy insect in biological pest control. It survive the winter as a diapause adult， during which females accumulate substantial abdominal lipids， significantly prolonging survival. Lipid accumulation is a feature of insect diapause， supplying energy and nutrients for basic metabolism during the diapause period and postdiapause recovery， thereby enhancing survival under unfavorable conditions. Previous studies revealed that triacylglycerol （TAG） is the main lipid form in diapause females of C.septempunctata， with significantly increased TAG levels. DiacylglycerolOacyltransferase （DGAT）， the terminal and ratelimiting enzyme in TAG synthesis， remains poorly studied in insects. In this study， we identified a gene encoding DGAT1 （CsDGAT1） based on the genome of C.septempunctata. The fulllength ORF of CsDGAT1 was cloned and analyzed via bioinformatics. RTqPCR was used to examine its expression profile in diapauseinduced and nondiapause females， and RNAi was employed to knock down CsDGAT1 expression and assess the effect on TAG content. Phylogenetic analysis showed that CsDGAT1 is closely related to DGAT1 from Harmonia axyridis and contains eight conserved histidine residues. Under nondiapause conditions， CsDGAT1 was highly expressed in the fat body and ovary; under diapauseinduced conditions， it was primarily expressed in the fat body and midgut. CsDGAT1 expression was significantly upregulated in fat body and midgut of diapauseinduced females compared to nondiapause females. RNAimediated silencing of CsDGAT1 significantly reduced TAG levels and fat accumulation. These results demonstrate that the CsDGAT1 plays an important role in lipid accumulation in diapausing females， providing a molecular basis for understanding diapauserelated lipid metabolism and a theoretical foundation for developing diapauseinduction technologies for natural enemy insects in biological control.

Key words

Coccinella septempunctata; diacylglycerolOacyltransferase 1; lipid accumulation; diapause; gene expression; RNA interference

七星瓢蟲(chóng)Coccinella septempunctata捕食范圍廣，捕食能力強(qiáng)，產(chǎn)卵量大，定殖性強(qiáng)，是一種典型的優(yōu)良捕食性天敵昆蟲(chóng)，被廣泛應(yīng)用于害蟲(chóng)生物防治領(lǐng)域［14］。自然條件下，七星瓢蟲(chóng)以滯育態(tài)成蟲(chóng)越冬。滯育態(tài)七星瓢蟲(chóng)腹部脂質(zhì)大量積累，存活時(shí)間最長(zhǎng)可達(dá)120 d［5］。通過(guò)誘導(dǎo)天敵昆蟲(chóng)滯育并長(zhǎng)期貯藏，可大幅延長(zhǎng)產(chǎn)品貨架期，將有利于提高天敵昆蟲(chóng)的規(guī)模化繁育和田間應(yīng)用水平，從而促進(jìn)其在生物防治中的應(yīng)用［67］。脂質(zhì)積累是昆蟲(chóng)進(jìn)入滯育狀態(tài)的主要生理特征之一，這一生理變化為昆蟲(chóng)種群在滯育期和滯育解除后的基本代謝活動(dòng)提供營(yíng)養(yǎng)和能量，以應(yīng)對(duì)能量物質(zhì)匱乏的不利環(huán)境，從而確保其在惡劣環(huán)境中的生存［8］。這一現(xiàn)象在滯育的七星瓢蟲(chóng)［910］、庫(kù)蚊Culex pipiens［1112］、大猿葉甲Colaphellus bowringi［1314］ 和沙蔥螢葉甲Galeruca daurica［15］的研究中均有發(fā)現(xiàn)。昆蟲(chóng)的脂肪體在能量?jī)?chǔ)存和利用中起著至關(guān)重要的作用。昆蟲(chóng)的能量?jī)?chǔ)存方式主要是以糖原和三酰甘油（triacylglycerol，TAG）的形式儲(chǔ)存在脂肪細(xì)胞（主要的脂肪體細(xì)胞）中［16］。滯育階段的七星瓢蟲(chóng)生殖系統(tǒng)發(fā)育會(huì)受到抑制，雌性成蟲(chóng)卵巢發(fā)育停滯，卵小管內(nèi)無(wú)卵黃，且整個(gè)腹部堆積了大量脂肪，脂含量和總糖含量顯著增加［1719］。進(jìn)一步研究表明，在滯育期間，脂肪酸合成中一系列相關(guān)酶，脂肪酸合酶（fatty acid synthase， FAS）、酰基CoAΔ11去飽和酶［acylCoA delta（11） desaturase，F(xiàn)ADΔ11］、乙酰輔酶A羧化酶（acetylCoA carboxylase， ACC）、長(zhǎng)鏈脂肪酸輔酶Ａ連接酶（long chain fatty acidCoA ligase， ACSL）、超長(zhǎng)鏈脂肪酸延伸酶（elongase of very long chain fatty acids， ELO）和3酮酯酰輔酶Ａ還原酶（verylongchain 3ketoacylCoA reductase， KAR）基因的顯著高表達(dá)是導(dǎo)致滯育雌蟲(chóng)脂肪積累的重要原因［2021］。此外，滯育態(tài)七星瓢蟲(chóng)腹部積累的脂質(zhì)主要是三酰甘油，滯育態(tài)雌蟲(chóng)體內(nèi)三酰甘油含量顯著升高［10， 19， 22］。滯育雌蟲(chóng)體內(nèi)脂肪的積累不僅可確保種群能夠順利進(jìn)入滯育，也為滯育種群滯育解除后的發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)與能量。

TAG有2種合成方式［23］：1）磷脂酸在磷脂酸磷酸酶作用下，水解釋放出磷酸轉(zhuǎn)變?yōu)槎８视停╠iacylglycerol，DAG），在二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶1（diacylglycerolOacyltransferase 1，DGAT 1）的作用下酯化促進(jìn)TAG生成;2）脂酰輔酶A在單酰基甘油酯酰轉(zhuǎn)移酶作用下酯化促進(jìn)3磷酸甘油生成DAG，DAG與脂酰輔酶A在二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶2（DGAT 2）作用下酯化促進(jìn)TAG生成。無(wú)論哪種方式，DGAT都是TAG合成最后一步的催化酶與限速酶［24］。DGAT1屬于酰基輔酶A膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶家族，是一種完整的膜蛋白，可作用于DAG和脂肪酰基CoA1促進(jìn)TAG合成。DGAT1是生物體脂肪吸收和脂肪存儲(chǔ)所必需的;DGAT2屬于單酰基甘油酯酰轉(zhuǎn)移酶家族，在哺乳動(dòng)物脂肪合成過(guò)程中催化DAG與脂酰輔酶A（acyl CoA）縮合形成TAG［25］。研究發(fā)現(xiàn)二者催化相同的酶促反應(yīng)，并且在脂肪組織、腸道和肝臟中均有表達(dá)［2627］。

本研究克隆七星瓢蟲(chóng)二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶1（DGAT 1）基因的開(kāi)放閱讀框（ORF），進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)和多序列比對(duì)分析;利用RTqPCR分析CsDGAT1在滯育誘導(dǎo)雌蟲(chóng)和非滯育誘導(dǎo)雌蟲(chóng)中的表達(dá)特征。運(yùn)用RNAi技術(shù)對(duì)CsDGAT1進(jìn)行干擾，并對(duì)干擾后雌蟲(chóng)體內(nèi)TAG含量進(jìn)行測(cè)量。旨在為深入探究滯育七星瓢蟲(chóng)的脂肪積累機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為七星瓢蟲(chóng)滯育調(diào)控技術(shù)開(kāi)發(fā)提供理論支撐，促進(jìn)天敵產(chǎn)品在綠色生物防治產(chǎn)業(yè)中的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 供試蟲(chóng)源

供試蟲(chóng)源為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所天敵昆蟲(chóng)組的七星瓢蟲(chóng)室內(nèi)種群。在溫度（24±1）℃和相對(duì)濕度70%，光周期L∥D=16 h∥8 h條件下，以新鮮的豆蚜Aphis glycines飼養(yǎng)。參考王偉等的方法［18］，七星瓢蟲(chóng)正常發(fā)育飼養(yǎng)條件（非滯育條件）為（24±1）℃、（70±10）% RH、光周期L∥D=16 h∥8 h;其滯育誘導(dǎo)條件為（18±1）℃、（70±10）% RH、光周期L∥D=10 h∥14 h。

1.2 非滯育與滯育誘導(dǎo)條件下飼養(yǎng)的雌蟲(chóng)組織樣品收集

將新羽化的雌蟲(chóng)放入正常發(fā)育/非滯育條件下，飼養(yǎng)5 d （N5）、10 d （N10）、15 d （N15）和20 d （N20）的雌蟲(chóng)作為正常發(fā)育組。將新羽化的雌蟲(chóng)放入滯育誘導(dǎo)條件下飼養(yǎng)，滯育誘導(dǎo)5 d （D5）、10 d （D10）、15 d （D15）和20 d （D20）的雌成蟲(chóng)作為滯育組。在室溫條件下，快速地用昆蟲(chóng)針?lè)謩e將滯育態(tài)雌蟲(chóng)（D5，D10，D15和D20）和非滯育態(tài)雌蟲(chóng)（N5，N10，N15和N20）個(gè)體固定在石蠟盤(pán)上。用手術(shù)剪和解剖鑷解剖，收集頭、胸、脂肪體、卵巢和中腸5個(gè)部位。收集的組織樣品放入液氮速凍后放入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 CsDGAT1基因的克隆與序列分析

1.3.1 總RNA提取及cDNA合成

將試蟲(chóng)組織置于液氮預(yù)冷，向電動(dòng)研磨杵研磨后的樣品中加入TRizol UP試劑（北京全式金生物科技公司），根據(jù)使用說(shuō)明提取總RNA。在微量分光光度計(jì)（NanoPhotometer Pclass，Implen）上檢測(cè)RNA濃度，并用12% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整性。按照TransScriptOneStep gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京全式金有限技術(shù)公司）操作說(shuō)明合成cDNA模板，置于-20℃保存。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增

基于七星瓢蟲(chóng)基因組信息（http：∥v2.insectgenome.com/Organism/194），篩選到了一個(gè)注釋為CsDGAT1的序列，利用 Primer 60設(shè)計(jì)基因克隆引物及熒光定量引物（表1）。所有引物均由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)公司合成。以滯育七星瓢蟲(chóng)cDNA為模板，利用CsDGAT1F和CsDGAT1R擴(kuò)增CsDGAT1的ORF序列。反應(yīng)體系（50 μL）：PCR Mix 25 μL，上、下游引物各25 μL，cDNA 1 μL，超純水 19 μL。反應(yīng)程序：98℃變性2 min;98℃ 10 s，55℃ 15 s，72℃ 15 s，30個(gè)循環(huán);72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收純化目的條帶并連接至克隆載體pEASYBlunt Simple （北京全式金生物技術(shù)有限公司），轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，氨芐青霉素篩選后挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)送至北京擎科生物公司測(cè)序。

1.3.3 CsDGAT1基因序列分析

序列結(jié)果利用DNAMAN 90進(jìn)行分析并完成序列拼接。利用NCBI上的ORF Finder （https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）查找基因開(kāi)放閱讀框、利用ExPASy （http：∥web.expasy.org/translate/）軟件翻譯預(yù)測(cè)氨基酸序列、利用NCBI在線軟件CDD （http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）分析氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域。所得氨基酸序列通過(guò)NCBI的Blast程序（http：∥blast.Ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）與GenBank中的nr庫(kù)進(jìn)行同源性搜索，并用ClustalW 2和ESPript 30網(wǎng)站與其他昆蟲(chóng)同源序列進(jìn)行多序列比對(duì)（表2），采用MEGA 70軟件中的鄰接法（neighborjoiningmethod）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，各分支重復(fù)檢驗(yàn)次數(shù)均為1 000次。

1.4 RNAi介導(dǎo)的CsDGAT1基因沉默

以七星瓢蟲(chóng)CsDGAT1基因ORF序列為模板，設(shè)計(jì)引物合成雙鏈RNA（dsRNA）用于CsDGAT1基因的沉默。在設(shè)計(jì)好的引物5′端添加T7啟動(dòng)子序列TAATACGACTCACTATAGGG（表1），以綠色熒光蛋白（GFP）序列為模板合成雙鏈RNA（dsGFP），并以此作為RNA干擾的對(duì)照組。選取初羽化48 h內(nèi)的大小一致的七星瓢蟲(chóng)雌蟲(chóng)，使用顯微注射儀Nanoject Ⅲ （德拉蒙德科學(xué)公司），將dsRNA注射進(jìn)試蟲(chóng)體內(nèi)。注射部位為七星瓢蟲(chóng)第2、3腹節(jié)間膜，注射體積為1 μL（約2 μg/μL）。共設(shè)置3組RNA干擾試驗(yàn)：1）RNA干擾對(duì)CsDGAT1基因表達(dá)的影響。于注射后2 d采集七星瓢蟲(chóng)，采用RTqPCR分析CsDGAT1基因表達(dá)量的變化（引物參見(jiàn)表1），每個(gè)處理設(shè)置7個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)2頭成蟲(chóng)。2）RNA干擾CsDGAT1基因?qū)θ８视停═AG）含量的影響。為增強(qiáng)RNA干擾的持續(xù)效果，在注射的第7天增加了一次加強(qiáng)針，即再注射同等體積和濃度的dsRNA。取dsRNA注射14 d的試蟲(chóng)（從第一次注射開(kāi)始），用無(wú)菌水沖洗并用濾紙擦干凈。稱(chēng)重后放入15 mL離心管中，采用TAG檢測(cè)試劑盒（單試劑GPOPAP法，南京建成生物工程研究所，A11011）檢測(cè)樣品的三酰甘油含量。6次生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)2～3頭雌蟲(chóng)。3）RNA干擾CsDGAT1基因?qū)Υ葡x(chóng)腹部脂肪積累的影響。為增強(qiáng)RNA干擾的持續(xù)效果，在注射第7天增加一次加強(qiáng)針。取dsRNA注射14 d的試蟲(chóng)，用解剖鑷和手術(shù)刀剪掉其內(nèi)外翅和六足后，將其固定在石蠟盤(pán)上。在顯微鏡下將試蟲(chóng)背部表皮輕輕撕下，用超景深顯微鏡（Leica VHX2000，基恩士）對(duì)其腹部脂肪積累情況進(jìn)行拍照。

1.5 相關(guān)基因的實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)

RTqPCR試驗(yàn)用于檢測(cè)CsDGAT1基因在不同時(shí)期各組織中的表達(dá)量以及其干擾效率。采用TOROGreen5G qPCR Premix （上海百靈克生物科技有限公司），反應(yīng)體系（20 μL）： TOROGreen5G qPCR Premix 10 μL，上、下游引物各08 μL，cDNA 1 μL，超純水74 μL。反應(yīng)程序：95℃ 5 min;98℃ 10 s，56℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。所有試驗(yàn)都設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，3個(gè)技術(shù)重復(fù)。基因的相對(duì)表達(dá)量計(jì)算采用2-ΔΔCT法［28］，內(nèi)參為CsActin基因（引物序列見(jiàn)表1）。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行分析。滯育誘導(dǎo)和非滯育條件下的雌蟲(chóng)的各組織樣品（頭，胸，中腸，脂肪體和卵巢）中CsDGAT1的相對(duì)表達(dá)量，同一處理?xiàng)l件下不同時(shí)間點(diǎn)之間的樣本中CsDGAT1的相對(duì)表達(dá)量采用單因素方差分析（Oneway ANOVA）及Tukey多重比較進(jìn)行分析；同一時(shí)間點(diǎn)下，不同處理?xiàng)l件之間的樣本中的CsDGAT1的相對(duì)表達(dá)量，RNA干擾試驗(yàn)結(jié)果中，處理組和對(duì)照組下雌蟲(chóng)體內(nèi)基因的相對(duì)表達(dá)量和甘油三酯含量采用Student’s ttest檢驗(yàn)進(jìn)行比較。利用Graph Pad Prism 9軟件繪圖。文中所用數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果與分析

2.1 七星瓢蟲(chóng)二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶1基因（CsDGAT1）克隆與序列分析

基于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選出一個(gè)注釋為七星瓢蟲(chóng)二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶1基因（CsDGAT1）的序列信息。通過(guò)RTPCR獲得了CsDGAT1基因的完整開(kāi)放閱讀框（ORF），其長(zhǎng)度為1 470 bp，編碼489個(gè)氨基酸。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，七星瓢蟲(chóng)CsDGAT1蛋白與鞘翅目異色瓢蟲(chóng)Harmonia axyridis的二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶1蛋白親緣關(guān)系較近并聚為一支（圖1）。根據(jù)七星瓢蟲(chóng)CsDGAT1氨基酸序列信息，多重序列比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其第34位至第469位氨基酸為保守的膜結(jié)合O酰基轉(zhuǎn)移酶家族（membrane bound Oacyl transferase family，MBOAT family），并且含有8個(gè)保守的活性組氨酸（His，H）位點(diǎn)殘基（圖2）。

2.2 不同組織部位中CsDGAT1基因表達(dá)量

在雌蟲(chóng)各組織（頭、胸、脂肪體、卵巢和中腸）中均可以檢測(cè)到CsDGAT1基因的表達(dá)。其中在非滯育條件下（N5），CsDGAT1基因在雌蟲(chóng)脂肪體和卵巢中表達(dá)水平較高，在中腸和胸的表達(dá)水平相對(duì)較低，在頭部的表達(dá)水平最低（圖3a）。在滯育誘導(dǎo)條件下（D5），CsDGAT1基因在雌蟲(chóng)脂肪體和中腸中表達(dá)量較高（圖3b）。

2.3 CsDGAT1基因的時(shí)間表達(dá)譜

RTqPCR的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在雌蟲(chóng)脂肪體和中腸組織中，與非滯育組第5天相比，滯育誘導(dǎo)第5天時(shí)CsDGAT1基因表達(dá)量均顯著增加（圖4a，b）。在脂肪體以及中腸組織中，CsDGAT1基因在滯育誘導(dǎo)第5天和非滯育條件第20天時(shí)表達(dá)量較高（圖4a，b）。在卵巢組織中，滯育條件和非滯育條件下的各時(shí)間點(diǎn)，CsDGAT1基因表達(dá)量均無(wú)顯著性差異（圖4c）。

2.4 RNA干擾CsDAGT1基因后七星瓢蟲(chóng)腹部脂肪積累情況

為了明確干擾CsDAGT1基因?qū)ζ咝瞧跋x(chóng)腹部脂肪積累的影響，開(kāi)展了干擾后的雌成蟲(chóng)腹部解剖試驗(yàn)。結(jié)果表明，CsDAGT1基因的干擾效率可達(dá)9810%（圖5b），且干擾后滯育誘導(dǎo)條件下雌成蟲(chóng)腹部無(wú)明顯脂肪積累現(xiàn)象（圖5a）。與對(duì)照組相比，注射dsDAGT第14天時(shí)的七星瓢蟲(chóng)體內(nèi)TAG含量顯著降低（圖5c）。

3 結(jié)論與討論

掌握天敵昆蟲(chóng)滯育調(diào)控技術(shù)手段，對(duì)大幅延長(zhǎng)產(chǎn)品貨架期，提高天敵昆蟲(chóng)的規(guī)模化繁育和田間應(yīng)用水平，促進(jìn)天敵昆蟲(chóng)在生物防治中的作用具有重要意義。然而，對(duì)昆蟲(chóng)滯育分子調(diào)控的了解仍處于起步階段［29］。七星瓢蟲(chóng)是一種典型的優(yōu)良捕食性天敵昆蟲(chóng)，被廣泛應(yīng)用于害蟲(chóng)生物防治領(lǐng)域。多年來(lái)本團(tuán)隊(duì)一直致力于對(duì)其生殖滯育機(jī)理和滯育調(diào)控應(yīng)用的研究。前期的研究結(jié)果表明，低溫短光照條件下（18℃，L∥D=14 h∥10 h）可誘導(dǎo)七星瓢蟲(chóng)進(jìn)入滯育，滯育階段的七星瓢蟲(chóng)生殖系統(tǒng)發(fā)育會(huì)受到抑制，雌性成蟲(chóng)卵巢發(fā)育停滯，內(nèi)無(wú)卵黃，且整個(gè)腹部充滿了大量脂肪，并以三酰甘油（TAG）的形式儲(chǔ)存大量能量［5， 10， 19， 22］。

DGAT1和DGAT2在哺乳動(dòng)物TAG合成中起著重要作用。然而，昆蟲(chóng)TAG代謝的分子機(jī)制尚不清楚。本試驗(yàn)對(duì)七星瓢蟲(chóng)DGAT1基因功能進(jìn)行了初步研究。通過(guò)同源性分析，我們發(fā)現(xiàn)包括七星瓢蟲(chóng)在內(nèi)的大多數(shù)昆蟲(chóng)都有DGAT1基因，較少數(shù)昆蟲(chóng)含有DGAT2基因。本研究克隆了七星瓢蟲(chóng)二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶1（CsDGAT1）基因ORF序列，其長(zhǎng)度為1 470 bp，編碼489個(gè)氨基酸;與鞘翅目異色瓢蟲(chóng)的二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶1蛋白親緣關(guān)系最近，CsDGAT1的第34位至第469位氨基酸為保守的膜結(jié)合O酰基轉(zhuǎn)移酶家族（MBOAT）。MBOAT家族是一類(lèi)廣泛存在于各種生物體內(nèi)的多次跨膜整合酶。該家族催化的O酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)在細(xì)菌細(xì)胞壁生成，在真核生物脂代謝以及分泌蛋白介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等許多生物學(xué)過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用［30］。

昆蟲(chóng)體內(nèi)TAG主要儲(chǔ)存在脂肪體細(xì)胞中的脂滴中［31］。大多數(shù)昆蟲(chóng)脂肪體細(xì)胞不僅產(chǎn)生大量的DAG，而且它們還可以通過(guò)載脂蛋白將DAG輸出到血淋巴循環(huán)中，參與能量的貯存和供應(yīng)。昆蟲(chóng)中腸也會(huì)產(chǎn)生大量的DAG，這些DAG由脂蛋白分泌并運(yùn)輸?shù)街倔w。大多數(shù)的研究表明，DGAT1在已知儲(chǔ)存TAG的3個(gè)主要器官中表達(dá)，即卵巢［32］、中腸［33］ 和脂肪體［16］。在本研究中，七星瓢蟲(chóng)CsDGAT基因主要在脂肪體，中腸和卵巢中顯著高表達(dá)。這一研究結(jié)果和煙草天蛾Manduca sexta DGAT的研究結(jié)果［34］ 相似。本研究中，CsDGAT1基因的表達(dá)是根據(jù)昆蟲(chóng)的生理需求進(jìn)行調(diào)節(jié)的，與非滯育條件相比，滯育誘導(dǎo)第5天雌蟲(chóng)脂肪體和中腸中CsDGAT1基因表達(dá)量顯著增加。這一點(diǎn)與雌蟲(chóng)在滯育條件下以TAG的形式積累大量脂質(zhì)密切相關(guān)。

利用RNAi技術(shù)對(duì)CsDGAT1基因進(jìn)行干擾，干擾效率可以達(dá)9810%，干擾效果好。通常情況下，鱗翅目昆蟲(chóng)的RNA干擾效率較低，但鞘翅目昆蟲(chóng)的RNA干擾效率較高，一般可以達(dá)到95%以上［3536］。七星瓢蟲(chóng)屬于鞘翅目昆蟲(chóng)，該物種的RNAi干擾效率較高，為后續(xù)功能研究帶來(lái)了極大的便利。為確保持續(xù)RNA干擾效果，我們還在第一次注射7 d后增加了一次加強(qiáng)針。為了證實(shí)CsDGAT1基因在滯育雌蟲(chóng)脂肪積累中的重要作用，對(duì)干擾后七星瓢蟲(chóng)雌成蟲(chóng)進(jìn)行解剖觀察和體內(nèi)三酰甘油（TAG）含量測(cè)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾后滯育雌成蟲(chóng)體內(nèi)無(wú)明顯脂肪積累現(xiàn)象（圖5a）。與對(duì)照組相比，注射dsDAGT第7天時(shí)的七星瓢蟲(chóng)體內(nèi)TAG含量顯著降低（圖5）。以上研究結(jié)果表明，CsDGAT1基因有助于促進(jìn)滯育態(tài)七星瓢蟲(chóng)雌蟲(chóng)脂肪的積累。

本研究結(jié)果表明，七星瓢蟲(chóng)在滯育期間CsDGAT1基因表達(dá)增加而造成TAG的大量積累是其脂肪積累的重要原因。此外，我們前期的研究發(fā)現(xiàn)保幼激素（JH）和類(lèi)胰島素信號(hào)通路均是引發(fā)七星瓢蟲(chóng)發(fā)生生殖滯育的關(guān)鍵因素［9，22，37］。在后續(xù)研究中，將繼續(xù)開(kāi)展JH信號(hào)和類(lèi)胰島素信號(hào)對(duì)七星瓢蟲(chóng)CsDGAT1基因功能影響的研究，探究JH信號(hào)和類(lèi)胰島素信號(hào)對(duì)滯育七星瓢蟲(chóng)雌蟲(chóng)的脂肪積累的作用，解析七星瓢蟲(chóng)滯育時(shí)期脂質(zhì)積累的機(jī)制。

參考文獻(xiàn)

［1］ 張禮生， 陳紅印， 李保平. 天敵昆蟲(chóng)擴(kuò)繁與應(yīng)用［M］. 北京： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社， 2014.

［2］ HANCE T， DIXON A F G. Insect predatorprey dynamics： ladybird beetles and biological control ［J］. Journal of Insect Conservation， 2006， 10（4）： 375376.

［3］ HODEK I， MICHAUD J P. Why is Coccinella septempunctata so successful？ （A pointofview） ［J］. European Journal of Entomology， 2008， 105（1）： 112.

［4］ HONEˇK A. The distribution of overwintered Coccinella septempunctata L. （Col. Coccinellidae） adults in agricultural crops ［J］. Zeitschriftfür Angewandte Entomologie， 1982， 94： 311319.

［5］ 任小云. 七星瓢蟲(chóng)滯育的代謝適應(yīng)及脂代謝的轉(zhuǎn)錄組學(xué)機(jī)理研究［D］. 北京： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 2016.

［6］ LENTEREN J. The state of commercial augmentative biological control： plenty of natural enemies， but a frustrating lack of uptake ［J］. Biocontrol， 2011， 57（1）： 120.

［7］ TAUBER M J， TAUBER C A. Insect seasonality： diapause maintenance， termination， and postdiapause development ［J］. Annual Review of Entomology， 1976， 21（1）： 81107.

［8］ HAHN D A， DENLINGER D L. Energetics of insect diapause ［J］. Annual Review of Entomology， 2011， 56（1）： 103121.

［9］ LI Yuyan， CHEN Junjie， LIU Mengyao， et al. Enhanced degradation of juvenile hormone promotes reproductive diapause in the predatory ladybeetle Coccinella septempunctata ［J/OL］. Frontiers in Physiology， 2022， 13： 877153. DOI：103389/fphys2022877153.

［10］CHEN Junjie， GUO Penghui， LI Yuyan， et al. Cathepsin L contributes to reproductive diapause by regulating lipid storage and survival of Coccinella septempunctata （Linnaeus） ［J/OL］. International Journal of Molecular Sciences， 2022， 24（1）： 611. DOI： 103390/ijms24010611.

［11］SIM C， DENLINGER D L. Insulin signaling and FOXO regulate the overwintering diapause of the mosquito Culex pipiens ［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2008， 105（18）： 67776781.

［12］OLADEMEHIN O P， LIU Chengyin， RIMAL B， et al. DsiRNA knockdown of genes regulated by Foxo reduces glycogen and lipid accumulations in diapausing Culex pipiens ［J/OL］. Scientific Reports， 2020， 10（1）： 17201. DOI： 101038/s41598020742926.

［13］TAN Qianqian， LIU Wen， ZHU Fen， et al. Fatty acid synthase 2 contributes to diapause preparation in a beetle by regulating lipid accumulation and stress tolerance genes expression ［J/OL］. Scientific Reports， 2017， 7： 40509. DOI： 101038/srep40509.

［14］ZHU Li， TIAN Zhong， GUO Shuang， et al. Circadian clock genes link photoperiodic signals to lipid accumulation during diapause preparation in the diapausedestined female cabbage beetles Colaphellus bowringi ［J］. Insect Biochemistry and Molecular Biology， 2018， 104： 110.

［15］DUAN Tianfeng， LI Ling， WANG Haichao， et al. MicroRNA miR27653p regulates reproductive diapause by targeting FoxO in Galeruca daurica ［J］. Insect Science， 2022， 30（2）： 279292.

［16］ARRESE E L， SOULAGES J L. Insect fat body： energy， metabolism， and regulation ［J］. Annual Review of Entomology， 2010， 55： 207225.

［17］劉遙. 七星瓢蟲(chóng)雌成蟲(chóng)滯育相關(guān)蛋白差異表達(dá)的研究［D］. 北京： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 2014.

［18］王偉， 張禮生， 陳紅印， 等. 北京地區(qū)七星瓢蟲(chóng)滯育誘導(dǎo)的溫光效應(yīng)［J］. 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào)， 2013， 29（1）： 2430.

［19］任小云， 張禮生， 齊曉陽(yáng)， 等. 滯育七星瓢蟲(chóng)的代謝適應(yīng)與抗寒性評(píng)價(jià)［J］. 環(huán)境昆蟲(chóng)學(xué)報(bào)， 2015， 37（6）： 11951202.

［20］XIANG Mei， ZHANG Hongzhi， JING Xiaoyu， et al. Sequencing， expression， and functional analyses of four genes related to fatty acid biosynthesis during the diapause process in the female ladybird， Coccinella septempunctata L." ［J/OL］. Frontiers in Physiology， 2021， 12： 706032. DOI： 103389/fphys2021706032.

［21］韓艷華. 脂肪酸合酶及酰基CoAΔ11去飽和酶在七星瓢蟲(chóng)滯育中的功能研究［D］. 北京： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 2018.

［22］李萍， 陳俊杰， 劉照涵， 等. CsInR基因影響七星瓢蟲(chóng)滯育時(shí)脂肪積累的研究［J］. 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào)， 2024， 40（4）： 834843.

［23］CASES S， STONE S J， ZHOU Ping， et al. Cloning of DGAT2， a second mammalian diacylglycerol acyltransferase， and related family members ［J］. The Journal of Biological Chemistry， 2001， 276（42）： 3887038876.

［24］WANG Leisheng， XU Shiwei， ZHOU Mengzhen， et al. The role of DGAT1 and DGAT2 in tumor progression via fatty acid metabolism： a comprehensive review ［J/OL］. International Journal of Biological Macromolecules， 2024， 278（Pt 3）： 134835. DOI： 101016/j.ijbiomac2024134835.