二酰甘油酰基轉移酶1(DGAT1)基因促進滯育態七星瓢蟲的脂質積累

摘要

七星瓢蟲Coccinella septempunctata是一種典型的優良捕食性天敵昆蟲，廣泛應用于害蟲生物防治領域。該昆蟲以滯育態成蟲越冬，滯育態雌蟲腹部脂質大量積累，存活時間顯著延長。脂質積累是昆蟲進入滯育狀態的主要生理特征之一，積累的脂質為昆蟲種群在滯育期和滯育解除后的基本代謝活動提供營養和能量，以應對能量物質匱乏的不利環境，從而確保其在惡劣環境中的生存。本試驗的前期研究發現，滯育態七星瓢蟲腹部積累的脂質主要是三酰甘油（triacylglycerol，TAG）。二酰甘油酰基轉移酶（diacylglycerolOacyltransferase，DGAT）是TAG合成最后一步的催化酶，也是唯一限速酶。然而，人們對昆蟲中的DGAT知之甚少。本研究從七星瓢蟲基因組中篩選到了一個注釋為二酰甘油酰基轉移酶1（diacylglycerol acyltransferase 1，DGAT1）的基因序列。以七星瓢蟲為研究對象克隆了二酰甘油酰基轉移酶1基因（CsDGAT1）的ORF閱讀框序列，并進行了生物信息學分析，利用RTqPCR分析了該基因在滯育誘導雌蟲和非滯育雌蟲中的表達特征;利用RNAi技術干擾CsDGAT1基因，測量了干擾后雌蟲體內TAG含量。研究結果表明：七星瓢蟲CsDGAT1蛋白與異色瓢蟲的CsDGAT1蛋白親緣關系較近，并且含有8個保守的活性組氨酸位點。在非滯育條件下，CsDGAT1基因在雌蟲脂肪體和卵巢中表達量較高;在滯育誘導條件下，CsDGAT1在雌蟲脂肪體和中腸中表達量較高。與非滯育條件下的雌蟲相比，CsDGAT1基因在滯育誘導的雌蟲的脂肪體和中腸中表達量顯著增加。RNA干擾CsDGAT1基因后，雌蟲體內TAG含量顯著降低，脂肪積累減少。本研究發現CsDGAT1基因在滯育態七星瓢蟲的脂質積累中發揮重要作用，為深入探究七星瓢蟲滯育的脂肪積累機制研究奠定基礎。為開發誘導天敵昆蟲滯育等技術提供理論支撐，對推進天敵昆蟲在生物防治中的產業化應用具有重要作用。

關鍵詞

七星瓢蟲; 二酰甘油酰基轉移酶1; 脂質積累; 滯育; 表達特征; RNA干擾

中圖分類號：

S 476.2

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2024395

DiacylglycerolOacyltransferase 1 gene promotes lipid accumulation in diapausing Coccinella septempunctata

CHEN Junjie1#， HAN Shunda1，3#， DONG Wenjing1， GUO Penghui1， LIU Xiaoxiao1，LIU Zhaohan1， ZHANG Lisheng1，2*

（1. State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests， Key Laboratory of Natural Enemy Insects， Ministry

of Agriculture and Rural Affairs， Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193，

China; 2. Shanghai Veterinary Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Shanghai 200241， China;

3. College of Horticulture and Gardening， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300392， China）

Abstract

Coccinella septempunctata is widely used predatory natural enemy insect in biological pest control. It survive the winter as a diapause adult， during which females accumulate substantial abdominal lipids， significantly prolonging survival. Lipid accumulation is a feature of insect diapause， supplying energy and nutrients for basic metabolism during the diapause period and postdiapause recovery， thereby enhancing survival under unfavorable conditions. Previous studies revealed that triacylglycerol （TAG） is the main lipid form in diapause females of C.septempunctata， with significantly increased TAG levels. DiacylglycerolOacyltransferase （DGAT）， the terminal and ratelimiting enzyme in TAG synthesis， remains poorly studied in insects. In this study， we identified a gene encoding DGAT1 （CsDGAT1） based on the genome of C.septempunctata. The fulllength ORF of CsDGAT1 was cloned and analyzed via bioinformatics. RTqPCR was used to examine its expression profile in diapauseinduced and nondiapause females， and RNAi was employed to knock down CsDGAT1 expression and assess the effect on TAG content. Phylogenetic analysis showed that CsDGAT1 is closely related to DGAT1 from Harmonia axyridis and contains eight conserved histidine residues. Under nondiapause conditions， CsDGAT1 was highly expressed in the fat body and ovary; under diapauseinduced conditions， it was primarily expressed in the fat body and midgut. CsDGAT1 expression was significantly upregulated in fat body and midgut of diapauseinduced females compared to nondiapause females. RNAimediated silencing of CsDGAT1 significantly reduced TAG levels and fat accumulation. These results demonstrate that the CsDGAT1 plays an important role in lipid accumulation in diapausing females， providing a molecular basis for understanding diapauserelated lipid metabolism and a theoretical foundation for developing diapauseinduction technologies for natural enemy insects in biological control.

Key words

Coccinella septempunctata; diacylglycerolOacyltransferase 1; lipid accumulation; diapause; gene expression; RNA interference

七星瓢蟲Coccinella septempunctata捕食范圍廣，捕食能力強，產卵量大，定殖性強，是一種典型的優良捕食性天敵昆蟲，被廣泛應用于害蟲生物防治領域［14］。自然條件下，七星瓢蟲以滯育態成蟲越冬。滯育態七星瓢蟲腹部脂質大量積累，存活時間最長可達120 d［5］。通過誘導天敵昆蟲滯育并長期貯藏，可大幅延長產品貨架期，將有利于提高天敵昆蟲的規模化繁育和田間應用水平，從而促進其在生物防治中的應用［67］。脂質積累是昆蟲進入滯育狀態的主要生理特征之一，這一生理變化為昆蟲種群在滯育期和滯育解除后的基本代謝活動提供營養和能量，以應對能量物質匱乏的不利環境，從而確保其在惡劣環境中的生存［8］。這一現象在滯育的七星瓢蟲［910］、庫蚊Culex pipiens［1112］、大猿葉甲Colaphellus bowringi［1314］ 和沙蔥螢葉甲Galeruca daurica［15］的研究中均有發現。昆蟲的脂肪體在能量儲存和利用中起著至關重要的作用。昆蟲的能量儲存方式主要是以糖原和三酰甘油（triacylglycerol，TAG）的形式儲存在脂肪細胞（主要的脂肪體細胞）中［16］。滯育階段的七星瓢蟲生殖系統發育會受到抑制，雌性成蟲卵巢發育停滯，卵小管內無卵黃，且整個腹部堆積了大量脂肪，脂含量和總糖含量顯著增加［1719］。進一步研究表明，在滯育期間，脂肪酸合成中一系列相關酶，脂肪酸合酶（fatty acid synthase， FAS）、酰基CoAΔ11去飽和酶［acylCoA delta（11） desaturase，FADΔ11］、乙酰輔酶A羧化酶（acetylCoA carboxylase， ACC）、長鏈脂肪酸輔酶Ａ連接酶（long chain fatty acidCoA ligase， ACSL）、超長鏈脂肪酸延伸酶（elongase of very long chain fatty acids， ELO）和3酮酯酰輔酶Ａ還原酶（verylongchain 3ketoacylCoA reductase， KAR）基因的顯著高表達是導致滯育雌蟲脂肪積累的重要原因［2021］。此外，滯育態七星瓢蟲腹部積累的脂質主要是三酰甘油，滯育態雌蟲體內三酰甘油含量顯著升高［10， 19， 22］。滯育雌蟲體內脂肪的積累不僅可確保種群能夠順利進入滯育，也為滯育種群滯育解除后的發育提供營養與能量。

TAG有2種合成方式［23］：1）磷脂酸在磷脂酸磷酸酶作用下，水解釋放出磷酸轉變為二酰甘油（diacylglycerol，DAG），在二酰甘油酰基轉移酶1（diacylglycerolOacyltransferase 1，DGAT 1）的作用下酯化促進TAG生成;2）脂酰輔酶A在單酰基甘油酯酰轉移酶作用下酯化促進3磷酸甘油生成DAG，DAG與脂酰輔酶A在二酰甘油酰基轉移酶2（DGAT 2）作用下酯化促進TAG生成。無論哪種方式，DGAT都是TAG合成最后一步的催化酶與限速酶［24］。DGAT1屬于酰基輔酶A膽固醇酰基轉移酶家族，是一種完整的膜蛋白，可作用于DAG和脂肪酰基CoA1促進TAG合成。DGAT1是生物體脂肪吸收和脂肪存儲所必需的;DGAT2屬于單酰基甘油酯酰轉移酶家族，在哺乳動物脂肪合成過程中催化DAG與脂酰輔酶A（acyl CoA）縮合形成TAG［25］。研究發現二者催化相同的酶促反應，并且在脂肪組織、腸道和肝臟中均有表達［2627］。

本研究克隆七星瓢蟲二酰甘油酰基轉移酶1（DGAT 1）基因的開放閱讀框（ORF），進行進化樹和多序列比對分析;利用RTqPCR分析CsDGAT1在滯育誘導雌蟲和非滯育誘導雌蟲中的表達特征。運用RNAi技術對CsDGAT1進行干擾，并對干擾后雌蟲體內TAG含量進行測量。旨在為深入探究滯育七星瓢蟲的脂肪積累機制奠定基礎，為七星瓢蟲滯育調控技術開發提供理論支撐，促進天敵產品在綠色生物防治產業中的發展。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

供試蟲源為中國農業科學院植物保護研究所天敵昆蟲組的七星瓢蟲室內種群。在溫度（24±1）℃和相對濕度70%，光周期L∥D=16 h∥8 h條件下，以新鮮的豆蚜Aphis glycines飼養。參考王偉等的方法［18］，七星瓢蟲正常發育飼養條件（非滯育條件）為（24±1）℃、（70±10）% RH、光周期L∥D=16 h∥8 h;其滯育誘導條件為（18±1）℃、（70±10）% RH、光周期L∥D=10 h∥14 h。

1.2 非滯育與滯育誘導條件下飼養的雌蟲組織樣品收集

將新羽化的雌蟲放入正常發育/非滯育條件下，飼養5 d （N5）、10 d （N10）、15 d （N15）和20 d （N20）的雌蟲作為正常發育組。將新羽化的雌蟲放入滯育誘導條件下飼養，滯育誘導5 d （D5）、10 d （D10）、15 d （D15）和20 d （D20）的雌成蟲作為滯育組。在室溫條件下，快速地用昆蟲針分別將滯育態雌蟲（D5，D10，D15和D20）和非滯育態雌蟲（N5，N10，N15和N20）個體固定在石蠟盤上。用手術剪和解剖鑷解剖，收集頭、胸、脂肪體、卵巢和中腸5個部位。收集的組織樣品放入液氮速凍后放入-80℃冰箱中保存備用。

1.3 CsDGAT1基因的克隆與序列分析

1.3.1 總RNA提取及cDNA合成

將試蟲組織置于液氮預冷，向電動研磨杵研磨后的樣品中加入TRizol UP試劑（北京全式金生物科技公司），根據使用說明提取總RNA。在微量分光光度計（NanoPhotometer Pclass，Implen）上檢測RNA濃度，并用12% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性。按照TransScriptOneStep gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反轉錄試劑盒（北京全式金有限技術公司）操作說明合成cDNA模板，置于-20℃保存。

1.3.2 引物設計與PCR擴增

基于七星瓢蟲基因組信息（http：∥v2.insectgenome.com/Organism/194），篩選到了一個注釋為CsDGAT1的序列，利用 Primer 60設計基因克隆引物及熒光定量引物（表1）。所有引物均由北京擎科新業生物技術公司合成。以滯育七星瓢蟲cDNA為模板，利用CsDGAT1F和CsDGAT1R擴增CsDGAT1的ORF序列。反應體系（50 μL）：PCR Mix 25 μL，上、下游引物各25 μL，cDNA 1 μL，超純水 19 μL。反應程序：98℃變性2 min;98℃ 10 s，55℃ 15 s，72℃ 15 s，30個循環;72℃ 5 min。PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收純化目的條帶并連接至克隆載體pEASYBlunt Simple （北京全式金生物技術有限公司），轉化至大腸桿菌感受態細胞，氨芐青霉素篩選后挑選陽性克隆進行擴大培養送至北京擎科生物公司測序。

1.3.3 CsDGAT1基因序列分析

序列結果利用DNAMAN 90進行分析并完成序列拼接。利用NCBI上的ORF Finder （https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）查找基因開放閱讀框、利用ExPASy （http：∥web.expasy.org/translate/）軟件翻譯預測氨基酸序列、利用NCBI在線軟件CDD （http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）分析氨基酸序列的保守結構域。所得氨基酸序列通過NCBI的Blast程序（http：∥blast.Ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）與GenBank中的nr庫進行同源性搜索，并用ClustalW 2和ESPript 30網站與其他昆蟲同源序列進行多序列比對（表2），采用MEGA 70軟件中的鄰接法（neighborjoiningmethod）構建系統發育樹，各分支重復檢驗次數均為1 000次。

1.4 RNAi介導的CsDGAT1基因沉默

以七星瓢蟲CsDGAT1基因ORF序列為模板，設計引物合成雙鏈RNA（dsRNA）用于CsDGAT1基因的沉默。在設計好的引物5′端添加T7啟動子序列TAATACGACTCACTATAGGG（表1），以綠色熒光蛋白（GFP）序列為模板合成雙鏈RNA（dsGFP），并以此作為RNA干擾的對照組。選取初羽化48 h內的大小一致的七星瓢蟲雌蟲，使用顯微注射儀Nanoject Ⅲ （德拉蒙德科學公司），將dsRNA注射進試蟲體內。注射部位為七星瓢蟲第2、3腹節間膜，注射體積為1 μL（約2 μg/μL）。共設置3組RNA干擾試驗：1）RNA干擾對CsDGAT1基因表達的影響。于注射后2 d采集七星瓢蟲，采用RTqPCR分析CsDGAT1基因表達量的變化（引物參見表1），每個處理設置7個生物學重復，每個重復2頭成蟲。2）RNA干擾CsDGAT1基因對三酰甘油（TAG）含量的影響。為增強RNA干擾的持續效果，在注射的第7天增加了一次加強針，即再注射同等體積和濃度的dsRNA。取dsRNA注射14 d的試蟲（從第一次注射開始），用無菌水沖洗并用濾紙擦干凈。稱重后放入15 mL離心管中，采用TAG檢測試劑盒（單試劑GPOPAP法，南京建成生物工程研究所，A11011）檢測樣品的三酰甘油含量。6次生物學重復，每個生物學重復2～3頭雌蟲。3）RNA干擾CsDGAT1基因對雌蟲腹部脂肪積累的影響。為增強RNA干擾的持續效果，在注射第7天增加一次加強針。取dsRNA注射14 d的試蟲，用解剖鑷和手術刀剪掉其內外翅和六足后，將其固定在石蠟盤上。在顯微鏡下將試蟲背部表皮輕輕撕下，用超景深顯微鏡（Leica VHX2000，基恩士）對其腹部脂肪積累情況進行拍照。

1.5 相關基因的實時熒光定量檢測

RTqPCR試驗用于檢測CsDGAT1基因在不同時期各組織中的表達量以及其干擾效率。采用TOROGreen5G qPCR Premix （上海百靈克生物科技有限公司），反應體系（20 μL）： TOROGreen5G qPCR Premix 10 μL，上、下游引物各08 μL，cDNA 1 μL，超純水74 μL。反應程序：95℃ 5 min;98℃ 10 s，56℃ 20 s，40個循環。所有試驗都設置3個生物學重復，3個技術重復。基因的相對表達量計算采用2-ΔΔCT法［28］，內參為CsActin基因（引物序列見表1）。

1.6 數據統計與分析

數據采用SPSS 23.0軟件進行分析。滯育誘導和非滯育條件下的雌蟲的各組織樣品（頭，胸，中腸，脂肪體和卵巢）中CsDGAT1的相對表達量，同一處理條件下不同時間點之間的樣本中CsDGAT1的相對表達量采用單因素方差分析（Oneway ANOVA）及Tukey多重比較進行分析；同一時間點下，不同處理條件之間的樣本中的CsDGAT1的相對表達量，RNA干擾試驗結果中，處理組和對照組下雌蟲體內基因的相對表達量和甘油三酯含量采用Student’s ttest檢驗進行比較。利用Graph Pad Prism 9軟件繪圖。文中所用數據均為平均值±標準誤。

2 結果與分析

2.1 七星瓢蟲二酰甘油酰基轉移酶1基因（CsDGAT1）克隆與序列分析

基于NCBI數據庫，篩選出一個注釋為七星瓢蟲二酰甘油酰基轉移酶1基因（CsDGAT1）的序列信息。通過RTPCR獲得了CsDGAT1基因的完整開放閱讀框（ORF），其長度為1 470 bp，編碼489個氨基酸。系統進化樹分析表明，七星瓢蟲CsDGAT1蛋白與鞘翅目異色瓢蟲Harmonia axyridis的二酰甘油酰基轉移酶1蛋白親緣關系較近并聚為一支（圖1）。根據七星瓢蟲CsDGAT1氨基酸序列信息，多重序列比對結果發現，其第34位至第469位氨基酸為保守的膜結合O酰基轉移酶家族（membrane bound Oacyl transferase family，MBOAT family），并且含有8個保守的活性組氨酸（His，H）位點殘基（圖2）。

2.2 不同組織部位中CsDGAT1基因表達量

在雌蟲各組織（頭、胸、脂肪體、卵巢和中腸）中均可以檢測到CsDGAT1基因的表達。其中在非滯育條件下（N5），CsDGAT1基因在雌蟲脂肪體和卵巢中表達水平較高，在中腸和胸的表達水平相對較低，在頭部的表達水平最低（圖3a）。在滯育誘導條件下（D5），CsDGAT1基因在雌蟲脂肪體和中腸中表達量較高（圖3b）。

2.3 CsDGAT1基因的時間表達譜

RTqPCR的分析結果發現：在雌蟲脂肪體和中腸組織中，與非滯育組第5天相比，滯育誘導第5天時CsDGAT1基因表達量均顯著增加（圖4a，b）。在脂肪體以及中腸組織中，CsDGAT1基因在滯育誘導第5天和非滯育條件第20天時表達量較高（圖4a，b）。在卵巢組織中，滯育條件和非滯育條件下的各時間點，CsDGAT1基因表達量均無顯著性差異（圖4c）。

2.4 RNA干擾CsDAGT1基因后七星瓢蟲腹部脂肪積累情況

為了明確干擾CsDAGT1基因對七星瓢蟲腹部脂肪積累的影響，開展了干擾后的雌成蟲腹部解剖試驗。結果表明，CsDAGT1基因的干擾效率可達9810%（圖5b），且干擾后滯育誘導條件下雌成蟲腹部無明顯脂肪積累現象（圖5a）。與對照組相比，注射dsDAGT第14天時的七星瓢蟲體內TAG含量顯著降低（圖5c）。

3 結論與討論

掌握天敵昆蟲滯育調控技術手段，對大幅延長產品貨架期，提高天敵昆蟲的規模化繁育和田間應用水平，促進天敵昆蟲在生物防治中的作用具有重要意義。然而，對昆蟲滯育分子調控的了解仍處于起步階段［29］。七星瓢蟲是一種典型的優良捕食性天敵昆蟲，被廣泛應用于害蟲生物防治領域。多年來本團隊一直致力于對其生殖滯育機理和滯育調控應用的研究。前期的研究結果表明，低溫短光照條件下（18℃，L∥D=14 h∥10 h）可誘導七星瓢蟲進入滯育，滯育階段的七星瓢蟲生殖系統發育會受到抑制，雌性成蟲卵巢發育停滯，內無卵黃，且整個腹部充滿了大量脂肪，并以三酰甘油（TAG）的形式儲存大量能量［5， 10， 19， 22］。

DGAT1和DGAT2在哺乳動物TAG合成中起著重要作用。然而，昆蟲TAG代謝的分子機制尚不清楚。本試驗對七星瓢蟲DGAT1基因功能進行了初步研究。通過同源性分析，我們發現包括七星瓢蟲在內的大多數昆蟲都有DGAT1基因，較少數昆蟲含有DGAT2基因。本研究克隆了七星瓢蟲二酰甘油酰基轉移酶1（CsDGAT1）基因ORF序列，其長度為1 470 bp，編碼489個氨基酸;與鞘翅目異色瓢蟲的二酰甘油酰基轉移酶1蛋白親緣關系最近，CsDGAT1的第34位至第469位氨基酸為保守的膜結合O酰基轉移酶家族（MBOAT）。MBOAT家族是一類廣泛存在于各種生物體內的多次跨膜整合酶。該家族催化的O酰基轉移反應在細菌細胞壁生成，在真核生物脂代謝以及分泌蛋白介導的信號轉導等許多生物學過程中起著至關重要的作用［30］。

昆蟲體內TAG主要儲存在脂肪體細胞中的脂滴中［31］。大多數昆蟲脂肪體細胞不僅產生大量的DAG，而且它們還可以通過載脂蛋白將DAG輸出到血淋巴循環中，參與能量的貯存和供應。昆蟲中腸也會產生大量的DAG，這些DAG由脂蛋白分泌并運輸到脂肪體。大多數的研究表明，DGAT1在已知儲存TAG的3個主要器官中表達，即卵巢［32］、中腸［33］ 和脂肪體［16］。在本研究中，七星瓢蟲CsDGAT基因主要在脂肪體，中腸和卵巢中顯著高表達。這一研究結果和煙草天蛾Manduca sexta DGAT的研究結果［34］ 相似。本研究中，CsDGAT1基因的表達是根據昆蟲的生理需求進行調節的，與非滯育條件相比，滯育誘導第5天雌蟲脂肪體和中腸中CsDGAT1基因表達量顯著增加。這一點與雌蟲在滯育條件下以TAG的形式積累大量脂質密切相關。

利用RNAi技術對CsDGAT1基因進行干擾，干擾效率可以達9810%，干擾效果好。通常情況下，鱗翅目昆蟲的RNA干擾效率較低，但鞘翅目昆蟲的RNA干擾效率較高，一般可以達到95%以上［3536］。七星瓢蟲屬于鞘翅目昆蟲，該物種的RNAi干擾效率較高，為后續功能研究帶來了極大的便利。為確保持續RNA干擾效果，我們還在第一次注射7 d后增加了一次加強針。為了證實CsDGAT1基因在滯育雌蟲脂肪積累中的重要作用，對干擾后七星瓢蟲雌成蟲進行解剖觀察和體內三酰甘油（TAG）含量測量。結果發現干擾后滯育雌成蟲體內無明顯脂肪積累現象（圖5a）。與對照組相比，注射dsDAGT第7天時的七星瓢蟲體內TAG含量顯著降低（圖5）。以上研究結果表明，CsDGAT1基因有助于促進滯育態七星瓢蟲雌蟲脂肪的積累。

本研究結果表明，七星瓢蟲在滯育期間CsDGAT1基因表達增加而造成TAG的大量積累是其脂肪積累的重要原因。此外，我們前期的研究發現保幼激素（JH）和類胰島素信號通路均是引發七星瓢蟲發生生殖滯育的關鍵因素［9，22，37］。在后續研究中，將繼續開展JH信號和類胰島素信號對七星瓢蟲CsDGAT1基因功能影響的研究，探究JH信號和類胰島素信號對滯育七星瓢蟲雌蟲的脂肪積累的作用，解析七星瓢蟲滯育時期脂質積累的機制。

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