新疆牛源奇異變形桿菌分離鑒定及耐藥與毒力基因分析

圖分類號：Q78，S859 文獻標志碼：A 文章編號：1008-0864（2025）07-0142-0：

Isolation and Characterization of Bovine-origin Proteus mirabilis from Xinjiang and Analysis of Drug Resistanceand Virulence Genes

HEWei ^1，2 ， SONG Linqing1，2，WU Xinglin1，AI Junjie12，JI Liwei3，WANG Limin ^1，2 WANG Yanbin ^1，2 ，PENG Bin12，DAI Xiaohua ^1，2* ， GUO Qingyong1，2*

（1.ColegeofVeterinary Medicine，XinjiangAgriculturalUniversity，Urumqi830o52，China;2.KeyLaboratoryofNewDrug

ResearchandDevelopmentforherbivoresofXinjiang，Xinjiang Agriculture University，Urumqi83oo52，China;3.Shandong Animal Husbandry and Veterinary Medicine College，Shandong Weifang 261O61，China）

Abstract：Inordertostudythepathogenicbacteriaand theircharacteristicsofendometritis inadairyfarminChangji regionof Xinjiang，conventionaland PCR methods were used to isolateand identifyProteus mirabilis inthecollected secretion samples，and K-B drug-sensitive paper slides，PCR methods and artificially infected mice were used to detect thedrug resistance，virulence genes and pathogenicityof Proteus mirabilis，respectively.The results showed that 29 strainsof Proteus mirabilis were isolated.Thedrug susceptibility testof16 drugscommonly showed that 29 strains weresensitive to9drugs，resistant to5drugs，and moderately sensitive to2 drugs.The detection rateof virulence genes，ureC，atfC，rsmA，atfA，hpmAand rsbA ，ranged from 62.07% to 89.66% ，and the detection rate of other virulence genes was from 13.79% to 41.38% .Theanimal pathogenicity test showed that the isolated strain had pathogenicity to mice.Above results provided a scientific basis for the clinical control of the disease.

Keywords：endometritis；Proteusmirabilis；drug resistance；pathogenicity

奇異變形桿菌為腸桿菌科變形桿菌屬，無莢膜和芽孢但有鞭毛和菌毛，屬革蘭氏陰性桿菌，廣泛分布于自然界及人和動物的黏膜和消化道中2。近年來，關于人類和多種動物感染奇異變形桿菌的報道逐漸增多，該菌可感染豬、牛、羊等常見養殖動物，也有文獻報道在野生動物眼鏡蛇、華南虎和大熊貓中也有感染發生，能夠引起食物中毒、尿路感染、腹瀉、肺炎、敗血癥等多種疾病[4]。

奇異變形桿菌的毒力因子可促進細菌對細胞的黏附作用及耐藥性的產生5，目前，關于其潛在毒力因子的報道主要集中在菌毛、“霧蔓”遷徙能力、尿素酶、金屬蛋白酶及溶血素等，這些毒力因子在該菌引起疾病的過程中起重要作用，該菌的致病性與其所攜帶的毒力因子密切相關。由于臨床上濫用抗生素，導致奇異變形桿菌產生了越來越多的耐藥菌株，這些菌株的耐藥性不斷增強，給治療帶來了挑戰。本研究旨在分離鑒定新疆昌吉某規?；B殖場患有子宮內膜炎分泌物中的奇異變形桿菌，并對其進行藥物敏感性試驗及毒力基因檢測，以期為該養殖場牛源性奇異變形桿菌的防治提供基礎數據。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1樣品來源于2023年7月在新疆昌吉地區某規?；B殖場挑選患有子宮內膜炎的病牛，無菌采集其子宮分泌物樣品81份。

1.1.2試劑腦心浸出液肉湯（brain heartinfusionbroth，BHI）、SS瓊脂、胰蛋白陳大豆瓊脂、MH瓊脂購自青島海博生物技術有限公司；革蘭氏染液、DNA提取試劑盒 ，2×Es Taq MasterMix購自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3儀器設備恒溫培養振蕩器（ZWY-200D）購自上海智誠分析儀器制造有限公司；恒溫培養箱（DHP-9052）購自上海齊欣科學儀器有限公司；PCR儀（A200）購自杭州朗基科學儀器有限公司；電泳儀（DYY-6C）購自北京六一生物科技有限公司。

1.1.4試驗動物選取體重 18～22g 雌雄各半共32只昆明小鼠，購自新疆醫科大學。

1.2試驗方法

1.2.1采樣方法采樣時，先掏空奶牛宿便，將肛門和外陰周圍用新潔爾滅反復清洗消毒。將套有無菌管套的輸精槍從陰門伸入陰道，然后抽出，用一次性注射器對準管套將子宮分泌物采出。采集的子宮分泌物立即注入 5mL 無菌管中并置于

-20^°C 保存。

1.2.2細菌分離培養在超凈工作臺中，將采集的子宮分泌物樣品接種于SS瓊脂中， 37^°C 恒溫培養 12h 后觀察，選取具有奇異變形桿菌典型生長特征的菌落進行傳代純培養。

1.2.316SrRNA擴增使用16SrRNA通用引物（表1）進行PCR擴增。將純化后的PCR產物送至上海生工生物工程股份有限公司進行測序，將得到的序列與NCBI數據庫中的序列進行比對，確定細菌種屬。

1.2.4藥敏試驗采用Kirby-Bauer（K-B）紙片擴散法8測定分離菌株對16種抗菌藥物的敏感性，測試所用抗菌藥物敏感性判斷參照美國臨床和實驗室標準化研究所（ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute，CLSI）的標準進行。

1.2.5毒力基因檢測根據奇異變形桿菌 rsbA 、zapA、rsmA、hpmA、fliL、pmfA、atfC等毒力基因序列[36，設計11對引物（表1），均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2.6人工感染致病性試驗 ① 感染菌液的制備根據毒力基因結果，挑取含有毒力基因最多的奇異變形桿菌在SS瓊脂平板上生長培養 12h 后，取瓊脂平板上的單菌落接種于 5mL BHI肉湯中繼續傳代2次，收集培養物，用無菌生理鹽水根據生長曲線的 0D_600nm 調至 10⁷CFU?mL^-1 ，同時采用平板表面涂布法進行活菌計數，計算實際感染菌量。

② 動物分組及細菌接種根據毒力基因檢測結果選出含有毒力基因最多的菌株，命名為PM-21。將小鼠隨機分成4組，每組8只，其中3組經皮下分別接種 10⁸，10⁷，10⁶CFU?mL^-1 的菌液0.2mL ，另外1組經腹腔注射 0.2mL 無菌生理鹽水作為空白對照（CK）。將細菌感染組與對照組飼喂相同的飼料和飲水，并隔離飼養，7d后觀察小鼠的狀況并記錄死亡結果，采用SPSS計算半數致死量（medianlethal dose，LD50）]。

1.2.7病理切片制作將32只奇異變形桿菌菌株攻毒小鼠進行解剖，觀察病理變化情況，并選出具有代表性致死小鼠和對照小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟組織經 4% 多聚甲醛固定后，制作HE（hematoxylin-eosin）病理切片，并進行觀察。

2 結果與分析

2.1 奇異變形桿菌分離鑒定

對從患子宮內膜炎的病牛體內分離到的病原菌進行16SrRNA測序，將結果在NCBI數據庫進行Blast比對，共計分離得到奇異變形桿菌29株，分離率為35.80% 。進一步對分離的奇異變形桿菌菌株在SS培養基進行培養發現，表面呈無色半透明有黑色中心，邊緣整齊，表面光滑的圓形菌落（圖1A）；經革蘭氏染色，油鏡下可見分離菌株為革蘭氏陰性菌（圖1B）。

A：菌落形態；B：革蘭氏染色 A：Colony morphology;B：Gram staining

2.2藥敏試驗結果

對29株奇異變形桿菌菌株進行藥物敏感性分析，結果（圖2）表明，奇異變形桿菌菌株對藥物的敏感程度表現為氨芐西林（ 100.00% ）gt;環丙沙星（ 96.55% ） gt; 氟苯尼考 （93.1%）gt; 慶大霉素、阿莫西林（ 89.66% ） gt; 復方新諾明（ 86.21% ）gt;頭孢噻肟 （79.31%）gt; 鏈霉素（ 75.86% ）gt;青霉素0 65.52% ）；對林可霉素高度耐藥，耐藥率為100% ；對四環素、多粘菌素B、萬古霉素、紅霉素表現為耐藥，耐藥程度表現為萬古霉素1 （96.55%）gt; 四環素、紅霉素（ 93.10% ）gt;多粘菌素B（89.66% ）。

2.3 毒力基因檢測結果

由圖3和4可知，在29株奇異變形桿菌中，有26株檢出rsbA、hpmA、atfA基因； rsmA?atfC?ureC 基因檢出數分別為21、19、18株;zapA、fliL基因檢出數分別為12、9株，有4株檢出pmfA基因；且29株均未檢測到 ucaA，mrpA 基因。

2.4小鼠致病性試驗結果

在 24h 內，接種 0.2mL 1×10⁸ CFU·mL^-1 奇異變形桿菌PM-21重懸液的小鼠死亡率為 100% ；接種 0.2mL 1×10⁷ CFU·mL^-1 奇異變形桿菌PM-21重懸液的小鼠死亡率為 80% ；接種 0.2mL1× 10⁶CFU?mL^-1 奇異變形桿菌PM-21重懸液的小鼠死亡率為 40% ;對照組小鼠均正常存活（圖5）。由表2得出，奇異變形桿菌PM-21菌株對小鼠的半數致死量 （LD₅₀ 為 2.03×10⁶CFU?mL^-1

2.5攻毒死亡小鼠病理組織學觀察

接種奇異變形桿菌PM-21后小鼠的組織學變化如圖6所示。試驗組小鼠感染PM-21后，其肝臟和脾臟存在損傷，而肺臟、心臟等損傷不明顯。具體表現為心臟可見少量心肌細胞水樣變性（圖7F，紅色箭頭），細胞腫大，胞質疏松，胞漿染色不均；少量心肌細胞內可見微小空泡（圖7F，黑色箭頭）。肝臟組織有較多中央靜脈與門靜脈淤血（圖7G，綠色箭頭）；可見少量肝竇淤血、輕度擴張（圖7G，黑色箭頭）。脾臟多見白髓和紅髓出血（圖7H，綠色箭頭），白髓內可見少量紅細胞，并且可見少量點狀壞死（圖7H，黑色箭頭）。肺臟少量細支氣管管腔內可見嗜酸性物質滲出，同時伴有少量上皮細胞壞死脫落（圖7I，紅色箭頭），多見肺泡壁毛細血管輕度淤血（圖7I，綠色箭頭），小范圍肺泡狹窄（圖7I，黑色箭頭）。腎臟組織中大量腎小管上皮細胞水樣變性（圖刀J，黑色箭頭），細胞腫脹，胞質疏松、淡染；泌尿小管之間結締組織為腎間質，可見較多間質血管淤血（圖7J，綠色箭頭）。

3討論

引起子宮內膜炎的細菌錯綜復雜，呈現多樣化趨勢，其種類有地域性差異0]。選擇合理有效的抗菌藥物是防治細菌感染的重要手段]，本研究分離的29株奇異變形桿菌對β內酰胺類、喹諾酮類、酰胺醇類、氨基糖苷類、磺胺類抑菌效果明顯；但對林可霉素耐和紅霉素耐藥，這可能與該牛場頻繁使用這2種藥物有關。林可霉素通過抑制細菌蛋白質合成起到抗菌作用，它只對多數革蘭氏陽性菌有效，而所有的革蘭氏陰性菌均對其表現為耐藥[12]。紅霉素是主要抑菌性藥物，易在畜禽體內造成抗生素殘留，后續如用于治療臨床奶牛子宮內膜炎可能無法產生良好療效，建議臨床上使用抑菌效果明顯的藥物進行奶牛子宮內膜炎的防治。

奇異變形桿菌具有較強的致病性，與其攜帶的毒力基因相關[13]。本研究擴增了rsbA、zapA、rsmA、hpmA、fliA、pmfA、atfC、ureC、ucaA、atfA和mrpA基因。rsbA作為“霧蔓”菌毛遷移能力的調控基因，能夠控制細菌在宿主體內的移動能力[4]。zapA是金屬蛋白酶的主要結構亞單位，可降解宿主細胞產生的相關免疫分子，使病原菌能夠逃避感染過程中的天然免疫反應[5]。rsmA、ureC、atfA和 mrpA 參與細菌黏附聚集以及參與細菌生物膜的形成[16-19]。ucaA主要參與尿路上皮細胞的黏附[20]。胡延波等調查發現，3株豬源奇異變形桿菌攜帶7種毒力基因；張建鵬等5分離的驢源奇異變形桿菌攜帶9種毒力基因；王濤等2對雞源奇異變形桿菌進行毒力基因檢測，結果檢出8種毒力基因；張召興等[22]從分離的貂源奇異變形桿菌中檢出9種毒力基因。本研究分離的牛源奇異變形桿菌攜帶毒力基因情況與前人研究相似[23-24]，主要攜帶 rsbA 、atfA、atfC、ureC、zapA、rsmA、hpmA、fliL。董貴等[25]在羔羊腹瀉糞便中分離到奇異變形桿菌，將其接種小鼠后， ^12h 內小鼠已有死亡。劉妍罕等2從野豬肝臟組織樣本中分離出奇異變形桿菌，小鼠感染該菌后 12～24h 全部死亡。王旭榮等2在犢牛關節膿液中分離到奇異變形桿菌，將該菌接種小鼠后發現， 20～24h 內接種小白鼠均死亡。本研究表明，不同劑量的奇異變形桿菌均可導致小鼠陸續死亡，說明不同來源的奇異變形桿菌均具有較強的致病性。

綜上所述，本研究從新疆昌吉某奶牛養殖場中分離鑒定了29株奇異變形桿菌，它們對林可霉素、四環素、多粘菌素B、萬古霉素、紅霉素耐藥，對氨芐西林、環丙沙星、氟苯尼考、慶大霉素、阿莫西林和復方新諾明敏感；攜帶9種毒力基因，對小鼠有強致病性。

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