湖南省玉竹葉斑病病原菌的分離鑒定

引用格式：，等.省玉竹葉斑病病原菌的分離鑒定[J].農業科學，2025（6）：72-74，84.DOI：10.16498/j.cnki.hnnykx.2025.006.012

中圖分類號：S567 文獻標識碼：A 文章編號：1006-060X（2025）06-0072-03

Identification of the Pathogen Causing Leaf Spot in Polygonatum odoratum in Hunan Provi

XU Wen-jing1，YUAN Ye2，HUANG Yan-ning2，CAI Liu2，XU Rui2，LU Ying （1.HunanAgriculturalUniversityangsha428，PRC;2.HunanIstituteofNuclearAgricultureSciencesdne HerbalMedicines，Changsha，PRC）

Abstract：Thisstudyaims toidentifythepathogencausingeafspotinPolygonatumodoratuminHunanProvince.Thepathogen was isolated from the diseased leaves of P. odoratum by the tissue culture method，and its pathogenicity was verified according to Koch's postulates.Theisolatewasidentifedbymorphologicalobservationofcolonies，onidia，andhyphaeandmolecularbologicalethods. Theresultsshowedthattheobtained strainYZyhadthemorphologicalcharacteristicsconsistentwiththoseofFusariumequiseti. Specifically，thestrainpresentedcoloniescreamyhiteonthefrontandlightyellowatthback，focculentaerialhyphaepindleshapedorsickle-shapedmacroconidia，fewmicroconidia，andspherechlamydosporeswithroughsurfaces.Thesymptomscaused by thestrainnlaboratorywereconsistentwiththoseinthefeld.TemultilocusphylogeneticanalysisbasedoIS，EF-aadRPB1 showed that the strain shared the same clade （ 87% homology） with F. equiseti. Therefore， the pathogen causing leaf spot in P. odoratum is F. equiseti，which provides reference for the effective control of this disease.

Key words： Polygonatum odoratum; leaf spot; isolation and identification; Fusarium equiseti

玉竹（Polygonatumodoratum）是一種藥食兩用植物[1-2]，為天門冬科黃精屬，又名葳蕤、鈴鐺菜、地管子和甜草根等[3]。玉竹以地下根莖入藥，新鮮肉質呈黃白色，須狀根細長密集，廣泛分布于我國多個地區[4，也是種植歷史悠久的道地藥材。玉竹味甘、性平，具有生津養胃、益氣養陰和補腎潤肺等功效[5]。近年來，玉竹的應用范圍逐漸延伸至功能性食品、化妝品和保健產品等領域[6-7]

隨著玉竹的藥用價值被廣泛認可，其市場需求持續增長，種植規模不斷擴大。然而，在規?；耘噙^程中，極端氣候、栽培模式單一與管理不當等因素導致病害頻發，其中又以真菌性病害為主，例如褐斑病、根腐病、銹病和灰霉病等[8-9]。2024年，省玉竹種植區發現一種嚴重的葉斑病，發病初期葉片出現圓形或不規則的褐色斑點，后期病斑逐步擴大，直至多個病斑相連致使葉片大面積枯死，造成當地玉竹產量和質量下降，嚴重制約相關產業的可持續發展。本研究以省玉竹產區典型葉斑病病葉為試驗材料，分離純化菌株后，通過形態學觀察、致病性測定以及多位點（ITS、EF-lα和RPB1）系統發育分析，對菌株進行鑒定，以期為玉竹葉斑病防治提供理論依據。

1材料與方法

1.1 試驗材料

供試樣本為2024年采集自省玉竹產區有典型葉斑病癥狀的玉竹葉片；致病性測定的供試植物為健康玉竹盆栽苗；供試培養基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）：馬鈴薯 200g 、葡萄糖 20g 、瓊脂 15～20g 、蒸餾水 O

1.2 試驗方法

1.2.1病原菌的分離純化選取有葉斑病癥狀的玉竹病葉，用無菌蒸餾水沖洗去除葉片表面雜菌，于病健交界處剪取葉片組織（ 3mm×3mm ），經 75% 無水乙醇浸泡30s后，用無菌水充分漂洗3次并用滅菌濾紙吸干殘留水分。將消毒后的葉片組織接種在冷卻凝固的PDA平板上，置于 28°C 恒溫培養箱中培養3＼～5d，待平板上長出菌落后，用無菌牙簽挑取菌落邊沿菌絲，接種于新的PDA培養基上，重復處理直至平板上形成單一菌落，將純化后的菌落接種至斜面培養基， 28°C 恒溫培養直至菌落長滿斜面，置于 4^°C 冷藏保存。

1.2.2形態學觀察將分離純化的菌株接種到PDA培養基上，在 28°C 的恒溫培養箱中培養5＼～7d，待菌落長滿整個平板后觀察菌落顏色、菌絲生長狀況等特征，同時挑取少量菌絲置于顯微鏡下觀察孢子和菌絲形態并測量分生孢子大小

1.2.3致病性測定用健康玉竹盆栽苗來驗證分離菌株的致病性。先用 75% 酒精擦拭玉竹葉片進行表面殺菌處理，用無菌牙簽在玉竹葉片上制作傷口，然后將分離的菌株接種至PDA平板，培養5d后使用直徑 5mm 的打餅器打餅，將大小一致的菌餅接種至玉竹葉片傷口處，以不作處理為對照，重復3次。將6盆盆栽置于相同生長環境下，每天觀察植株并記錄發病情況，發病后再次分離病原菌，比較其與接種菌株的形態特征是否一致。

1.2.4分子生物學鑒定使用真菌基因組DNA提取試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]提取分離菌株的DNA，采用通用引物（表1）ITS1/ITS4、EF1-728F/EF1-986R以及RPB1-Fa/RPB1-R8進行PCR擴增，反應體系（ 25μL ）： 2× Power Taq PCR MasterMix 12.5μL ，上下游引物各 1μL ，DNA模板 1.5μL 無菌水 9μL 。PCR擴增的反應條件： 94^°C 預變性5min ; 94^°C 變性 30s ， 55% 退火 30s ， 72% 延伸 45s 共30個循環； 72^°C 延伸 5min ， 4^°C 保存。將擴增產物交由武漢擎科生物科技有限公司進行測序和序列拼接，將獲得的序列上傳至NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）進行BLAST同源性比對，下載所需序列，使用MEGA7.0軟件采用鄰接法構建系統發育進化樹，Bootstrap重復1000次。

2 結果與分析

2.1 形態學鑒定

將分離得到的菌株命名為YZy，其菌落形態、孢子及菌絲顯微特征如圖1所示。該菌株在PDA平板上形成米白色菌落，氣生菌絲較短，呈棉絮狀，長度不超過培養血蓋高度，菌落背面呈淡黃色。大分生孢子呈紡錘形或鐮刀形，孢子較彎曲，分隔范圍為2＼～6個，其中以3＼～4個為主。小分生孢子數量少，厚垣孢子呈球形且表面粗糙。根據分離菌株YZy的培養性狀和形態學特征，初步確定該菌株為木賊鐮刀菌（Fusariumequiseti）

2.2 致病性測定結果

將分離的菌株YZy接種于玉竹葉片上，如圖2所示，接種7d后，接種處理組的玉竹葉片均出現病癥，病斑呈圓形或橢圓形，病斑外圍呈褐色，后期病斑逐漸擴大，與玉竹產區植株的田間發病癥狀一致，而對照組玉竹葉片未出現感病癥狀。選取發病的玉竹葉片再次進行分離鑒定，得到的菌株與接種菌株一致，表明經柯赫氏法則（Koch'spostulates）驗證，菌株YZy為葉斑病的致病菌。

2.3分子生物學鑒定結果

使用ITS1/ITS4、EF1-728F/EF1-986R以及RPB1-Fa/RPB1-R8序列引物對分離菌株YZy進行PCR擴增并測序，將測序結果上傳至NCBI數據庫進行BLAST比對。從比對結果中選取同源性較高的序列與YZy構建系統發育樹，結果如圖3所示，分離菌株YZy與木賊鐮刀菌（FusariumequisetiMHl1）聚在同一分支，同源性達 87% ，結合形態特征最終確定省玉竹產區葉斑病的病原菌為木賊鐮刀菌。

3 結論與討論

木賊鐮刀菌是一種土傳真菌，通常被報道為植物病原菌，能夠對多種植物造成危害[10-13]，可侵染植物葉、莖、根等多個部位，嚴重時會導致植物死亡，對農作物產量和品質均產生不良影響。木賊鐮刀菌侵染能引發芝麻菜葉斑病[14]、煙草根腐病[15-16]馬鈴薯萎蔫病[17-18]、玉米莖腐病[19]、白菜枯萎病[20]豌豆根腐病[21]、火龍果莖腐病[22]和苦瓜葉斑病[23]等病害；此外，該病原菌具備侵染動物的能力，如趙楠等[24]在患黑鰓病的克氏原螯蝦的鰓上分離得到了木賊鐮刀菌。

目前吉林、貴州、甘肅、等地均有玉竹葉部病害（葉斑病、炭疽病和褐斑病等）病原菌分離鑒定的報道[25-30]。本研究在省玉竹產區發現的葉斑病病原菌經分離鑒定確定為木賊鐮刀菌，這是首次在玉竹產區發現因該病菌引發的玉竹葉斑病。

本研究從省玉竹葉斑病病葉中分離出致病菌株后，經形態學觀察、分子生物學鑒定及多位點系統發育分析，確定該病原菌為木賊鐮刀菌，這是該菌株在玉竹產區引發葉斑病的首次報道。該病害導致玉竹葉片呈大面積褐色病斑，嚴重影響植株生長。研究結果為該病害的防治提供了依據。

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（責任編輯：彭靜瀾）