湖南金絲皇菊花葉病害病原物鑒定

中圖分類號：S682；S432 文獻標識碼：A 文章編號：1006-060X（2025）06-0090-06

引用格式：，等.湖南金絲皇菊花葉病害病原物鑒定[J].湖南農業科學，2025（6）：90-95.DOI：10.16498/j.cnki.hnnykx.2025.006.016

Identification of Pathogens Causing Mosaic Disease of Chrysanthemum morifolium 'Jinsi Huangju' in Hunan Province

HOU Jia-yi ^1，2，3 ，LI Ling'，CHEN Xue-feng1，WU Bo-shun1，XIANG Li-li1，23，YU Xiao-ying ^1，2，3 ， XU Lu12.：

（1.Colegeoficuue，aricalUstsh，;.ndropalQality andUtilizationeinoeahntegh8C;3esnbratorygsha）

Abstract：To identifythe pathogens causingtypical mosaicdiseaseofChrysanthemum morifolium'Jinsi Huangju’inHunan，we colected the leaves withmosaic diseasesymptoms from the Hongcichrysanthemum plantingbase.RT-PCRamplification，enzymelinkedimmunosorbentassay（ELISA），andnegativestaining electronmicroscopywereemployedtoidentifythepathogensithee dimensions ofucleotide sequence，morphology，and protein specificity.RT-PCRamplifcationofthediseased leaves producedtwo targetbands，which wereat thesizessimilartothetarget gene lengthsofchrysanthemum chlorotic motleviroid（CChMVdand chrysanthemum virus B（CVB）.ELISA confirmed the presenceof CVB-specific protein in the diseased leaves.Negative staining of the suspension preparedwiththediseasedleavesrevealedpathogencomponentintwodiferentshapes，whichweresimilarto morphologicalstructureofCChMVdandCVB.Thephylogenetic treeshowcasedthattheisolate（viroid）fromHunansharedthesame clade with four reference isolates （e.g.， CChMVd，FJ647546.1） from Spain， with the sequence similarityof 87% .In addition， the isolate （virus）fromHunansharedthe sameclade withthat fromNanjing （CVB，JQ904595.1），withthe sequencesimilarityof 100% .In conclusion，CChdandCBarethepathogenscausingmosaicdiseaseofC.morifoliumJinsiHuangju'inHunan，andteobied infection of the two viruses leads to the occurrence of this disease.

Key Words：Chrysanthemum morifolium'Jinsi Huangju'; virus identification; CChMVd; CVB; RT-PCR

金絲皇菊（Chrysanthemummorifolium'JinsiHuangju'）為藥食兼用型大花茶菊，不僅富含黃酮類、多糖和氨基酸等多種藥用活性成分，還極具觀賞價值[1-3]。隨著國家鄉村振興戰略的深人實施，金絲皇菊在湖南部分縣域地區已經實現了規模化種植，成為當地農業特色支柱產業。由于金絲皇菊的規模化種植主要依賴無性繁殖，易導致病毒和類病毒積累，引發花葉、褪綠斑、分枝減少、不現蕾和不開花等癥狀，嚴重時整株枯死，造成種質退化和產量下降等問題[4-5]。菊花極易受到病毒和類病毒侵染，目前全球已報道的侵染菊花的病原體超過20種，包括菊花B病毒[ChrysanthemumvirusB（CVB）]、煙草花葉病毒[Tobaccomosaicvirus（TMV）]、番茄花葉病毒[Tomatomosaicvirus（ToMV]、番茄不孕病毒[Tomatoaspermyvirus（TAV）]、菊花褪綠斑駁類病毒[Chrysan-themumchloroticmottleviroid（CChMVd）]、菊花矮化類病毒[Chrysanthemumstuntviroid（CSVd）]等。這些病原體引發的病害在我國多個菊花主產區頻繁發生，嚴重制約著產業的可持續發展[。近年來，湖南部分種植區的金絲皇菊出現了花葉癥狀，導致產區菊花產量和品質降低，而關于其病原物鑒定的研究尚未見報道。因此，采用高效、快速的檢測方法確定湖南金絲皇菊花葉癥狀的病原物種類，對當地菊花病害的精準防控、產量品質提升及抗病種質篩選均具有重要意義[7-9]。當前，植物病毒及類病毒病原鑒定方法主要包括逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）[10-12]、實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）[13]和酶聯免疫吸附法（ELISA）[14]等。其中，qRT-PCR需使用精密熒光定量PCR儀，存在設備成本投人高、RNA提取技術要求高和操作復雜等問題；相比之下，RT-PCR對設備要求低、操作簡單且成本低廉，適用于病原物的快速初篩和常規檢測；ELISA法用于植物病毒檢測具有靈敏度高、應用范圍廣、特異性強、設備自動化程度高和成本較低等優勢，其與分子檢測方法（如RT-PCR/qRTPCR）結合使用時可形成優勢互補[15-16]。

研究以湖南洪慈菊花種植基地內出現花葉癥狀的金絲皇菊植株病葉為試驗樣本，通過RT-PCR擴增測序、負染色電鏡觀察法和酶聯免疫吸附法，從核酸序列、形態結構及蛋白質特異性3個維度明確導致金絲皇菊花葉病害的病原物種類，以期為當地金絲皇菊種植產業的可持續發展提供技術指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

調查顯示，發病植株呈現明顯的病害感染癥狀，具體表現為：老葉呈紫紅色病變，紫紅色由葉片頂端向葉柄蔓延，花后病狀加重，病變范圍覆蓋全株葉片，部分葉片伴隨壞死斑（圖1A、D）；花瓣邊緣同樣呈現紫紅色暈染且花朵畸形（圖1B）；新葉脈間褪綠，腳芽新葉感病癥狀尤為明顯（圖1C、E、F）。供試材料于2020年春季采集自湖南省醴陵市茶山鎮洪慈菊花規模種植基地，選取呈現花葉癥狀的15株金絲皇菊植株，采摘病葉樣本置于無菌無酶 50mL 離心管中，冰上暫存后液氮速凍，于 -80^°C 冰箱中保存。檢測于2020年5月至2021年5月在內完成。

1.2 試驗方法

1.2.1RT-PCR檢測采用RNA提取試劑盒TRIGeneReagent（GenStar）提取病葉樣本總RNA，經cDNA反轉錄試劑盒TransScript？FlyFirst-StrandcDNASynthesisSuperMix（TransGenBiotech）將其反轉錄成cDNA，置于 -20^°C 冰箱保存備用。基于NCBIGenBank中收錄的5種病原體（CVB、CChMVd、TAV、ToMV、TMV）的特異性目的片段，利用PrimerPremier5.0軟件進行引物設計，由生工生物工程（上海）股份有限公司（以下簡稱生工生物）合成5對特異性引物（表1。以cDNA為模板進行擴增后，對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2RT-PCR產物的克隆測序與分析使用PCR產物純化試劑盒B518141-0050（SangonBiotech）純化RT-PCR產物，得到目的DNA片段。利用第二代TOPO克隆試劑盒C601-01（Vazyme）將提純的目的DNA連接到T載體上，重組質粒。將重組后的質粒轉入 DH5a 感受態細胞中，吸取轉化后的菌液均勻涂布于含 100μg/mL 氨芐青霉素的LB固體培養基中進行篩選，于 38^°C 培養 12～18h ，挑取4個飽滿的白色單菌落，接種至預先制備的LB液體培養基（含氨芐青霉素 100μg/mL ）， 38^°C 、 200r/min 振蕩培養 12～18h ，抽取 400μL 菌液送至生工生物測序。1.2.3負染色電鏡觀察法取新鮮金絲皇菊病葉 10g 參照韋石泉等[的方法制備懸浮液，置于 2mL 離心管中， 4^°C 避光封存。參照王學東等[18]的方法直接進行負染色體制樣，將制備的樣本置于電鏡（FEITecnaiG2Spirit）中觀察。

1.2.4酶聯免疫吸附法參照何詠怡等[19的方法調整試驗條件，取1g金絲皇菊病葉于液氮速凍研磨成粉，加入 9mL 磷酸緩沖液（ 0.01molL，pH 值7.2＼～7.4）研磨勻漿，將勻漿液分裝至 2mL 離心管中， 4000r/min 離心 15min ，取上清液按CVB酶聯免疫分析試劑盒（CB12257-Pt，COIBOBIO）說明書進行操作，測定完成后分析結果。設置空白對照組、陽性對照組和陰性對照組。若陽性對照組OD值 gt;0.8 ，陰性對照組OD值 lt;0.2 ，則試驗結果有效；判斷閾值 Σ=Σ 陰性對照OD值 +0.15 ，若試驗組OD值 gt; 閾值，則試驗結果為陽性；若試驗組OD值 lt; 閾值，則試驗結果為陰性。

1.2.5系統發育分析將克隆測序結果與NCBI數據庫進行比對，采用Neighbor-Joining法在MEGA11軟件中構建系統發育樹，通過Bootstrap檢驗（1000次重復）評估節點支持率，分析目標序列的親緣關系。

1.3 數據處理與分析

使用Excel2017進行數據統計、整理和計算分析；使用MEGA11軟件繪制系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 RT-PCR檢測結果

RT-PCR檢測結果如圖2所示，金絲皇菊病葉樣本中擴增出2條目的條帶，其特異性擴增片段大小約為250和 750bp ，分別與CChMVd和CVB的目的基因片段長度相近。此外，未檢測到其他目標病毒（類病毒）的特異性目的條帶，初步證明金絲皇菊樣本中存在CChMVd和CVB的復合侵染，

2.2 酶聯免疫檢測結果

金絲皇菊病葉樣本的ELISA檢測結果顯示，空白對照組、陽性對照組和陰性對照組的OD值分別為0.044、1.301和0.084，均在標準范圍內。CVB檢測的OD值為0.269，大于閾值（0.234），檢測結果為陽性。酶聯免疫檢測結果證實供試樣本中存在CVB的特異性蛋白結構。

2.3 負染色電鏡觀察結果

經負染色電鏡觀察發現，用病葉樣本制備的懸浮液中存在兩種形態的病原組分：一種為環狀且有錘頭狀結構，無蛋白質外殼，可見內部結構，其大小約 200nm （圖3A），符合錘頭狀類病毒的結構特征，與CChMVd形態結構特征一致；一種單個粒子大小約 600nm ，呈桿狀結構，有蛋白質外殼，內部結構不可見（圖3B），與CVB粒子的形態結構特征一致。

2.4 系統發育樹分析

通過對RT-PCR產物的克隆測序及NCBI比對分析確認，金絲皇菊病葉樣本中同時存在CChMVd和CVB。系統進化樹（圖4）顯示，湖南地區分離物（類病毒）與西班牙發現的4個參考分離物（CChMVd，FJ647546.1等）聚在同一分支，相似度為 87% ，親緣關系較近。圖5顯示，湖南地區分離物（病毒）與南京發現的分離物（CVB，JQ904595.1）序列相似度達 100% ，二者處于同一進化分支，具有高度同源性。

3 討論與結論

金絲皇菊作為一種兼具藥用價值、觀賞價值和經濟價值的特色作物，在中醫藥、園藝景觀和鄉村振興等領域展現出較高的綜合價值和廣闊的應用前景[19-20]。然而，病毒或類病毒的侵染會對菊花的新陳代謝過程造成干擾，導致生長遲緩、植株矮化、花朵畸形、花色異常以及扦插成活率降低等一系列問題[14.21-22]。因病毒或類病毒引發的病害不僅影響金絲皇菊的產量和品質，還可能通過無性繁殖材料傳播，造成病害大面積擴散，對產業可持續發展構成嚴重威脅。因此，開展病原物精準檢測與鑒定工作，不僅有助于科學防控病害，更是保障金絲皇菊品質和產量的關鍵舉措之一。

研究通過系統的植物病毒與類病毒檢測，揭示了湖南洪慈菊花種植基地金絲皇菊花葉病害的病原物特征。試驗結果顯示，湖南病葉樣本分離物（類病毒）與已知西班牙分離物（CChMVd，FJ647546.1等）的系統發育相似度為 87% ，聚在同一分支；湖南病葉樣本分離物（病毒）與南京分離物（CVB，JQ904595.1）同源性高達 100% ，同屬一個分支。因此，可以確定該基地金絲皇菊花葉類病害是由菊花褪綠斑駁類病毒（CChMVd）和菊花B病毒（CVB）復合侵染引發。CChMVd和CVB這兩種病原物主要通過無性繁殖苗及汁液接觸傳播，傳播范圍涵蓋全球多個國家和地區[23-26]。其中，CChMVd侵染現象主要在菊花中被發現，侵染后會導致菊花葉片褪綠斑駁、植株生長不良和花朵產量減少等問題；而CVB浸染可能引發菊花花葉、紅葉和矮化等癥狀，其在觀賞菊和栽培菊中普遍存在，發病率達40%[27-28]

此外，當菊花受到多種病原物復合侵染時，RT-PCR和ELISA等病原檢測鑒定技術的聯合應用，能夠快速鑒別病原物組成，是實現金絲皇菊規模化脫毒的關鍵環節[29]。這些檢測技術還可以用于篩選無毒種苗，為金絲皇菊的種苗繁育提供健康的起始材料，從而在種源上保障其品質和產量。

金絲皇菊作為區域特色農作物，其種植和加工產業已在湖南等主產區形成規模化發展格局，其病害防控直接關系到產業效益和可持續發展。通過建立完善的病原檢測體系，可以有效降低病害發生率，提升產品品質和市場競爭力。因此，筆者未來將進一步優化金絲皇菊病原檢測技術，探索更高效的脫毒方法，以期為金絲皇菊的健康種植和產業發展提供助力。

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（責任編輯：彭靜瀾）