密林熊蜂蜂王腸道拮抗菌株的分離鑒定及生理生化特性分析

關鍵詞密林熊蜂;拮抗菌株;分離鑒定；生理生化特性;抑菌效果

中圖分類號S891文獻標識碼A

文章編號 0517-6611（2025）13-0064-07

doi：10.3969/j. issn. 0517-6611.2025.13. 013

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Isolation，Sreng，detatiodygicalandiocheialCaracteristicsalysisofGutAtagosticSasoot Bumblebee Queens

WANG Wen-long，CHENYi-zuo，WANGJing-zhuoetal（SchoolofifeSciences，ChangchunNoal Universty，Changchun，ilin 130032）

AbstractObectie]oinvestgatetherelationshipbetweenbumblebeesandteirgutmicrobiota.Method]Thisstudyiedtosolate， screnadintfotetialgostcisfroutfmutgtss，dtesigatetibctealo Intialsceingasasdofrecsinolooloiz，ndmorpolog，lodyuiplesrakpurfatiostoainpreultures.ntagosseedateedoodibeliabilid iologicalandocalracteristfieatisupatassedsulterinchidt inhibitoryectistStalcoccusueussetifdscbcillsueiouhGBnktabseomparsot tionsupeaantfemosdiantictiistEheccoldclsblisW， catalaseandahdrosectityutitsrolisctiityactiisgtieddoleductactsii [Conclusion]ssdsuefuloladdentidtetagostic 3ittetalaplatiofrhutspat agiatusqens.ebod-sptanibactealaivitydsabilitofthmetatiosupeatantofsainW3igghtitsprsingp plicationin the development of biological bactericides.

Keywordsspttusagosticasoaodt;aldicalacest effect

熊蜂授粉是一種高效的生物授粉方式[]，不僅能夠有效提高農作物的產量及改善果實形態，減少畸形果的出現，還規避了化學授粉可能導致的激素殘留問題[2]。此外，熊蜂還可以用于牧草等作物的傳粉，對提高牧草產量也有顯著效果[3]。由于熊蜂相比蜜蜂趨光性弱、更耐低溫、工作時間長、訪花頻率高。在設施農業中熊蜂授粉效率明顯高于蜜蜂[4]，另外熊蜂也能夠用于解決蜜蜂對于帶有特殊氣味的茄科作物采集度不高的問題[5]。我國擁有豐富的熊蜂資源，約占全球熊蜂種類的 50% ，但是經人工馴化并投入商用仍任重道遠，熊蜂資源開發正備受關注[]

研究表明，腸道微生物在提升宿主的免疫力方面發揮著關鍵作用，故探索熊蜂與其體內微生物群落間的相互作用關系，對于增強熊蜂的生存能力具有重要意義[]。歷經漫長的進化過程，昆蟲與細菌之間建立了互利的共生關系，它們腸道內寄居的菌群對寄主極為有益，它們參與食物中營養物質的攝取與轉化過程，滿足昆蟲自身及其生長發育的需求[8]作為無脊椎動物的昆蟲，缺乏完備的免疫系統，昆蟲腸道細菌具備分泌抗菌肽的能力，能夠對抗病原體的侵害[9]。曹喆等[10]利用牛津杯法對短頭熊蜂（Bombusbreviceps）腸道進行拮抗菌株篩選鑒定及其生物特性評價，篩選出5株優異拮抗菌，其中果桿菌CZ01具有抑菌活性高、穩定性好、抑菌譜廣等特性。雷清芝等[1]從東方蜜蜂（Apiscerana Fabricius）成年工蜂腸道內分離獲得的羅伊氏乳桿菌LP4具有良好的益生特性，飼喂給東方蜜蜂成年工蜂后，該菌可通過改善腸道微生態平衡（如增加乳酸菌數量，減少腸球菌、真菌數量）和增強腸道免疫功能明顯提高東方蜜蜂成年工蜂的存活率。密林熊蜂是吉林省周邊優勢野生蜂之一，具有商品化潛能，通過篩選和應用具有特定抗病性的拮抗菌，可以提高蜂王的抗病性、促進生長發育、降低馴化過程中的病蟲害風險，為密林熊蜂的人工馴化提供有力的支持。

1材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株。病原指示菌株：金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）大腸桿菌（Esch-erichiacoli）均由長春師范大學生物實驗室保存使用。

1.1.2主要試劑。PCR試劑、通用引物27F和1492R、胃蛋白酶1、胃蛋白酶A、蛋白酶K，生工生物工程（上海）股份有限公司；LB和MRS培養基，廣東中山百微生物技術有限公司；TSB培養基，青島高科技工業園海博生物技術有限公司。1.1.3主要儀器。二氧化碳培養箱、醫用潔凈工作臺，濟南鑫貝西生物技術有限公司；高壓滅菌鍋，山東博科消毒設備有限公司；高速冷凍離心機、水浴恒溫振蕩器，金壇市榮華儀器制造有限公司； pH 精確試紙，杭州特種紙業公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 密林熊蜂蜂王腸道細菌的分離純化。于4月末5月初在長白山附近捕獲越冬完成、外出覓食的密林熊蜂蜂王，查閱資料，綜合特征確認采集的熊蜂樣本為蜂王。首先，取3只密林熊蜂蜂王，1只為一組，3組重復，試驗開始前需饑餓處理 18～24h （存活）。隨后，使用鑷子將樣本浸泡在 75% 乙醇中 1min ，再移至無菌水燒杯中輕微振蕩以去除乙醇。在超凈工作臺中解剖腸道，用灼燒并冷卻的剪刀從螯針處剪至腹部，再用同樣處理的鑷子取出腸道，迅速放入裝有 1mL 生理鹽水的研缽中研磨成勻漿。取 100μL 研磨液加入 900μL 生理鹽水的滅菌離心管中稀釋，制備成 10^-1?10^-3 和 10^-5 3 個濃度梯度的稀釋液。各取 100μL 稀釋樣本均勻涂布在LB和MRS固體培養基上，每組重復3次，置于 濃度為 5% 的 CO₂ 培養箱中培養 36～48h 。根據菌落的外觀特性進行初步篩選后，用接種環挑取單一菌落進行劃線分離，重復此純化步驟2次，共進行3次純化，以獲得純凈菌株。鑒于菌株的分類和培養溫度未明確，參考前人試驗[12]，選擇37^°C 作為標準溫度條件。將純化后的菌株接種于 5mL 液體培養基中，在 37°C，150r/min 的條件下培養 ^12h ，然后與甘油 1：1 混合，保存于 -80°C 超低溫冰箱中備用。

1.2.2革蘭氏染色。將分離純化得到的單菌落，通過肉眼進行初步觀察，以評估其菌落表面的基本形態。隨后挑取單個菌落，均勻地涂抹在載玻片上，對樣品進行革蘭氏染色處理[13]，并將染色后的樣品置于顯微鏡的 100× 倍物鏡下觀察，結合顯微形態和染色情況，初步確定單菌落的分類歸屬

1.2.3發酵上清液的提取。將純化的菌株培養液以 1% 的劑量接種到 50mL MRS液體培養基中，置于水浴恒溫振蕩器中 培養 24h ，分裝到 5mL 離心管中，再用高速冷凍離心機離心 10min 后去沉淀取發酵上清液，封裝置于冰箱中4℃保存備用[14] O

1.2.4拮抗菌株的抑菌圈篩選。采用平板挖孔法來測定發酵上清液的抑菌活性，首先用棉棒蘸取濃度為 10^-3 的金黃色葡萄球菌沿 120°?240°?360° 3 個方向涂勻涂滿整個固體培養基，再用 100～1000μL 的移液槍藍色槍頭粗端沿平板中分線在兩端挖孔，孔內注滿單菌落發酵上清液，觀察抑菌圈以找出抑制金黃色葡萄球菌的拮抗細菌。為了驗證這些菌株的抑菌效果，設置了對照試驗，使用等量且經過高溫滅活的各菌株對應的發酵上清液。每組試驗均進行了3次重復。

抑菌效果的評估依據參照朱成科等[15]的方法并適當修改：抑菌圈直徑 lt;9mm ，無抑菌效果； 9mm? 抑菌圈直徑lt;14mm ，低度抑菌效果； 14mm? 抑菌圈直徑 lt;19mm ，中度抑菌效果；抑菌圈直徑 ?19mm ，高度抑菌效果。

1.2.5拮抗細菌的DNA 提取與菌種鑒定。依據Justé等[16]的方法，提取金黃色葡萄球菌的拮抗菌株中的DNA。隨后，利用細菌通用引物正向引物27F（ 5^′ -AGAGTTTGATCCTG-GCTCAG-3）和反向引物1492R（ 5^′ -TACGACTTAAC-CCCAATCGC-3'），利用聚合酶鏈式反應（PCR）技術對DNA樣本進行擴增。經過PCR擴增得到的產物送往生工生物工程（上海）股份有限公司進行純化與測序處理。將測序所得的數據上傳至GenBank數據庫，借助BLAST這一在線工具，對序列間的相似性進行比對分析。從數據庫中篩選并獲取了與待測序列相關的多個屬種的16SrRNA基因序列，并利用MEGA11軟件建立了系統發育樹。

1.3 細菌生理生化特性分析

1.3.1過氧化氫酶活性分析。在拮抗菌株的固體培養基中直接倒入 5% 的 H₂O₂ 溶液， H₂O₂ 溶液需完全沒過菌株，觀察如果有氣泡產生，判定該細菌的發酵液具有過氧化氫酶活性，反之則無[17]

1.3.2酪素水解活性分析。在制備TSB固體培養基時，添加 10% 的脫脂牛奶。將待測的拮抗菌接種于這一特殊培養基上，并將其置于 濃度為 5% 的 CO₂ 培養箱中進行培養。當培養基上顯現出清晰的菌落時，仔細觀察菌落周圍的情況。如果觀察到菌落邊緣形成了明顯的透明圈，表明該菌落具有酪蛋白水解的能力，即具有酪素水解活性；若未見此現象，則意味著該菌落不具備此活性[17]

1.3.3脂酶活性分析。配制 TSB 固體培養基時加入 0.50g NaCl、0.01gCaCl₂?7H₂0、1.00g 蛋白陳和 1% Tween80，將拮抗菌株接種在該培養基上，置于 濃度為 5% 的CO₂ 培養箱培養，待出現明顯菌落，如果菌落周圍出現暈圈，則表明該菌落的發酵液具有酯酶活性，反之則無[18]

1.3.4淀粉水解活性分析。制備TSB固體培養基時，添加1% 的可溶性淀粉。再將拮抗菌接種到該培養基表面，并放置于 濃度為 5% 的 CO₂ 培養箱中進行培養，直至培養基上長出明顯菌落。當菌落形成后，將已經稀釋20倍的盧戈氏碘液從培養基平板的側邊緩緩倒入，讓其均勻覆蓋。靜置 3～4min ，輕輕倒去多余的碘液。此時，若在自然光線下觀察到培養基表面出現了透明的光圈，表明該菌株具有淀粉水解酶的活性;若未觀察到透明光圈，則表明該菌株不具備此酶活性[18]

1.3.5V-P反應分析。在制備TSB液體培養基的過程中，添加了 0.5% 的葡萄糖作為補充成分。將拮抗菌的菌液接種到該特殊的液體培養基中，隨后，將該培養基置于 濃度為 5% 的 CO₂ 培養箱中培養 18～24h 。培養結束后，取1 mL 40% NaOH與 1mL 菌液混合，再加入微量 0.3% 的肌酸，經過劇烈搖動以達到充分混合均勻的狀態后，讓其靜置10min 。如果溶液顯現紅色，則表明該菌株V-P反應為陽性;反之，則判定為陰性[19]

1.3.6吲哚產生反應分析。在制備TSB液體培養基的過程中，加入 1% 的胰蛋白脈。隨后，將拮抗菌的菌液接種到添加了胰蛋白脈的培養基中，將該培養基放置于 濃度為 5% 的 CO₂ 培養箱中培養 18～24h 。培養結束后，向菌液中加人 1～2mL 乙醚，并輕輕搖晃使其混合，之后靜置等待溶液分層。當溶液出現明顯分層后，往其中加入數滴吲哚試劑，注意液體分層界面的顏色變動，如果觀察到有紫紅色出現，則可判定為陽性反應；相反，如果未見紫紅色，則判定為陰性反應[19]

1.4拮抗菌發酵上清液的抑菌物質穩定性

1.4.1不同酶溶液處理后的發酵液穩定性。將發酵上清液的pH調整至7.0后，加入濃度為 1mg/mL 胃蛋白酶1、胃蛋白酶A、蛋白酶K的溶液。隨后，將這些混合物置于 37°C 的水浴鍋中進行 ^2h 的恒溫水浴處理。再通過 80^qC 水浴加熱10min 使酶變性失活。參照文獻[20]的方法，為驗證結果的可靠性，設置了未經酶處理的發酵上清液作為參照組，并且所有試驗均重復3次。

1.4.2發酵上清液對其他致病菌的抑制作用。利用挖孔和棉棒涂布法[21]，評估發酵上清液對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌的抑菌活性。同時設置了高溫滅活后的發酵液作為對照組。整個試驗過程重復3次。

1.4.3發酵液的熱、酸堿穩定性分析。為了評估拮抗菌株發酵上清液的熱穩定性，將發酵上清液置于水浴或金屬浴中加熱 30min ，加熱溫度梯度為 37，60，80，100，121^°C ；加熱完成后自然冷卻至室溫，進行熱穩定性測定。為了測試拮抗菌株發酵上清液的酸堿穩定性[22]，使用 5mol/L 的HCl溶液和

5mol/L 的 ΔNaOH 溶液，將發酵上清液的 pH 調整至2、4、6、8、10，調整后的樣品經 37^°C 水浴 2h 穩定后，再將 ΔpH 回調至7.0，進行酸堿穩定性測定。在這2項測試中，以未經處理的發酵上清液作為對照組，并且所有測試均獨立重復3次。

1.5數據分析在此次試驗中，所有數據均源自3次平行試驗的測定，并以平均值 ± 標準差（ Mean±SD ）的形式呈現。利用GraphpadPrism9.5.1和Excel2021軟件系統整理與深入分析試驗數據。分析過程中，綜合運用 χ_t 檢驗（Student’st -test）來比較兩組數據均值的差異顯著性，單因素方差分析（One-WayANOVA）來評估多組數據間均值的整體差異，以及最小顯著差異法（LSD）來明確組別間的均值差異是否具有統計學顯著性，所有分析均以 Plt;0.05 作為判斷差異顯著的閾值。

2 結果與分析

2.1抑菌菌株的篩選通過挖孔和棉棒涂布法，篩選出3株對金黃色葡萄球菌有較明顯抑制作用的菌株（W8、W10、W13），且3株菌對金黃色葡萄球菌的抑菌直徑在16.46＼～19.08mm ，抑菌圈最小的是W10（ 16.46mm^? ），較大的抑菌圈菌株是W8（ 17.75mm ），抑菌圈最大的菌株為W13（ 19.08mm? ），對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最佳，因此選擇W13為后續的深入研究對象，后續測定發現W13發酵上清液對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等病毒指示菌也有明顯的抑制效果（圖1和表1）。

注：A.金黃色葡萄球菌；B.枯草芽孢桿菌；C.大腸桿菌。

Note：A.Staphylococcusaureus;B.Bacillussubtilis;C.Escherichiacoli.

圖1拮抗菌株抑菌效果

Fig.1The antibacterial effect of antagonistic strains

2.2 拮抗菌株W13的鑒定

2.2.1菌株W13形態學觀察。在MRS固體培養基平板上對菌株W13進行 12h 培養，菌落呈現出圓形、白色、表面光滑且不透明、邊緣整齊的特點（圖2A）。通過對菌株W13進行革蘭氏染色并在 100× 光學顯微鏡下觀察，發現菌體呈現紫色，表明該菌株為革蘭氏陽性菌，且菌體形態為桿狀（圖2B）。

圖2菌株W13的菌落形態（A）和革蘭氏染色鏡檢（B）

Fig.2Colony morphology（A）and Gram staining microscopic examination（B）of strain W13

2.2.2菌株W13的分子鑒定。采用挖孔和棉棒涂布法篩選，試驗結果顯示，菌株W13對金黃色葡萄球菌展現出高度抑菌效果。隨后，對該菌株進行16SrRNA基因測序，并將獲得的序列上傳至GenBank數據庫，其登錄號為PQ656483。

基于這一16SrRNA基因序列，在GenBank數據庫中進行相似性比對，拮抗菌株W13與Apilactobacilluskunkeei的16SrRNA基因序列相似性達到 99% ，選取了相似性超過 99% 的細菌種類作為參考，構建了系統發育樹（圖3）。

2.3發酵液生理生化特性分析

2.3.1過氧化氫酶活性分析。在接種了菌株W13的固體培養基中倒入 5% 的 H₂O₂ 溶液， H₂O₂ 溶液覆蓋菌株即可，結果發現并沒有氣泡產生（圖4A），說明菌株沒有分解過氧化氫酶的活性。

2.3.2酪素水解活性分析。按照“1.3.2\"方法處理后，當培養基上顯現出清晰的菌落時，觀察到明顯的透明圈（圖4B），這一現象表明菌株W13具備酪蛋白水解的能力。

2.3.3脂酶活性分析。按照“1.3.3”方法處理后，待出現明顯菌落，并未發現皺縮暈圈（圖5A），表明菌株W13不具有脂酶活性。

2.3.4淀粉水解活性分析。按照“1.3.4\"方法處理后，在自然光線下進行觀察，未發現明顯的透明光圈形成（圖5B），表明菌株W13并不具備淀粉水解酶活性。

2.3.5V-P反應分析。按照“1.3.5\"方法處理后，溶液未呈現紅色（圖6A），表明菌株W13的V-P反應為陰性。

2.3.6吲哚產生反應分析。按照\"1.3.6\"方法處理后，在溶液的分層界面處出現紫紅色的吲哚環（圖6B），表明菌株W13的吲哚產生反應為陽性。

2.4發酵液穩定性分析

2.4.1發酵上清液的酶敏感性。采用平板挖孔法和棉棒涂布法測定拮抗菌株W13發酵上清液經胃蛋白酶1、胃蛋白酶A、蛋白酶K處理后對金黃色葡萄球菌的抑菌效果影響，結果發現（圖7），經處理后的抑菌效果均顯著下降，與未經酶處理的對照組（CK）相比，胃蛋白酶1、胃蛋白酶A、蛋白酶K的抑菌圈直徑分別顯著減少了 27.88%.23.38%.23.87% ，表明胃蛋白酶1的抑菌效果下降最顯著，達到了低度抑菌效果；胃蛋白酶A的抑菌效果最好。這可能是由于胃蛋白酶A的數據變異較大或者其處理效果相對較弱所致。

2.4.2發酵上清液的熱處理穩定性。W13發酵上清液經過不同溫度梯度處理后的抑菌效果如圖8所示，在 37^°C 時，抑菌圈直徑較大，平均約為 19.0mm ，這表明在接近適宜熊蜂生存溫度的環境下，抑菌物質能夠較好地發揮其抑菌作用。隨著溫度的升高，抑菌圈直徑逐漸減小，在 60，80，100^°C 時，抑菌圈直徑分別顯著減少至 16.5，15.6，15.1mm ，這表明隨著溫度的升高，抑菌物質的抑菌效果逐漸減弱；在 121^°C 時，抑菌圈直徑顯著減小至 9.1mm ，這一急劇變化表明在高溫條件下，抑菌物質的抑菌效果受到了嚴重影響，可能由于高溫導致抑菌物質的結構發生變化或失活。

2.4.3發酵上清液的酸堿穩定性。從圖9可以看出，調整 注： 表示與CK相比，差異顯著（ Plt;0.05 。 Note：* indicates significant difference compared with C K（Plt;0.05）

發酵上清液的 ΔpH 對抑菌效果有明顯影響，不同 pH 處理組的抑菌圈直徑與對照組（ pH=7 ）相比均存在顯著差異（ Plt; 0.05），且在一定范圍內（ ），抑菌效果隨 ΔpH 的升高而增強，但超過一定范圍（ pH=8 ）后，抑菌效果急劇下降，在pH=10 時拮抗菌株W13發酵上清液的抑菌能力幾乎喪失。在 ΔpH 為6的條件下，發酵上清液的抑菌效果最佳，這可能是由于在該 pH 下發酵上清液中的活性成分最穩定。

注：*表示與CK相比，差異顯著（ Plt;0.05 。Note： * indicates significant difference compared with CK（ Plt;0.05） ：

3討論與結論

熊蜂是一種重要的授粉昆蟲，在自然界和農業生態系統中扮演著關鍵角色，熊蜂在設施作物中具有顯著的生物學特性優勢、授粉技術優勢以及生態與社會效益優勢，是設施農業中不可或缺的授粉昆蟲[23]。近年來，它們正面臨著來自環境的多因素壓力，包括生存范圍縮小、環境惡化、農藥脅迫、全球升溫、病原菌侵染等，尋找保護熊蜂的方法迫在眉睫[24]。研究發現，熊蜂腸道是最大的菌群聚集地，經過長久的進化，腸道微生物已經與個體形成高度平衡的互利共生關系[25]，在昆蟲的個體生長發育過程中起到至關重要的作用，包括營養物質的轉化、增強免疫力和抗逆能力、解毒和抵抗病原菌等[26]。絕大多數熊蜂的生命周期只有1年，但它們體內的菌群并非一成不變而是動態變化的[27]，新出房的工蜂會通過與較大日齡工蜂交哺和食糞來獲取蜂群共有的菌群，也會因為外出覓食等方式獲取相對特殊的腸道菌群[28]Weinhold等[29研究顯示，包括乳酸桿菌在內的某些腸道微生物對一些致病菌具有顯著的拮抗作用，乳酸桿菌等在保護宿主的同時，還能夠延長蜂王體內食物的保質期。熊蜂腸道中的共生菌群可能是其有效抵御病原性短膜蟲入侵的主要機制[30]，并且腸道內細菌的數量多少與短膜蟲的感染頻率之間呈現出明顯的負相關關系。通過對四川、青海、甘肅、內蒙古這4個省份的短膜蟲流行狀況及腸道細菌數量差異進行研究，發現維持腸道功能菌群的平衡狀態對于保障寄主的健康狀態具有極其關鍵的意義[31]

該研究通過對密林熊蜂蜂王腸道進行拮抗菌株的分離、篩選及鑒定，旨在發掘具有潛在應用價值的抑菌資源。在分離篩選過程中，依據菌落的外觀特性進行了初步篩選，并通過多次劃線純化獲得了純凈無雜菌的培養菌株。鑒于菌株的分類地位及最適培養溫度尚未明確，選擇了 37^°C 作為標準溫度條件進行后續試驗，這一選擇基于試驗方法的通用性以及對熊蜂腸道微生物生長特性的初步考慮。通過此方法，成功篩選出了對金黃色葡萄球菌具有高度抑菌效果的菌株W13。進一步研究發現W13發酵上清液不僅對金黃色葡萄球菌有高度抑菌效果，還對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等指示菌表現出明顯的抑制活性，這顯示了W13具有廣譜抑菌的潛力。形態學觀察結果顯示，菌株W13在MRS固體培養基上呈現圓形、白色、表面光滑且不透明、邊緣整齊的特點，且革蘭氏染色呈陽性，菌體形態為桿狀。這些特征為菌株W13的初步鑒定提供了重要依據。通過16SrRNA基因測序及在GenBank數據庫中與已知序列進行比對并構建系統發育樹分析，進一步確定W13為厚壁菌門（Firmicutes）乳桿菌目（Lactobacillales）乳桿菌科（Lactobacillaceae）Apilactobacillus屬的乳酸菌Apilactobacilluskunkeei。

針對菌株W13對病毒指示菌的高效拮抗活性，該試驗又進一步對W13發酵上清液的生理生化反應和穩定性進行測定，發現W13發酵上清液無脂酶、過氧化氫酶、淀粉水解酶的活性，但具有酪素水解活性，V-P反應為陰性，吲哚產生反應為陽性。再經胃蛋白酶1、胃蛋白酶A、蛋白酶K處理后，發現經處理后的抑菌效果均顯著下降，胃蛋白酶1、胃蛋白酶A、蛋白酶K相對于對照組抑菌圈直徑分別顯著減少了27.88%.23.38%.23.87% ，由此猜測發酵上清液的抗菌物質成分可能是多肽或者蛋白質。在熱穩定中，發現抑菌活性在37^°C 最高，隨著溫度增加抑菌活性逐漸下降，溫度升高至121^°C 抑菌活性幾乎喪失，可能由于高溫導致抑菌物質的結構發生變化或失活[32]。酸堿穩定性中，在pH過高或者過低條件下，均會顯著影響拮抗活性，表現出較差的酸堿穩定性。

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