象草PHR家族基因的鑒定及表達分析

中圖分類號：S54 文獻標識碼：A 文章編號：1007-0435（2025）07-2099-15

doi：10.11733/j.issn.1007-0435.2025.07.006

引用格式：，等.象草PHR家族基因的鑒定及表達分析[J].草地學報，2025，33（7）：2099—2113 FANG Ting，LUO Jia-jia， ZHANG Yu-ge，et al. Identification and Expression Analysis of the PHR GeneFamily in Pennisetum Purpureum[J].Acta Agrestia Sinica，2025，33（7） ：2099-2113

Identification and Expression Analysis of the PHR Gene Family in Pennisetum Purpureum

FANG Tingl#，LUO Jia-jia ^1，2#_. ， ZHANG Yu-ge1，MAO Yu-ye1，GUO Yu-tong1， DONG Rong-shu2， CAI Ze-ping1* （1.SchooloficalAgiclureandFestryanUvesityo，inrovie28a;oicalCoetic Resources Institute，Chinese AcademyofTropical Agriculture Sciences，KeyLaboratoryofCropGeneResourcesand Germplasm EnhancementinSouthernChina，MinstryofAgricultureandRuralAfairs，Haikou，HainanProvince57o，China）

Abstract：The phosphate starvation response （PHR） factor plays a pivotal role in regulating phosphorus homeo stasis in plants，yet the PHRs in Pennisetum purpureum （elephant grass）remain unreported. This study analyzed the efects of low phosphorus （P）stress on the growth of elephant grass，identified the members of PHR family in elephant grass，and examined their transcription expression levels.Furthermore，the two key genes P/PHR/13 were cloned，and their expression patterns and subcellular localization were analyzed. The results demonstrated that low P stress significantly inhibited the growth of elephant grassA total of 42 PpPHRs were identified from the elephant grassgenome，with colliear gene pairs originating from whole-genome duplication or segmental duplication events. Transcriptome showed that 1 5PρPHRs were significantly upregulated by low P stress in elephant grass leaves（and/or roots），with P/PHR/13 exhibiting relatively high expression levels. Additionally， tissue-specific expression analysis revealed that P/PHR/13 had the highest expression levels in roots and stems，respectively. Quantitative PCR confirmed that low P treatment enhanced the expression of

P/PHR/1/3 in both roots and leaves. Subcellular localization indicated that both P/PPHRδ andPpPHR13pro teins were localized in the nucleus. This study provides candidate gene resources for elucidating the mechanisms underlying elephant grass's response to phosphorus deficiency.

Key Words：Pennisetum purpureum;Low phosphorus stress ;Phosphate starvation response factor;Gene expres sion;Subcellular localization

磷（Phosphorus，P）是植物生長所必需的大量營養元素之一，是生物大分子（如核酸、磷脂和三磷酸腺苷ATP等）的基本結構組分，主要通過磷酸化和去磷酸化作用參與光合作用、能量代謝和細胞信號轉導等多種重要生物過程[1]。雖然土壤中磷含量豐富，但大部分以有機磷和無機難溶性磷酸鹽的形式存在，而植物能直接吸收利用的無機磷酸鹽（ H₂PO^4- ，Phosphate inorganic，Pi）含量不足 1% 。為緩解磷有效性低的問題，農民主要通過大量施用磷肥以期提高作物產量，但磷在土中容易被固定為不可直接吸收的磷復合物形式（如在酸性土壤中容易被固定為鐵磷和鋁磷，在堿性土壤中容易被固定為鈣磷），且大部分容易隨土壤淋溶進入江河，以引起水體富營養化的環境污染，實質上作物的磷利用效率普遍偏低[2]。全世界范圍內，約 40%～60% 可耕地的作物都受到低磷有效性的限制[3]。因此，有效提高作物的磷利用效率（Phosphorusutilizationeffi-ciency，PUE）已成為農業生產中亟待解決的重要問題，而闡明植物對低磷的適應機制是前提。在有效磷（Pi）不足的環境中，植物已經進化出一系列復雜而精細的分子調控網絡，以加快外部磷的攝?。椎奈眨┖驮鰪妰炔苛椎难h（磷的利用），其中PHR（Phosphate starvationresponse）蛋白被一致認為是磷信號通路的核心調控因子，參與調控磷穩態[4]。

擬南芥（Arabidopsisthaliana）AtPHR1是第一個被鑒定出的參與磷代謝的重要調節因子，研究發現AtPHR1超量表達能提高擬南芥葉片中的磷含量[5]。隨后，在擬南芥中鑒定到多個AtPHR1的同源基因，包括轉錄因子AtPHL1（PHRlike1），AtPHL2，AtPHL3和AtPHL4，這些同源基因同樣也被證實參與調控磷酸鹽缺乏響應[5]。目前，已對多個物種的PHRs基因進行了全基因組鑒定，如擬南芥有15個，水稻（Oryzasatiue）有16個[6]，玉米（Zeamays）有18個[7]，大豆（Glycinemax）有35個PHRs 基因[8]，這些PHRs蛋白典型的特征是含有一個結合DNA的MYB結構域（PF00249）和一個參與蛋白質-蛋白質相互作用的卷曲螺旋（CC）結構域（PF14379）。PHRs是磷信號通路中的核心轉錄因子，其主要通過與基因啟動子序列的P1BS（PHR1binding sequence）順式作用元件結合以調控下游磷饑餓響應（phosphate starvation response，PSR）基因的表達，以激活磷信號來維持磷穩態，P1BS元件是一個不完整的回文序列 5^′ -GNATATNC-3'[9]。在植物直接吸收根際土壤中的磷酸鹽途徑中，PHRs可激活調控下游PSR基因的表達，包括蛋白激酶（如叢枝發育激酶ADK），參與磷信號途徑調控的microRNAs（如miR399），以及參與磷吸收（如磷轉運蛋白）同化（如磷脂酶和硫脂酶）和再分配（如核糖核酸酶和磷酸酶）的基因[2]。在低磷條件下，Zhang等人分析了高粱（Sorghumbicolor）的phrl或phll突變體轉錄組，發現PHR1基因不僅調控PSR基因的表達，還參與了植物激素乙烯、茉莉酸和水楊酸代謝途徑相關基因的表達調控。植物除了直接吸收Pi的途徑以外， 80% 的植物能與叢枝菌根真菌（Arbuscularmycorrhiza fungi，AMF）形成互惠共生體以增加Pi的獲取[1]。近期的大量研究發現，PHRs 參與調控多種植物的AMF共生體的形成，包括水稻和百脈根（Lotusjaponicus）等，其主要通過調控植物中菌根共生體形成相關基因的表達（包括RAMI，PTII ，WRI5A和 AMT3 ；1等）以影響AMF在植物中的定殖，同時還調控特異在含叢枝細胞內表達的蛋白水解酶基因，以影響叢枝的降解[11-13]。PHRs蛋白的活性受磷酸鹽感應的SPX蛋白的調控，當細胞中Pi充足時，SPX蛋白與PHR結合，以抑制PHR的轉錄活性，進而抑制了下游的磷酸鹽饑餓響應；當細胞中Pi不足時，SPX蛋白被降解，進而解除了對PHRs的抑制作用，啟動了磷饑餓的級聯信號應答[14]。其中，SPX蛋白是以SYG1（酵母GPA1抑制子）、Pho81（酵母PHO途徑中的CDK抑制子）和XPR1（異嗜性和多嗜性逆轉錄病毒受體）而命名。因此，PHRs轉錄因子在調控植物磷饑餓響應，維持內源磷穩態中發揮著關鍵作用。

象草（Pennisetumpurpureum）是禾本科（Poaceae）狼尾草屬（Pennisetum）典型的 C₄ 植物，起源于非洲、亞洲和美洲等的熱帶和亞熱帶地區，其不僅是經濟上重要的熱帶牧草作物和觀賞植物，還是生產酒精、生物炭、甲烷和紙等的優良原料[15]，可用于生態保護以提高土壤肥力和防止土壤侵蝕[16]。象草具有耐貧瘠土壤和高溫、抗干旱、生長迅速和高生物量等優良特征，在水肥供應充足的條件下，象草可長至 2～6m 高，生物量產量約為 45t?hm^-2 ，每年可收割 3～4 次[17]。因象草種植于熱帶亞熱帶地區，而這些地區也是酸性土壤主要分布區域，表明象草對磷低效的酸性土壤具有較強的適應性，同時象草的快速生長需要大量的水和肥，因此解析象草高效利用磷素的調控機理，可為磷高效象草新品種的培育提供候選基因和奠定理論基礎。在植物適應低磷環境中，PHRs轉錄因子起著核心調控作用[18]。然而，迄今為止，未有對象草 P/pPHRs 基因進行鑒定、克隆及分析的報道， P/pPHRs 參與調控象草適應低磷脅迫的分子機制仍不清楚。因此，本研究對象草 P/pPHRs 基因進行了全基因組鑒定、生物信息學和表達模式分析，并對兩個關鍵基因進行了克隆和亞細胞定位分析，為深入研究 P/pPHRs 基因調控低磷環境下象草利用磷素的分子功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料培養及處理

本研究所用象草（Pennisetumpurpureum）材料由中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所“國家熱帶牧草中期備份庫\"（熱帶牧草庫）提供。本研究參照Luo等人方法[19]，利用Magnavaca營養液進行水培，其實驗流程簡述為：取象草健壯的種莖進行催芽，待種芽長至 10cm 左右，選取均一的幼苗在含有 600μmol?L^-1KH₂PO₄ 的正常供磷營養液中預培養10d，隨后選取長勢良好且一致的幼苗，分別進行正常供磷（HP，添加 600μmol?L^-1KH₂PO₄） 和低磷脅迫（LP，添加 5μmol?L^-1KH₂PO₄） 處理，培養液 pH 值為 5.8～6.0 ，每隔5天更換一次。處理培養15d后，分別收取地上部、葉片和根系樣品，檢測其干重和全磷含量。同時，分別在處理培養5，10，15，20d收取不同位置的混合葉片和根系樣品，立即凍存于液氮中，并保存在一 80^°C 冰箱中，用于后期分析基因的相對表達水平。象草生物量測定是將收取的地上部和根系樣品在 105^°C 殺青 30min，70^°C 恒溫烘干后稱量干重。象草全磷含量的測定是將收取的葉片和根系樣品烘干粉碎后，分別稱取約

0.02g用濃硫酸消煮至無色后，冷卻并定容，采用鉬銻抗比色法，測定 OD₇₀₀ 的吸光度值，依據標準曲線計算全磷濃度。

1.2象草PHR家族基因的鑒定、生物信息學及共線性分析

首先，分別以擬南芥（Arabidopsisthaliana）的15個和水稻（Oryzasatiua）的12個PHR轉錄因子家族成員氨基酸序列為參考，利用Blastp（版本2.5.O）進行同源比對，鑒定象草PHR家族成員。隨后，在Pfam數據庫（https：//www.ebi.ac.uk/interpro/search/text/）獲取PHR轉錄因子的典型保守結構域序列，包括Myb_DNAbinding（PFOO249）和Myb_CC_LHEQLE（PF14379）結構域，利用Hmmsearch搜索象草蛋白序列以鑒定保守結構域。最后，將同源比對和保守結構域鑒定兩種方法鑒定到的可能PHR轉錄因子進行合并，再利用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）和CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）在線軟件進一步確定上述鑒定到的PHR保守結構域。

首先，利用在線軟件Expasy（https：//web.expasy.org/protparam/預測蛋白理化性質，包括蛋白氨基酸數目、分子量、等電點、平均疏水指數。對于篩選的關鍵候選基因PpPHR8和PpPHR13，利用在線軟件GSDS（https：//gsds.gao-lab.org/預測基因的內含子、外顯子結構以及在染色體上的分布；利用在線工具HMMER（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/search/hmmscan）預測蛋白結構域Pfam的具體位點；參考Esfahani等人報道的磷響應相關順式作用元件，選取 P/PPHRδ 和PpPHR13起始密碼子ATG上游 2.0kb 作為啟動子序列，結合PlantCARE數據庫（http：//www.dna.affrc.go. jp/PLACE/），預測到了三個磷相關的順式作用元件，包括P1BS、CACGTG-motif 和PHO element[20]。此外，利用MCScanX工具分析象草 P/pPHRs 的復制方式，利用Circos軟件繪制了全基因組復制（wholegenomeduplication，WGD）或片段復制基因對的染色體定位共線性圖，并利用Ks_KaCalculator（http：//www.bork.emblde/pal2nal/#Download）計算共線性基因對的非同義突變率（Ka，non-synony-moussubstitutions）和同義突變率（Ks，synonymoussubstitutions），參考Zhang等方法估算分化時間 t= （Ks/2r）×10^-7 （百萬年前），中性突變率 _r=8.12× 10^-9 ，其中 Ka/Ks=1 表示中性選擇， 表示正向選擇， Ka/Kslt;1 表示純化選擇[21]。

1.3象草PHR家族基因的轉錄組分析

下載前期轉錄組原始數據，NCBI中SequenceReadArchive（SRA）數據庫登錄號PRJNA854591[19]。以Zhang等研究中象草基因組序列為參考，在Figshare數據庫中（https：//figshare. com/articles/dataset/elepant_grass_genome_fasta/15058173）下載組裝的基因組和基因組注釋信息[21]。利用hisat2軟件，將轉錄組fasta序列比對到參考基因組，并利用FeaturesCounts軟件計算基因的表達量，最后運用DESeq2軟件基于樣本的原始Reads數計算基因的表達量，并將差異倍數 gt;2 ，校正后的 Plt;0.05 的基因判定為顯著差異表達基因（Differentiallyexpressedgenes，DEGs）。此外，我們還下載了象草成熟期（生長120d）的根系、不同位置莖和葉片的轉錄組數據，同樣以象草（登錄號CIAT6263）的基因組為參考，分析了兩個關鍵基因PpPHR8和PpPHR13的組織表達模式。

1.4象草RNA的提取與實時熒光定量PCR （qRT-PCR）分析

分別取保存于一 80^°C 的象草根系和葉片樣品約0.1g ，用液氮研磨成粉末后，加入 1mL TRIzol UniversalRNA提取試劑（Tiangen，中國）提取總RNA。隨后，用HiScriptII1stStrandcDNASynthesisKitC +gDNA wiper）（Vazyme，中國）逆轉錄出cDNA，并將cDNA保存于一 20^°C 備用。使用QuantStiduoTMReal-timePCR（Thermofisher，美國）儀器和SYBRqPCRMasterMix（Vazyme，中國）定量試劑盒進行反應。反應體系為 0μL2×i SYBRqPCRMastermix 0.8μL 引物 （10μmol?L^-1） 、 2μL 稀釋10倍的cDNA模板， 6.4μL 至 20μL 。反應條件為 95^°C30s，94^°C10s，60^°C30s，72^°C30s，40 次循環。定量引物見表1，用 2^-ΔΔCT 法計算基因表達量，其中基因的相對表達量 = 目的基因表達量/內參基因 （PpACTI） 表達量。

1.5PpPHR8和 PpPHR13 基因的全長克隆和蛋白亞細胞定位分析

參考Zhang等人測序象草基因組[21]，獲得P/PHRδ 和 P/PHR13 基因的全長序列，利用Oligo7軟件設計全長度克隆引物（表1）。以上述提取的cDNA為模板進行PCR擴增，PCR反應體系為：4μL cDNA模板， 1.6μL 引物 （10μmol?L^-1） ，Phanta MaxMaster Mix 10μL（Vazyme ，中國），補充dd H₂O 至 20μL 。PCR反應程序為： 95^°C5min，95^°C 15s，58^°C15s，72^°C1.5min，72^°C5min，35 次循環。

設計同源克隆引物（表1），以擴增好的基因全長片段為模板進行PCR擴增，利用一步克隆ClonExpressUltra One Step Cloning試劑盒（Vazyme，中國）連接雙元載體 ?CXSN-GFP ，通過熱激法轉化大腸桿菌 DH5α ，將菌液涂布到LB固體培養基上，37^°C 恒溫培養箱培養 12h 后，挑取單克隆進行PCR鑒定陽性克隆，并送公司測序鑒定陽性克隆，再擴增并提取質粒，參考說明書轉化根癌農桿菌GV3101感受態細胞（上海唯地生物技術有限公司，中國）。隨后，進行煙草葉片瞬時表達的亞細胞定位分析，大致流程是將農桿菌陽性單克隆接種到含有卡那霉素和利福平抗生素的LB培養基中進行擴繁增殖，當菌液 OD₆₀₀=2，5000r?min^-1 離心 5min 收集菌體并重懸后，將 和 分別與mCherry-Nucleus侵染液等體積混合，用不加針頭的注射器將侵染液注射至 6～8 周大小的本氏煙草葉片，進行瞬時表達，注射后 48～72h ，利用激光共聚焦顯微鏡NikonC2（Nikon，日本）進行熒光觀察并拍照，綠色熒光蛋白激發波長為 488nm ，mCherry紅色熒光蛋白激發波長為 587nm 。

1. 6 數據統計分析

本研究相關數據采用MicrosoftExcel2013（MicrosoftCompany，美國）進行整理和可視化作圖，數據結果以平均值和標準誤（SE）表示，利用SPSS2O.0軟件（IBM-SPSS，美國）對相同象草組織的不同磷源處理（高磷HP和低磷LP）下的指標進行獨立樣本T檢驗，分析其差異顯著性。

表1基因克隆 RT-qPCR 和亞細胞定位引物

Table1 Primers used for gene cloning，RT qPCR and subcellular localization analysis

2 結果與分析

2.1低磷脅迫對象草生長的影響

低磷脅迫下，象草植株生長矮小，葉片相對窄短（圖1A）。與高磷處理相比，低磷脅迫處理下象草的根系生物量顯著提高24. 58%（Plt;0.05 ；圖1B），而地上部生物量顯著降低51. 72%（Plt;0.05 圖1C），而總生物量顯著降低38. 70% 。此外，低磷脅迫下根系和地上部的全磷含量和全磷濃度均顯著降低 （Plt;0.05 ；圖1D-1G），而磷利用效率均顯著升高 （Plt;0.05 ；圖1H-1D。結果表明，低磷脅迫顯著抑制象草生長，降低象草生物量和植株體內磷含量，提高了對磷的利用效率。

2.2象草PHR家族成員的鑒定及理化性質分析

在象草基因組中，共鑒定到42個 P/pPHRs 基因，依據象草PHR家族成員在染色體以及Scaffold上的位置依次命名為 P/pPHRI 至 P/PHR42 ，這42個 P/pPHRs 基因不均勻地分布在10條染色體和一條Scaffold上（圖2）。其中，在這10條染色體上，分別分布著2個（染色體chrA2，chrB3）至7個（染色體chrA3）PpPHRs 基因（圖2）。這42個 P/pPHRs 基因預測長度介于 834～4577bp ；預測的氨基酸數介于133～1032 個；蛋白分子量介于 14.67～111.91 ；蛋白理論等電點介于 5.34～9.90 ，平均值為7.61，包括18個 （42.86%） 等電點小于7.00的酸性蛋白和24個 （57.14%） 等電點大于7.00的堿性蛋白；所有成員的總平均疏水指數（GRAVY）均為負數，表明42個PpPHRs蛋白均具有親水性（表2）。

2.3象草PHR家族基因的共線性分析

在象草42個PpPHRs基因中，無串聯復制基因對，但發現了32對起源于WGD或片段復制的基因對，這些共線性基因主要分布在除了chrA4，chrA6，chrB2和chrB6以外的其余10條染色體上，其中染色體chrA3上分布最多的WGD或片段復制基因（5個，包括 和PpPHR13（圖2）。此外，這32對共線性蛋白的相似性介于 42.86% （PpPHR16 vs. PpPHR4O;PpPHR36vs.PpPHR4O）與 98.67% （PpPHR33vs.PpPHR34）之間;平均非同義突變率（Ka）和同義突變率（Ks）分別為0.19和0.90;所有 P/pPHRs 基因對的Ka/Ks小于1，表明存在純化選擇，基因傾向于保持其原有功能，非同義突變受到抑制；有10對基因分化時間小于1O百萬年前（Million years ago，MYA），包括PpPHR1Ovs.PpPHR31（9.79MYA），PpPHR11vs.PpPHR12（1.23MYA），PpPHR11vs.PpPHR27（8.29MYA），PpPHR12vs.PpPHR27（7.O2MYA），PpPHR15vs.PpPHR35（5.14MYA），PpPHR16vs.PpPHR36（6.07MYA），PpPHR17 vs.PpPHR34（9.24MYA），PpPHR20vs. PpPHR38（6.54MYA），PpPHR22vs. PpPHR41（9.88MYA）和PpPHR33vs.PpPHR34（2.72MYA）（表3）。以上結果表明，象草 P/pPHRs 基因的擴張主要來自WGD或片段復制，且所有共線性基因受到純化選擇。

注：（A）生長表型；（B）根系干重；（C）地上部干重；（D）根系全磷濃度；（E）地上部全磷濃度；（F）根系全磷含量；（G）地上部全磷含量;（H）根系磷利用效率；（I）地上部磷利用效率。高磷：添加 600μmol?L^{-1 1}KH₂PO₄ 處理，低磷：添加 5μmol?L^{-1 -1}KH₂PO₄ 處理。數據為平均值士標準誤，每個處理包括三個生物學重復。星號，表示不同供磷水平之間差異顯著，其中 ^?*，Plt;0.05;^**，0.001***，Plt;0.001; ns，差異不顯著。獨立樣本T檢驗，下同

Note：（A）Growthphenotype;（B）otsdrweigt;（C）shotsdryweight;（D）totalPoncentratiosofrot;（E）totalcocentratiost;（F）totalPsotalsfso;ulin）ls.otindicated 250μmol?L^-1KH₂PO₄ added treatment，low phosphate indicated 5μmol?L^-1KH₂PO₄ added treatment. The data are displayed as mean andstandardoE）achtretosstedftlocalatesstesettireogditament，thereinto * Plt;0.05 ^** 0.001

2.4低磷脅迫下象草PHR基因的轉錄組表達分析

依據課題組前期的轉錄組數據，分析了42個P/pPHRs 基因的相對表達量。依據基因在不同供磷水平的象草葉片和根系中的相對表達水平，我們將基因分為了四組，其中I組17個PpPHRs基因在高磷和低磷處理的葉片和根系中相對表達水平較低；I組16個 P/PHRs 基因在高磷和低磷處理的葉片和根系中相對表達水平較高；II組4個 PρPHRs 基因在高磷和低磷處理的葉片中相對表達水平較高，而在高磷和低磷處理的根系中相對表達水平較低；IV組5個 P/pPHRs 基因僅在低磷處理的葉片中相對表達水平較高，而在高磷處理的葉片和根系以及低磷處理的根系中相對表達水平較低（圖3）。在低磷脅迫下，有11個 P/pPHRs 基因僅在葉片中顯著上調表達，有4個 P/PHRs 基因同時在葉片和根系中顯著上調表達，包括 P/PPHRδ ，PpPHR13，PpPHR17和 P/PHR=ρ ，且 P/PHRδ 和 P/PHR13 分別屬于II組（基因在所有供磷水平和組織中相對表達量較高）和I組（基因在所有供磷水平的葉片中相對表達量較高）（圖3）。因此，后續篩選PpPHR8和P/PHR=I3 作為響應低磷脅迫的關鍵候選基因進行進一步分析。

圖2象草PHR家族成員共線性分析

Fig.2Synteny analysisof PHR familymembers in elephantgrass

注：圖中黑色曲線表示共線性基因對；外圍灰色環形帶表示14條染色體及1條Scaffold

Note：Theblackcuresintediagamconectcolinargenepairs，theutergayiularandsrepresent14cromosomesandofold

2.5象草 PpPHRδ 和 PpPHR13 基因的組織表達和qRT-PCR分析

依據前期轉錄組，我們篩選了本底表達量相對較高，且在低磷處理的象草葉片和根系中同時上調表達的關鍵基因 P?PHRS 和 P/PHR13 ，對其進行進一步分析。比較 P/PHRS 和 P/PHR13 基因在象草根系、不同位置的葉片和不同生長時期的莖中相對表達量，發現 P/PHRδ 和 P?PHR13 分別在根系和莖中相對表達量較高，表明PpPHR8和PpPHR13可能分別主要在根系和莖中發揮功能（圖4）。此外，利用qRT-PCR檢測了PpPHR8和PpPHR13基因在低磷不同處理時間的象草根系和葉片中的表達模式，發現PpPHR8在低磷處理5d的葉片和低磷處理10d、20d的根系中顯著上調表達，同時在低磷處理15d的葉片和根系中顯著上調表達且上調最高； P/PHR13 在低磷處理5d的葉片中顯著上調，同時在低磷處理15d和20d的葉片和根系中顯著上調且在低磷處理15d時上調最高（圖5）。

2.6象草PpPHR8和 PpPHRI3 的基因結構和啟動子磷響應順式作用元件分析

PpPHR8基因編碼序列（Codingsequence，CDS）包含942bp的核苷酸，含有6個內含子和7個外顯子；該基因編碼的蛋白含有兩個結構域，即Myb_DNAbindingdomain（靠近氮端的第23＼～74位氨基酸）和Myb_CC_LHEQLEdomain（第118＼～165位氨基酸）（圖6A）。PpPHR13基因CDS包含828bp的核苷酸，含有6個內含子和6個外顯子；該蛋白同樣包含兩個結構域，即Myb_DNAbindingdomain（靠近氮端的第 19～70 位氨基酸）和Myb_CC_LHEQLEdomain（第115～162位氨基酸）（圖6B）。此外，截取了 和 P/PHR13 基因CDS的上游200Obp作為基因的啟動子序列，在PpPHR8啟動子序列分別預測到了5，1和2個磷響應順式作用元件P1BS，CACGTG-motif和PHOelement，在PpPHR13基因啟動子序列預測到2個磷響應順式作用元件P1BS（表4），結果表明PpPHR8和

PpPHR13基因均具有磷響應功能。

2.7象草PpPHR8和PpPHR13基因序列的克隆

依據象草 P/PHRδ 和 P/PHR13 基因CDS序列設計全長克隆引物（表1），以象草cDNA為模板進行PCR擴增，獲得PpPHR8和PpPHR13基因全長片段。DNA凝膠電泳分析發現，兩個基因的PCR產物片段均在 750～1000bp 之間（圖7A），經過測序后發現，PpPHR8和PpPHR13基因的CDS全長分別為942bp和 828bp 。隨后，以象草的PpPHR8和PpPHR13蛋白序列與11個雙子葉植物和2個單子葉植物的PHR蛋白作進化樹，結果顯示雙子葉植物和單子葉植物的PHR蛋白分為兩組，象草的PpPHR8和PpPHR13與水稻OsPHR3、玉米ZmPHR1-Like3最近緣，它們可能具有相似的生物學功能（圖7B）。

圖3象草 PpPHRs 基因響應低磷脅迫的表達模式分析

Fig.3Expression pattern ol P/PHRs genesin elephantgrassunderlowphosphorus stress

注：HPL-1/2/3，高磷（ 600μmol?L^-1 KH₂PO₄） 處理下三個生物學重復的葉片樣品；LPL-1/2/3，低磷（ 5μmol?L^-1 KH₂PO₄） 處理下的三個生物 學重復的葉片樣品;HPR-1/2/3，高磷處理下三個生物學重復的根系樣品;LPR-1/2/3：低磷處理下三個生物學重復的根系樣品

Note：HPL-1/2/3，Leaves under HP （600μmol?L^-1KH₂PO₄） treatment with three biological replicates;LPL-1/2/3，Leaves underLP 5μmol?L^-1 （20 KH₂PO₄） treatmentwiththreebiologicalreplicates；HPR-1/2/3，RotsunderHPtreatmentwiththreebiologicalreplicates；LPR-1/2/，oots underLP treatmentwith three biological replicates

圖4象草 PpPHRδ 和 PpPHRI3 基因在不同組織中的相對表達水平

Fig.4Relative expression of PpPHR8 and PpPHR13 in different tissues of elephant grass

注：R表示生長120天象草苗的根系；L1/L2分別表示生長120天象草苗的幼嫩葉片和成熟葉片;S1/S2/S3/S4/S5分別表示生長120天象草苗從根到尖端數的莖的第1/3/5/7/9個節;H表示葉片的尖端;M表示葉片的中部；T表示葉片的基部；不同顏色表示同一基因在不同組織中TPM的Z評分標準化值

Note：Rrepresentste2Odaysoldofelephantgrassrots;L/L2representstedaysoldofelephantgrassyoungandmatureleavsespec tively;S1/2//S/Srepresestedasodoflepantgrassteadtest3d/tththodefroottoetispctivel; Hrepresentsthetipofleaves；Mrepresentsthemiddleofleaves；TrepresentsthebaseoflavesDiferentcolorsrepresentthestandaized z 1 score valves of TPM（transcripts per million） for same gene in different tissues

圖5象草PpPHR8和 PpPHRI3 基因響應低磷脅迫的相對表達水平。（A）在葉片中的相對表達；（B）在根系中的相對表達

Fig.5Relative expression levels of P/PHRS and P/PHR13 genes in response to P deficiency in elephant grass.（A）Relativeexpression levels in leaves;（B） Relative expression levels in roots

注：HP，添加 600μmol?L^-1KH₂PO₄ 處理;LP，添加 5μmol?L^-1KH₂PO₄ 處理。R，根系樣品;L，葉片樣品。 5d，10d，15d，20 d分別表示象草分別處理培養5，10，15和20天。HPL，高磷處理下的葉片;LPL，低磷處理下的葉片;HPR，高磷處理下的根系;LPR，低磷處理下的根系。數據為平均值 ± 標準誤，每個處理包括三個生物學重復。柱狀圖表示基因的相對表達量，圓圈表示 Log₂ （差異倍數）

Note：HP indicated 600μmol?L^-1KH₂PO₄ added treatment，LP indicated 5μmol?L^-1KH₂PO₄ added treatment.R，Root samples，L，Leafsamples. 5 d， 10d ， 15d ，and indicate the elephant grass being cultivated and treated for5，1o，15，and 2Odays respectively.HPL，LeavesunderHPtreatment;LPL，LeavesunderLPtreatment；HPR，RotsunderHPtreatment;LPR，RootsunderLPreatmentThedataaredisplayedasmeaandtadardror（SE）achtreatmentcosistedofteeiologicareplicatesTebarhartsowedtheelativeexpionofgenes，and the circle showed Log₂ （Fold change）

2.8象草PpPHR8和PpPHR13蛋白亞細胞定位分析

在煙草葉片中瞬時表達PpPHR8和PpPHR13蛋白，分析這兩個蛋白的亞細胞定位情況（圖8）。空載體對照（35S：GFP）的熒光信號在整個細胞中均可觀察到，包括細胞核、細胞質和細胞質膜等，而PpPHR8蛋白（35S：PpPHR8-GFP）和PpPHR13蛋白（35S：PpPHR13-GFP）的熒光信號定位在細胞核中，表明PpPHR8和PpPHR13均可能在細胞核中發揮轉錄因子的功能。

3討論

3.1低磷脅迫下象草的生長受到抑制

象草主要在我國南方多個省份栽培，這些地區的土壤主要偏酸性，速效磷含量偏低，屬于典型的缺磷土壤類型。在低磷環境中，植物生長緩慢、植株矮小瘦弱，并且生育期延遲，嚴重抑制作物產量。一致地，在本研究中，低磷脅迫下，象草表現為株形矮小瘦弱、基部葉片大量衰老（圖1A），并且地上部生物量顯著降低（圖1C），植株的全磷濃度和全磷含量也顯著降低（圖1D-1G）。相反，與正常供磷相比較，低磷環境下的象草根系生物量顯著升高（圖1B），植株磷利用率顯著提高（圖1H，1I，這與課題組前期研究結果一致[19]。大量研究證實，在低磷脅迫下，植物會通過調整根系結構以加強磷的獲取，通常表現為分配大量的碳水化合物給根系，促進根系的生長，改變側根、根毛和排根等的數量和長度，增強根系表面積等[22]，這在多個物種中均有報道，包括柱花草（Stylosanthes guianensias）[23]、白羽扇豆（Lupinusalbus）[24]和假地豆（Desmodiumheterophyllum）[25]等。同樣，在不同基因型玉米中，發現磷高效基因型玉米比磷低效基因型玉米具有更發達的根系[26]。因此，磷素的缺乏導致象草磷含量不足，嚴重抑制其生長，降低其生物量，其會通過促進根系的生長，以緩解和適應低磷脅迫。

3.2象草 PpPHRs 的鑒定及可能參與調控低磷脅迫適應過程

在低磷脅迫環境中，植物進化出了一系列的生理、生化和表型策略，以增強磷的吸收和利用緩解低磷脅迫，包括改變根系形態和構型、分泌酸性磷酸酶（有機酸、核糖核酸酶和質子等）提高磷轉運基因（PHT1和PHO1的表達以及與菌根真菌互惠共生等[22.27]。在這些響應低磷脅迫的生理生化策略的磷信號轉導和功能基因中，磷饑餓響應轉錄因子PHR起著核心調控作用[9]。隨著大量植物基因組測序的完成，多種植物的PHR家族基因在全基因組范圍內被鑒定，包括擬南芥、水稻、玉米和大豆，其中大豆數目最多為35個[8]。在本研究中，象草基因組中共鑒定到42個 PHRs 基因，其數目相對較多（圖2）。象草PHR家族基因成員較多，可能與其基因組較大（異源四倍體，大小約2.0Gb）和耐逆境脅迫（耐貧瘠土壤、耐熱和抗干旱）的環境進化適應密切相關[21.28]。此外，我們對象草PHRs的共線性分析發現，其成員內部無串聯復制，有32對基因存在WGD或片段復制（圖2），其中10對基因屬近期分化（小于10MYA），所有共線性基因均受到純化選擇（表3）。象草基因組復制研究表明象草主要發生了三次全基因組多倍化事件，包括約100MYA的象草祖先二倍化，約5OMYA的禾本科植物共有的WGD以及較近期約15MYA的象草特有四倍化事件，推測象草PHRs基因的擴張可能主要來自以上多倍化[21.29]。前期，PHR家族基因被報道參與多種生物過程，包括影響植物免疫相關基因30、調控植物體內硫酸鹽和氮素的穩態[31]和調節與叢枝菌根真菌的共生11等，但以上過程與磷饑餓響應均有一定的直接或間接相關性[32]。研究發現，擬南芥的AtPHR1（以及其同源基因AtPHL1/2/3/4）、水稻的OsPHR1/2/3和大豆的GmPHR14/32等均受到低磷誘導顯著上調表達，且其生物學功能已經被證實參與低磷脅迫的適應[8.18]。在本研究中，我們發現有15個 P/pPHRs 基因在低磷脅迫的象草根系和葉片中顯著上調表達（圖4），這些基因具有潛在參與調控象草適應低磷脅迫的生物功能，但需進一步深人解析。以上結果顯示，象草 P/pPHRs 基因的擴張主要來自WGD或片段復制，且所有共線性基因受到純化選擇，鑒定到的15個受低磷誘導顯著上調P/pPHRs 可能在調控象草適應低磷脅迫過程中發揮著重要作用。

3.3象草 和 PpPHRI3 可能在低磷適應中發揮作用

在低磷脅迫的轉錄組中，42個 P/pPHRs 基因在象草葉片和根系中的相對表達量分為四組，其中我們篩選了分別屬于ⅡI組（相對表達量較高）和II（葉片中相對表達量較高）且同時在低磷葉片和根系中顯著上調的PpPHR8和 P/PHR13 為關鍵候選基因（圖3）。隨后，組織表達模式發現PpPHR8和PpPHR13分別在根系和莖中的相對表達量較高（圖4）。此外，不同低磷脅迫處理時間的表達模式顯示， P/PHRδ 和 P?PHR13 在處理15d的葉片和根系中相對表達量和上調倍數最高，但 P/PHR13 在低磷根系中的相對表達量遠遠低于PpPHR8（圖5）。以上結果顯示，PpPHR8和 P/PHR13 可能參與象草磷穩態的調控。低磷脅迫下，植物會通過加強根系磷轉運蛋白PHT1的表達以促進磷的吸收，同時提高磷轉運蛋白PHO1的活性以加強磷素由根系到莖的轉運，這可能是由不同的PHR成員參與調控[18]。磷饑餓響應轉錄因子PHR屬于MYB-CC型轉錄因子，其特征是含有一個保守的MYBDNA結合域和一個卷曲螺旋結構域[33]，與此一致的是PpPHR8和PpPHR13蛋白在N端均存在這兩個結構域（圖6）。共線性分析顯示PpPHR8和PpPHR13可能是由WGD或片段復制產生的一對旁系同源基因，預測其在78.47MYA發生分化（圖2；表3）;基因結構顯示PpPHR8和PpPHR13基因分別含有7個和6個外顯子（圖6），推測PpPHR13的第6個外顯子相對于PpPHR8可能發生了外顯子融合或者內含子刪除事件。研究表明，內含子-外顯子結構分化在重復基因分化中具有普遍性和重要性，其主要機制主要包括三類（即插人/缺失、外顯子化/假外顯子化和外顯子/內含子獲得/丟失）[34]。前期研究顯示，CACGTG-motif，TATAboxlike，TCelement，NIT2-like，PHOelement和PiBS是參與磷饑餓響應的順式作用元件，其中P1BS是PHR轉錄因子的綁定位點[20]。在本研究中，PpPHR8和PpPHR13的啟動子序列分別含有5個和2個P1BS元件，且PHR8啟動子序列還含有1個CACGTG-motif和2個PHOelement（表4），這與兩個基因受低磷誘導差異表達的結果一致。蛋白進化樹分析表明，象草的PpPHR8/13與水稻的OsPHR3和玉米的ZmPHR1-like3最近緣（圖7），他們可能具有相似的功能。前期研究顯示，水稻OsPHR3在轉錄水平受低磷脅迫誘導，不僅直接參與調控低磷環境中的植物氮磷利用，還參與調控AM的共生[11.35]。此外，煙草亞細胞定位分析顯示，PpPHR8和PpPHR13蛋白均定位于細胞核（圖8），這與轉錄因子的功能定位特征完全一致。綜上所述，象草PpPHR8和PpPHR13可能發揮轉錄因子的功能，在象草中參與調控象草的磷饑餓響應，但其具體分子機制有待進一步研究。

圖8PpPHR8和PpPHR13蛋白亞細胞定位分析

Fig.8Subcelluar location of PpPHR8 and PpPHRl3 protein

注：35S：GFP，GFP空載對照；GFP，綠色熒光蛋白信號;mCherryNucleus，細胞核定位的mCherry（紅色）熒光信號；DIC，明場細胞 圖；Merge，融合GFP，Mecherry-Nucleus和DIC的圖

Note：35S：GFP，GFPemptyvector；GFP，signal ofGFP fusion protein；mCherry-Nucleus，signal ofmCherry（red）fusion nuclear localization sequenceprotein；DIC，bright-field images；Merge，the merged images

4結論

低磷脅迫下，象草生物量和全磷含量顯著降低，象草生長受到抑制。隨后，在象草基因組中共鑒定到42個 P/pPHRs 基因，生物信息學分析表明象草PpPHRs基因的擴張來自WGD或片段復制，其中旁系同源基因在進化中受到純化選擇。象草低磷脅迫的轉錄組分析，發現15個 P/pPHRs 受低磷誘導顯著上調表達。隨后，篩選了兩個關鍵候選基因P/PIIRδ 和 P?PHR13 ，對其進行了表達模式分析、基因和啟動子序列結構分析、基因序列克隆和蛋白亞細胞定位分析，表明PpPHR8和PpPHR13可能在細胞核中參與調控象草響應低磷脅迫。本研究為深入解析 P/pPHRs 參與象草適應低磷脅迫的生物學功能提供理論參考。

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（責任編輯劉婷婷）