抗菌肽MaSAMP的生信分析、基因克隆及遺傳轉化

摘" 要：來源于澳指檬（Microcitrus australasica）的一種抗菌肽（stable antimicrobial peptide， SAMP），不僅可以降低已感染柑橘黃龍病的病樹體內的黃龍病菌（Candidatus Liberibacter asiaticus，CLas）濃度、減輕病樹癥狀，而且還可以誘導未感染黃龍病的健康樹先天免疫、阻止感染黃龍病。本研究對MaSAMP的功能結構、亞細胞定位、系統發育等進行分析，結果表明，MaSAMP的開放閱讀框（open reading frame， ORF）全長為201 bp，編碼67個氨基酸，編碼的蛋白分子量為7.59959 kDa，理論等電點為5.38，不穩定指數[instability index （II）]為33.22，脂肪族氨基酸系數（aliphatic index）為87.16%，平均親水系數（grand average of hydropathicity）為–0.091，屬于親水性蛋白，含有1個Dabb結構域，MaSAMP蛋白結構以α-螺旋、無規則卷曲為主。MaSAMP與甜橙脅迫響應A/B桶狀結構域蛋白CISIN_1g033887mg、克里曼丁橘A/B桶狀結構域蛋白HS1親緣關系較近，蛋白相似度分別為97.01%、91.04%。亞細胞定位結果顯示，MaSAMP定位于葉綠體。進一步通過同源重組成功構建了融合EGFP熒光標簽的pCAMBIA1300-35S：：MaSAMP-EGFP過表達載體，并借助農桿菌介導的原位轉化技術獲得柑橘轉基因植株。本研究為后續MaSAMP的生物學功能研究提供材料基礎。

關鍵詞：抗菌肽；澳指檬；生物信息學分析；載體構建；轉基因中圖分類號：S666 """""文獻標志碼：A

Bioinformatics Analysis， Gene Cloning and Genetic Transformation of Antimicrobial Peptide MaSAMP

LIAO Mingjing^1，2， LI Xiangyang^2*， LYU Yuanda^2，3， JIANG Bo^2，3， LI Juan^1**， ZHONG Yun^2，3**， WANG Ting^2，3， ZHENG Lanyan^2，3

1. College of Horticulture and Landscape Architecture， Zhongkai University of Agriculture and Engineering， Guangzhou， Guangdong 510225， China; 2. Institute of Fruit Tree Research， Guangdong Academy of Agricultural Sciences， Guangzhou， Guangdong 510640， China; 3. Key Laboratory of South Subtropical Fruit Biology and Genetic Resource Utilization， Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Guangdong Provincial Key Laboratory of Science and Technology Research on Fruit Trees， Guangzhou， Guangdong 510640， China

Abstract： An antimicrobial peptide （SAMP） derived from Microcitrus australasica can not only reduce the concentration of Candidatus Liberibacter asiaticus （CLas） in the infected trees and reduce the symptoms of the diseased trees， but also induce innate immunity and prevent the infection of Huanglongbing in healthy trees that are not infected with Huanglongbing. MaSAMP was analyzed by functional structure， subcellular localization and phylogeny. The results showed that the open reading frame （ORF） of MaSAMP was 201 bp in length， encoding 67 amino acids. The molecular weight of the corresponding protein was 7.59959 kDa， the theoretical isoelectric point was 5.38， and the instability index （Instability index （II）） was 33.22. The aliphatic index was 87.16%， and the grand average of hydropathicity was -0.09， indicating that the protein was a hydrophilic one. The protein contained one Dabb domain and was predominantly structured by α-helices and random coils. In terms of evolution， MaSAMP was phylogenetically close to the stress-response A/B barrel domain-containing protein CISIN_1g033887mg from Citrus sinensis and the A/B barrel domain protein HS1 from Citrus×clementina， with protein similarity of 97.01% and 91.04%， respectively. Subcellular localization results indicated that MaSAMP was localized in chloroplasts. Furthermore， through homologous recombination， a pCAMBIA1300-35S：：MaSAMP-EGFP overexpression vector fused with an EGFP fluorescent tag was successfully constructed， and transgenic citrus plants were obtained using agrobacterium-mediated in planta transformation technology. This study would provide a material basis for subsequent research on the biological functions of MaSAMP.

Keywords： antimicrobial peptides; Microcitrus australasica; bioinformatics analysis; vector construction; transgene

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.07.003

我國柑橘產量和栽培面積均居世界首位^[1]，柑橘產業在水果貿易、鄉村振興中發揮著重要的作用。我國有19個柑橘種植省（市），其中有11個省遭受柑橘黃龍病（Citrus Huanglongbing，HLB）的危害，損失巨大，僅廣東年損失達50億元^[2]。柑橘黃龍病是一種由寄生于韌皮部的革蘭氏陰性細菌（Candidatus Liberibacter asiaticus， CLas）引起的系統性病害，表現為葉片斑駁黃化，植株枯萎，果實小，結果率低，產量銳減，并具有傳播快的特征，故被稱為柑橘中的癌癥。該病害嚴重影響了我國柑橘產業的發展^[3-6]。近百年來的農業實踐和研究表明，盡管柑橘黃龍病可防可控，但不可根治^[7]，而其根本有效的解決途徑仍有賴于抗性育種。

澳指檬（Microcitrus australasica）是一種原產于澳大利亞的澳指檬屬的柑橘資源，最近因其對柑橘黃龍病有極高的耐受性而受到廣泛關注^[8-11]。有研究者對澳指檬及其雜交種進行不同組合的嫁接接毒實驗，經過2 a的接毒評價，發現嫁接后，在砧木發病的情況下，澳指檬及后代葉片中均未檢測到黃龍病菌^[8]。通過體細胞融合技術，將OLL8甜橙或Page橘子愈傷組織來源的原生質體與澳指檬葉肉分離的原生質體進行細胞融合，培育的細胞融合植株在黃龍病的環境中生長6"a仍保持黃龍病陰性^[9]。

抗菌肽可替代抗生素，靶向細胞膜或特定的細胞內成分，通過多種特殊機制抑制多種微生物，是作為前瞻性抗真菌和抗細菌療法的新興候選藥物^[12]，并且其產生耐藥性的可能很小^[13]。植物中具有許多獨特的防御機制，抗菌肽是植物免疫系統最突出的部分，對病原體具有直接和持久的抗性，且抗菌肽是植物天然合成，對植物和哺乳動物細胞無毒害^[14]。抗菌肽在整個植物體內的表達可用于增強抗病性或作物改良。MOULIN等^[15]研究表明，富含胰蛋白酶抑制劑（10～14 kDa）的葉提取物通過抑制病原來源蛋白酶的酶活性，實現對辣椒黃花葉病毒（Pepper yellow mosaic virus，Pep YMV）的抗病毒活性。劉琦琦等^[16]發現轉入抗菌肽CecropinB能提高錦橙對柑橘潰瘍病的抗性。隨后有學者通過組學分析從澳指檬中鑒定出1種熱穩定蛋白MaSAMP，體外實驗表明該蛋白可有效降低黃龍病菌濃度及黃龍病陽性樹的發病癥狀，同時，噴施和注射后亦可激活植株的先天免疫系統，抑制黃龍病感染^[10]，但關于該功能蛋白對柑橘屬植株的具體生物學功能未見報道。本研究通過生物信息學分析進一步明確MaSAMP的生化功能及系統發育關系，同時借助農桿菌介導的原位轉化，構建柑橘過表達遺傳材料，為后續探究MaSAMP在黃龍病抗性中的生理功能及抗性育種等提供遺傳材料基礎。

1" 材料與方法

1.1" 材料

2023年12月于廣東省農業科學院果樹研究所以經評價具高黃龍病耐受性的澳指檬為材料，使用天根（TIANGEN）多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取澳指檬成熟葉片RNA，再通過TaKaRa反轉錄試劑盒合成cDNA。遺傳轉化所用柑橘種子由廣東省農業科學院果樹研究所提供。

1.2" 方法

1.2.1" MaSAMP基因克隆" 以澳指檬cDNA為模板，參考HUANG等^[10]的方法設計引物MaSAMP- F/R（表1），通過PCR擴增獲得MaSAMP基因。PCR反應體系為：無菌水20 μL、cDNA 2 μL、上/下游引物各1.5 μL、PrimeSTAR Max Premix（2×）25 μL。反應程序為：98"℃ 3 min；98"℃ 10 s，55"℃ 5 s，72"℃ 12 s；72"℃ 5 min。擴增后進行凝膠電泳檢測產物，使用美基（Magen）試劑盒回收目的條帶。利用全式金Blunt Simple Cloning Kit進行TA克隆，膠回收產物2 μL，無菌水2 μL，pEASY Blunt Simple Cloning Vector 1 μL，37"℃反應10 min，將連接產物轉入Trans1-T1 Phage Resistant感受態后再超凈工作臺上加入250 μL無抗LB液體到上述產物中，200 r/min、37"℃培養1 h。將菌液涂于50"μg/mL氨芐青霉素的平板上，37"℃倒置培養12 h。挑取單菌落進行菌液PCR，體系為Premix Taq 10 μL、M13F/R各1 μL、模板2 μL、無菌水6 μL，通過電泳檢測后挑選陽性菌液測序。

1.2.2 "MaSAMP基因生物信息學分析" 利用在線網站NCBI的Conserved Domain（https：//www. ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）在線工具查找目的基因的保守結構域。使用ExPASy（https：//web.expasy.org/protparam/）在線軟件中的ProtParam工具分析MaSAMP蛋白理化性質。使用SOPMA（http：//npsa-prabi.ibcp.fr）在線軟件預測其二級結構。使用SignalP-5.0（https：//services. healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/）在線軟件預測該蛋白的信號肽，使用TMHMM（http：//www. cbs.dtu.dk/services/TMHMM）在線軟件預測蛋白質跨膜序列。在NCBI數據庫中進行BLAST，選取一致性較高的序列通過DNAMAN 9.0軟件進行蛋白多重序列比對。使用MEGA 11軟件，采用最大簡約法構建系統發育樹。

1.2.3" 植物過表達載體的構建和遺傳轉化" 選擇SacⅠ、SalⅠ酶對pCAMBIA1300-EGFP質粒進行雙酶切，條件為金屬浴37"℃ 1.5"h。以測序驗證成功的pEASY-T1-MaSAMP質粒為模板進行目的片段擴增，體系為：無菌水21"μL、質粒DNA 1"μL、上/下游引物各1.5"μL、PrimeSTAR Max Premix（2×）25"μL，反應條件為：98"℃ 3"min；98"℃ 10"s，57"℃ 10 s，72"℃ 12 s；72"℃ 5"min。通過凝膠電泳回收目的片段。利用同源重組反應，將目的片段和酶切產物進行連接，通過熱激法將連接產物轉入DH5α大腸桿菌，均勻涂布在含卡那霉素的LB固體平板上，37"℃過夜培養。挑取單菌落后進行菌液PCR驗證，挑取陽性菌液測序。

于2024年8月選取飽滿完好的種子播種于塑料花盆，于26"℃種植室培養4～6周，取幼苗用于原位轉化，轉化方法參照謝幸男等^[17]的方法。待切口長出新芽后，通過LUYOR-3415激發光源進行檢測。

1.2.4 "亞細胞定位" 選擇培養60 d左右的柑橘實生苗嫩葉，參照酶解分離法^[18-19]對柑橘原生質體進行分離，運用PEG介導法^[19]將質粒pCAMBIA 1300-35S：：MaSAMP-EGFP轉化到柑橘原生質體中，培養12 h后于熒光顯微鏡下觀察熒光。

2" 結果與分析

2.1" MaSAMP蛋白理化性質及結構分析

通過ExPASy在線軟件中的ProtParam工具對MaSAMP蛋白理化性質分析，結果顯示，MaSAMP蛋白由67個氨基酸組成，其相對分子量為7.59959 kDa，理論等電點為5.38；其不穩定指數（instability index （II））為33.22，GASTEIGER等^[20]將不穩定指數小于40的蛋白預測為穩定，反之則可能是不穩定蛋白，表明MaSAMP為穩定蛋白；脂肪族氨基酸系數（aliphatic index）為87.16%，表明該蛋白脂肪族氨基酸含量高；平均親水系數（grand average of hydropathicity）為–0.091，說明該蛋白具有一定的親水性。使用ExPASy在線軟件中的ProtScale工具對其疏水性進行分析（圖1A）發現，第8、9位氨基酸均為最低分值-1.267，第54位氨基酸具有最高分值1.267，且整體分布偏于負值，故預測其具有親水性。

MaSAMP的二級結構預測（圖1B）顯示，該序列含有34.33% α-螺旋（alpha helix）、32.84%無規則卷曲（random coil）、25.37%延伸鏈（extended strand）、7.46% β-轉角（beta turn）。MaSAMP蛋白三級結構預測（圖1C）顯示，其QMQE值為0.67，QMQEN值為0.61±0.07，一致性為77.42%，該模型準確度較高，為α-螺旋、β-轉角、無規則卷曲和延伸鏈構成空間構象。

SignalP-5.0軟件預測結果顯示該蛋白不存在信號肽（圖1D），表明其不是分泌蛋白。TMHMM軟件進行蛋白質跨膜序列預測顯示該蛋白是非跨膜蛋白（圖1E）。

利用NCBI的CDD數據庫對MaSAMP蛋白保守結構域進行查找（圖1F），發現其具有1個Dabb（stress responsive A/B Barrel Domain）保守結構域，屬于ABM（antibiotic biosynthesis monooxygenase）超家族。

2.2nbsp; MaSAMP蛋白系統發育分析

蛋白序列比對（圖2）發現，MaSAMP與甜橙（Citrus sinensis）脅迫響應A/B桶狀結構域蛋白CISIN_1g033887mg（KDO72075.1）、克里曼丁橘（Citrus×clementina）A/B桶狀結構域蛋白HS1（XP_006419297.1）、甜橙脅迫響應A/B桶狀結構域蛋白HS1（KAH9683996.1）、酸橙（Citrus×changshan-huyou）WN943_028324（KAK9179 126.1）、苦楝（Melia azedarach）脅迫響應A/B桶狀結構域蛋白（KAJ4721944.1）、歐洲榿木（Alnus glutinosa）脅迫響應A/B桶狀結構域蛋白HS1（XP_062178246.1）、藜麥（Chenopodium quinoa）脅迫響應A/B桶狀結構域HS1樣蛋白（XP_021762050.1）相似度分別為97.01%、91.04%、89.55%、86.57%、85.07%、82.09%、82.09%。系統發育分析（圖3）表明多個品種的柑橘以及楝科、樺木科、莧科中均含有MaSAMP同源蛋白，該蛋白與甜橙脅迫響應A/B桶狀結構域蛋白CISIN_1g033887mg（KDO72075.1）的親緣關系最近。

2.3" MaSAMP基因克隆

以澳指檬葉片cDNA為模板進行PCR擴增，獲得一條201 bp的條帶（圖4）。通過菌液PCR、

測序驗證，測序結果顯示獲得一段長度為201 bp，編碼67個氨基酸的目的序列（圖5），表明基因克隆成功。

2.4" MaSAMP過表達載體構建及柑橘遺傳轉化材料的獲得

用Sal I和Sac I酶對pCAMBIA1300-EGFP進行雙酶切，獲得1條酶切后的線性條帶（圖6A）。目的基因與載體進行連接后轉入大腸桿菌DH5α，利用載體上的引物（1300-35S-F/1300-GFP-R）進行菌液PCR獲得1條402 bp的條帶（圖6B），再對菌液進行測序驗證，結果顯示載體中插入了1段長度為201 bp的序列，表明pCAMBIA1300- 35S：：MaSAMP-EGFP過表達載體構建成功。

利用農桿菌介導的原位轉化法，通過農桿菌EHA105，將構建成功的重組載體轉化至柑橘幼苗。農桿菌侵染后培養4～6周對新芽進行檢測。利用表達載體上攜帶的EGFP綠色熒光蛋白表達元件，在440～460 nm激發光源下篩選到轉化成功的植株（圖7）。

2.5" MaSAMP亞細胞定位分析

將融合綠色熒光蛋白（EGFP）的pCAMBIA 1300-35S：：MaSAMP-EGFP質粒導入柑橘原生質體進行亞細胞定位分析，利用熒光顯微鏡觀察。結果顯示，MaSAMP-EGFP在原生質體中成功表達，原生質體的葉綠體中檢測到了清晰的EGFP熒光信號（圖8），表明MaSAMP蛋白定位于葉綠體中。

3" 討論

HUANG等^[10]通過組學分析在澳指檬中獲得抗菌肽基因MaSAMP，并通過原核表達獲得MaSAMP。在對感染黃龍病柑橘的噴灑和注射實驗中，長達14個月的黃龍病菌濃度檢測結果表明，MaSAMP對黃龍病菌具有極好的滅殺能力。羅澍^[21]進一步克隆出Long-SAMP不同特異轉錄本類型，并對其氨基酸序列進行分析比較。Long-SAMP是一段含有109個氨基酸的長肽，而根據HUANG等^[10]的報道，抗菌肽的功能區段僅存在于Long-SAMP的后67個氨基酸中。因此，本研究從HUANG等的研究中獲取引物，克隆出MaSAMP基因，并對該序列進行分析。

本研究結果顯示，MaSAMP蛋白的相對分子量為7.59959 kDa，理論等電點為5.38，不穩定指數為33.22，根據GASTEIGER等^[20]的注釋判定MaSAMP為穩定蛋白。脂肪族氨基酸系數為87.16%，說明該蛋白屬于脂肪族氨基酸。平均親水系數為負數，表明該蛋白具一定的親水性，同時Kyte and Doolittle算法亦表明其具有親水性。該蛋白二級結構中有34.33%為α-螺旋結構，32.84%為無規則卷曲，25.37%為延伸鏈，7.46%為β-轉角，該蛋白三級結構與二級結構預測結果一致。天然抗菌肽長約10～100個氨基酸，且大多兩端均含有親水和疏水殘基，其α-螺旋、β-折疊等結構有重要功能特征^[22]。該蛋白不存在信號肽，說明該蛋白為非分泌蛋白，且與TMHMM軟件的預測結果一致，即為非跨膜蛋白。MaSAMP蛋白保守結構域為Dabb（stress responsive A/B barrel domain），GU等^[23]從胡楊（Populus euphratica）的熱休克蛋白（heatshock protein 90， Hsp90）和羥脯氨酸糖蛋白（hydroxyproline-rich glycoprotein， HRGP）中發現Dabb結構域，2個蛋白均參與了植物耐鹽脅迫反應。Dabb類蛋白被發現顯著抑制各種病原真菌的細胞生長，參與誘導植物對多種病原真菌的防御^[24-25]。MaSAMP含有Dabb結構域，推測該蛋白可能參與植物耐鹽脅迫反應和誘導植物對病原菌的防御過程。Blast發現，甜橙、克里曼丁橘、酸橙、苦楝、歐洲榿木、藜麥存在與MaSAMP相似度大于80%的序列，系統發育分析表明澳指檬MaSAMP與上述物種相似序列蛋白有一定親緣關系，與甜橙脅迫響應A/B桶狀結構域蛋白CISIN_1g033887mg的親緣關系更近。根據亞細胞定位結果，MaSAMP蛋白定位于葉綠體中。騰海艷^[26]研究發現水稻Ossp1基因定位于葉綠體，且其表達具有干旱響應性，推測其功能可能與葉綠體內相關代謝過程或植物的逆境響應有關。

參考文獻

[1]"""""" 鄧秀新. 中國柑橘育種60年回顧與展望[J]. 園藝學報， 2022， 49（10）： 2063-2074.DENG X X. A review and perspective for citrus breeding in China during the last six decades[J]. Acta Horticulturae Sinica， 2022， 49（10）： 2063-2074. （in Chinese）

[2]"""""" 杜美霞， 龐淑瑋， 董麗婷， 莫凱琴， 候夢圓， 王帥， 鄒修平. 柑橘黃龍病菌與寄主互作的分子機制研究進展[J]. 園藝學報， 2024， 51（7）： 1623-1638.DU M X， PANG S W， DONG L T， MO K Q， HOU M Y， WANG S， ZOU X P. Research progress on the molecular mechanisms of interactions between Candidatus Liberibacter and Citrus[J]. Acta Horticulturae Sinica， 2024， 51（7）： 1623-1638. （in Chinese）

[3]"""""" 程春振， 曾繼吾， 鐘云， 閆化學， 姜波， 鐘廣炎. 柑橘黃龍病研究進展[J]. 園藝學報， 2013， 40（9）： 1656-1668.CHENG C Z， ZENG J W， ZHONG Y， YAN H X， JIANG B， ZHONG G Y. Research progress on citrus Huanglongbing disease[J]. Acta Horticulturae Sinica， 2013， 40（9）： 1656-1668. （in Chinese）

[4]"""""" 范國成， 劉波， 吳如健， 李韜， 蔡子堅， 柯沖. 中國柑橘黃龍病研究30年[J]. 福建農業學報， 2009， 24（2）： 183-190.FAN G C， LIU B， WU R J， LI T， CAI Z J， KE C. Thirty years of research on citrus Huanglongbing in China[J]. Fujian Journal of Agricultural Sciences， 2009， 24（2）： 183-190. （in Chinese）

[5]"""""" 胡文召， 周常勇. 柑橘黃龍病病原研究進展[J]. 植物保護， 2010， 36（3）： 30-33.HU W Z， ZHOU C Y. Advances in the pathogen of citrus Huanglongbing[J]. Plant Protection， 2010， 36（3）： 30-33. （in Chinese）

[6]""""nbsp;" WANG N. The citrus Huanglongbing crisis and potential solutions[J]. Molecular Plant， 2019， 12（5）： 607-609.

[7]"""""" 周常勇. 對柑橘黃龍病防控對策的再思考[J]. 植物保護， 2018， 44（5）： 30-33.ZHOU C Y. Reconsideration on the control strategy of citrus Huanglongbing[J]. Plant Protection， 2018， 44（5）： 30-33. （in Chinese）

[8]"""""" ALVES M N， RAIOL-JUNIOR L L， GIRARDI E A， MIRANDA M， WULFF N A， CARVALHO E V， LOPES S A， FERRO J A， OLLITRAULT P， PENA L. Insight into resistance to 'Candidatus Liberibacter asiaticus'， associated with Huanglongbing， in Oceanian citrus genotypes[J]. Front Plant Science， 2022， 13： 1009350.

[9]"""""" DUTT M， MAHMOUD L M， CHAMUSCO K， STANTON D， CHASE C D， NIELSEN E， QUIRICO M， YU Q， GMITTER F J， GROSSER J W. Utilization of somatic fusion techniques for the development of HLB tolerant breeding resources employing the Australian finger lime （Citrus australasica）[J]. PLoS One， 2021， 16（8）： e0255842.

[10]""" HUANG C Y， ARAUJO K， SANCHEZ J N， KUND G， TRUMBLE J， ROPER C， GODFREY K E， JIN H. A stable antimicrobial peptide with dual functions of treating and preventing citrus Huanglongbing[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2021， 118（6）： e2019628118.

[11]""" KILLINY N， JONES S E， NEHELA Y， HIJAZ F， DUTT M， GMITTER F G， GROSSER J W. All roads lead to Rome： towards understanding different avenues of tolerance to Huanglongbing in citrus cultivars[J]. Plant Physiology and Biochemistry， 2018， 129： 1-10.

[12]""" ERDEM B M， KESMEN Z. Antimicrobial peptides （AMPs）： a promising class of antimicrobial compounds[J]. Journal of Applied Microbiology， 2022， 132（3）： 1573-1596.

[13]""" MAHLAPUU M， HAKANSSON J， RINGSTAD L， BJORN C. Antimicrobial peptides： an emerging category of therapeutic agents[J]. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology， 2016， 6： 194.

[14]""" VRIENS K， CAMMUE B P， THEVISSEN K. Antifungal plant defensins： mechanisms of action and production[J]. Molecules， 2014， 19（8）： 12280-12303.

[15]""" MOULIN M M， RODRIGUES R， RIBEIRO S F， GONCALVES L S， BENTO CS， SUDRE C P. Trypsin inhibitors from Capsicum baccatum var. pendulum leaves involved in Pepper yellow mosaic virus resistance[J]. Genetics and Molecular Research， 2014， 13（4）： 9229-9243.

[16]""" 劉琦琦， 鄒修平， 彭愛紅， 許蘭珍， 何永睿， 陳善春. 轉Cecropin B基因柑桔對潰瘍病的離體抗性評價[J]. 中國南方果樹， 2014， 43（2）： 1-4.LIU Q Q， ZOU X P， PENG A H， XU L Z， HE Y R， CHEN S C. In vitro evaluation of resistance to citrus canker by transgenic orange plants with antibacterial peptide gene Cecropin B[J]. South China Fruits， 2014， 43（2）： 1-4. （in Chinese）

[17]""" 謝幸男， 楊莉， 劉范， 田娜， 車婧如， 靳三鵬， 張永艷， 程春振. ‘伏令夏橙’原位轉化體系的建立及優化[J]. 園藝學報， 2020， 47（1）： 111-119.XIE X N， YANG L， LIU F， TIAN N， CHE J R， JIN S P， ZHANG Y Y， CHENG C Z. Establishment and optimization of Valencia sweet orange in planta transformation system[J]. Acta Horticulturae Sinica， 2020， 47（1）： 111-119. （in Chinese）

[18]""" 楊威. 柑橘原生質體瞬時轉化體系的建立及應用[D]. 武漢： 華中農業大學， 2016.YANG W. Establishment amp; application of citrus protoplast transient transformation system[D]. Wuhan： Huazhong Agricultural University， 2016. （in Chinese）

[19]""" 楊雯惠， 劉丹， 郭文武. PEG法介導的柑橘原生質體轉化[J]. Bio-101， 2018： e1010187.YANG W H， LIU D， GUO W W. PEG-mediated citrus protoplast transformation[J]. Bio-101， 2018： e1010187. （in Chinese）

[20]""" GASTEIGER E， HOOGLAND C， GATTIKER A， DUVAUD S， WILKINS M R， APPEL R D， BAIROCH A. Protein identification and analysis tools on the ExPASy server[M]//WALKER J M. The proteomics protocols handbook. Totowa： Humana Press， 2005： 571-607.

[21]""" 羅澍. 柑橘砧木‘蒲江香橙’對黃龍病病菌的生理生化響應[D]. 雅安： 四川農業大學， 2022.LUO S. Physiological and biochemical responses of citrus rootstock 'Pujiang Xiangcheng' to the huanglongbing pathogen CLas[D]. Ya’an： Sichuan Agricultural University， 2022. （in Chinese）

[22]""" 楊晨遠， 于子川， 秦迪， 高媛媛. 抗菌肽的結構分析、抗菌機制及改造應用的研究進展[J]. 微生物學報， 2024， 64（7）： 2242-2259.YANG C Y， YU Z C， QIN D， GAO Y Y. Research progress in structures， mechanisms， and modification of antimicrobial peptides[J]. Acta Microbiologica Sinica， 2024， 64（7）： 2242-2259. （in Chinese）

[23]""" GU R， FONSECA S， PUSKAS L G， HACKLER L， ZVARA A， DUDITS D， PAIS M.S. Transcript identification and profiling during salt stress and recovery of Populus euphratica[J]. Tree Physiology， 2004， 24（3）： 265-276.

[24]""" LEE J R， LEE S S， PARK S， KANG J S， KIM S Y， LEE K O， LEE S Y. Functional characterization of pathogen-responsive protein AtDabb1 with an antifungal activity from Arabidopsis thaliana[J]. Biochimica et Biophysica Acta （BBA）-Proteins and Proteomics， 2008， 1784（12）： 1918-1923.

[25]""" PARK S， LEE J R， SHIN S， PARK Y， LEE S Y， HAHM K. Characterization of a heat-stable protein with antimicrobial activity from Arabidopsis thaliana[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications， 2007， 362（3）： 562-567.

[26]""" 騰海艷. 水稻Ossp1基因的亞細胞定位及其干旱條件下的表達[J]. 江蘇農業學報， 2020， 36（3）： 529-534.TENG H Y. Subcellular localization and expression under drought conditions of rice Ossp1 gene[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences， 2020， 36（3）： 529-534. （in Chinese）