司美格魯肽在蛋氨酸膽堿缺乏飲食誘導的非酒精性脂肪性肝病大鼠肝臟脂質代謝中的研究

【摘要】背景司美格魯肽作為胰高血糖素樣肽1受體激動劑之一，對于緩解非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的進展有很大的潛力，但是作用機制尚未明確。目的研究司美格魯肽對肝臟脂質代謝的影響，進一步探究NAFLD的發病機制及幫助臨床做出診斷和治療。方法2022年9—11月選取30只SPF級5＼～8周齡雄性SD大鼠，體質量（ 180±20 ） ，大鼠適應性喂養1周后隨機分為空白組、模型組和干預組，每組10只。制備NAFLD大鼠模型，干預組大鼠給予司美格魯肽 ，溶解于 0.9% 氯化鈉溶液皮下注射，空白組和模型組大鼠皮下注射等量 0.9% 氯化鈉溶液。觀察大鼠一般情況，蘇木素－伊紅（HE）染色和油紅O染色觀察大鼠肝組織病變情況，檢測大鼠血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）水平，檢測大鼠肝組織三酰甘油（TG）水平。反轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測脂肪酸合成酶（FAS）、乙酰輔酶A羧化酶（ACC1）、肉毒堿棕櫚酰轉移酶 1α （ CPT1α ）、乙酰輔酶A氧化酶（AOX）、脂肪酸轉運蛋白36（FAT/CD36）、肝臟脂肪酸結合蛋白（LFABP）、載脂蛋白B（ApoB）、微粒體三酰甘油轉移蛋白（MTTP）mRNA表達量。蛋白質印跡試驗（Westerm blottng）檢測FAT/CD36蛋白含量。結果實驗期間各組動物均無死亡，空白組大鼠毛發柔順、有光澤、精神狀態良好，模型組和干預組大鼠隨喂養時間增長，表現為體質量明顯減輕，毛發紊亂、無光澤，活動減弱，精神萎靡。干預結束后模型組體質量低于空白組，干預組高于模型組（ Plt;0.05 ）。模型組肝臟質量高于空白組，干預組低于模型組（ Plt;0.05 ）。模型組ALT、AST、TG水平高于空白組，干預組ALT、AST、TG水平低于模型組（ Plt;0.05 ）。模型組CPT1 ∝ 、AOX、LFABP、ApoB、MTTP低于空白組，干預組FAT/CD36低于模型組（ Plt;0.05 ）。模型組FAT/CD36高于空白組，干預組低于模型組（ Plt;0.05 ）。結論司美格魯肽緩解了NAFLD大鼠肝臟的脂質沉積，這可能與FAT/CD36表達下調有關。

【關鍵詞】非酒精性脂肪性肝病；司美格魯肽；脂質代謝；脂肪酸轉運蛋白36

【中圖分類號】R575.5【文獻標識碼】A DOI：10.12114/j.issn.1007-9572.2023.0534

【Abstract】BackgroundSemaglutide，asone of the glucagon-like peptide-1（GLP-1）receptor agonists，hassignificantpotentialforallviatingtheprogressonofnon-alcoholicfatty liverdisease（NAFLD）.However，itsmechanismof actionremains unclear.ObjectiveTo investigatetheefectofsemaglutideonhepatic lipid metabolism，further explore the pathogenesisof NAFLDand helpclinical diagnosis andtreatment.MethodsBetween September and November 2022，30 SPFgrade male SD rats，aged 5-8 weeks with a body weight of （ 180±20 ） g ，were acclimatized for one week and then randomly divided into three groups ofcontrol，model，and intervention，with1Orats in each.TheNAFLDrat model was prepared， and the intervention group received semaglutide at 40μg/kg dissolved in 0.9% saline solution subcutaneously. The control and model groups received an equivalent volume of 0.9% saline subcutaneously. The general condition of the rats was observed，with hematoxylin-eosin（HE）stainingandOilRedOstaining to examineliver tisuelesions.Serumlevelsof alanineaminotransferase （ALT），aspartate aminotransferase（AST），and liver tisse triglyceride（TG）levels were measured.Real-time polymerase chain reaction（RT-PCR）was used todetectmRNA expresionoffatyacid synthase（FAS），acetyl-CoAcarboxylase1（ACC1）， carnitine palmitoyltransferase 1α （ CPT1α ），acyl-CoA oxidase（AOX），fatty acid transport protein 36（FAT/CD36）， liverfattyacid-binding protein（LFABP），apolipoprotein B（ApoB），and microsomal riglyceride transferprotein（MTTP）. Western bloting assaywas used to detectFAT/CD36 protein levels.ResultsThere was no death of animals in allgroups during the experimentalperiod，andtheratsinthecontrolgroupexhibitedsmoothand glossyfurwithgoodspirit，whiletheratsnthe modelgroupandintervention groupshowedasignificantreductionin body weight，disorganizedand lusterless hair，reduced activitynddepressedspiritwiththeincreaseinfeedingtime.Thebodyweightofthemodelgroupwaslowerthanthatofthecontrol group atthe end of the intervention，and the intervention group was higher than that of the model group （ Plt;0.05 ）. The liver weight of the model group was higher than the control group，and lower in the intervention group （ Plt;0.05 ） . The levels of ALT， AST，and TG werehigher thanthose inthe model group than inthecontrol group，andlowerin the intervention group（ Plt;0.05 ）. The levels of CPT1 α ，AOX，LFABP，ApoB，and MTTP were lower in the model group than in the control group，and the level of FAT/CD36 was lower in the intervention group（ Plt;0.05 ）.The model group had higher levels of FAT/CD36 than the control group，and the intervention group had lower levels than the model group （ Plt;0.05 ）.Conclusion Semaglutide alleviated hepatic lipid deposition in NAFLD rats，potentially related to the downregulation of FAT/CD36 expression.

【Key words】 Nonalcoholic fatty liver disease；Semaglutide；Lipid metabolism；Fatty acid translocase36

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholicfattyliverdisease，NAFLD）是指通過組織學或高質量影像學檢查確認的除外過量飲酒以及其他明確病因所導致的肝細胞發生 5% 以上的脂肪病變[1-3]。非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver，NAFL）是該病的早期階段[4]最新流行病學調查顯示全球有17億NAFLD患者［5]，并且以每年120萬的速度增長[6]。隨著生活水平提高和病毒性肝炎研究的不斷深入，NAFLD已取代病毒性肝炎成為臨床上最常見的慢性肝病[7]。研究發現全球約 40% 的NAFLD患者BMI并未達到肥胖標準，甚至有 19.2% 的患者BMI在參考范圍[8-9]。如果不積極進行及時的干預，將會導致脂肪型肝炎（NASH）、肝硬化，甚至肝細胞癌[10]。盡管NAFLD的發病機制研究、治療靶標的確定和藥物開發的推進取得了長足進展，但仍面臨著重大挑戰，自前尚無批準用于該疾病的藥物，這將給家庭以及醫療帶來巨大經濟損失，對人類健康構成嚴重威脅[1]

胰高血糖素樣肽1（glucagon-likepeptide1，GLP-1）是一種小腸L細胞由進食刺激分泌的小分子肽物質[12]，其可根據患者的血糖水平影響胰島 β 細胞分泌胰島素以及胰島 ∝ 細胞分泌胰高血糖素「13］，進而控制人體血糖水平的動態平衡，另外還可以降血脂[14]、改善胰島素抵抗、肝功能、肝臟氧化應激和炎癥損傷，通過調控其水平可使心血管獲益[15]。司美格魯肽是第二代GLP-1類似物，與GLP-1有 94% 的同源性， t_1/2 為7 d[16]，生物利用度為 89% 。研究表明，司美格魯肽治療可顯著改善患有NAFL的糖尿病患者的肝臟組織學和肝酶水平[17]，因此司美格魯肽具有治療NAFLD的潛力，然而司美格魯肽對非糖尿病患者肝臟脂質沉積的作用機制尚不清楚「18]。本研究通過飼喂蛋氨酸膽堿缺乏（methionine-choline-deficientdiet，MCD）飼料建立早期NAFLD大鼠的疾病模型，該模型符合臨床中非糖尿病且BMI正常的NAFLD患者群體，通過檢測空白組、模型組及干預組中脂質合成、 β 氧化、轉運以及脂肪酸攝取途中關鍵酶的含量變化水平，探討司美格魯肽能否緩解NAFLD的發生、發展以及其作用機制。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1 研究時間：2022年9—11月。1.1.2 實驗動物：30只SPF級5＼～8周齡雄性SD大鼠，體質量（ 180±20 ） g ，購自北京維通利華實驗動物公司（質量合格證編號：N0.110011220108748131）。在中心實驗室動物房喂養，環境溫度 20～22% ，相對室內濕度 50% ，飼養期間自由攝食、飲水。本研究獲得河北工程大學附屬醫院倫理委員會批準（編號：IACUC-Hebeu-2023-0008）。

1.1.3主要儀器設備：Sigma3-30KS離心機（北京五洲東方科技發展有限公司）、DYY-6C型電泳儀（北京六一生物科技有限公司）、SCILOGEX搖床（上海雅科生物科技有限公司）、高通量冷凍研磨儀（寧波新藝超聲設備有限公司Xinyi-24N）、實時熒光PCR儀器（賽默飛世爾科技公司）、 -80°C 冰箱（青島海爾公司）、iMark酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）顯影儀（cytiva）。1.1.4主要試劑：司美格魯肽注射液購自丹麥諾和諾德公司（批號：202202ASS1）； 0.9% 氯化鈉溶液購自石家莊四藥有限公司（生產批號：2207012002）；蛋白提取試劑盒（雅酶公司，批號：016C2020）高純總RNA快速提取試劑盒（北京百泰克生物技術有限公司，批號：B021007022）；逆轉錄試劑盒（賽默飛世爾科技有限公司（批號：91254516）；qPCRSuperMix試劑盒（北京全式金有限公司（批號：P41013）；丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）、三酰甘油（TG）含量檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所（批號：20221014、20221015、20221017）；脂肪酸轉運蛋白36（FAT/CD36）ab133922抗體（美國abcam有限公司，批號：1002656-13）。

1.2實驗方法

1.2.1NAFLD大鼠模型制備：大鼠適應性喂養1周后隨機分為空白組、模型組和干預組，每組10只。空白組給予普通飼料喂養，模型組和干預組給予MCD飼料喂養，時間為 30d 。

1.2.2干預方法：大鼠造模期間每3天稱重1次后進行干預，干預組大鼠給予司美格魯肽 40μg/kg ，溶解于0.9% 氯化鈉溶液皮下注射，空白組和模型組大鼠皮下注射等量 0.9% 氯化鈉溶液。

1.2.3標本取材：大鼠干預30d后禁食 6h ，二氧化碳麻醉機麻醉，抽取下腔靜脈血液，置于離心管沉淀 20min 后，以 4°C ， 3500r/min 離心 20min 分離血清，取上層液體，凍存用于檢測血清AST、ALT水平。肝臟拍照，觀察顏色、質地，將肝臟完整取下后稱重，留取部分肝組織固定液用于蘇木素-伊紅（HE）染色和油紅O染色，其余肝組織置于 -80°C 冰箱保存用于后續實驗步驟1.2.4組織切片染色：取固定好的肝組織，經過石蠟包埋切片、脫蠟、水化，放入蘇木素染液中 5min ，自來水沖洗后依次放入不同濃度梯度乙醇后脫水，伊紅染色后放入無水乙醇進行脫水封片，顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。油紅0染色時將冰凍切片恢復至室溫，固定 15min 后晾干置入油紅中靜置過夜、背景分化、蘇木素染色后在顯微鏡下觀察結果。1.2.5血清ALT、AST水平檢測：根據試劑盒繪制標準曲線，大鼠待測血清分別放入對照孔和測定孔，混勻孵育在酶標儀中讀取吸光度值，代入標準曲線中計算AST、ALT水平。

1.2.6肝組織TG水平檢測：準確稱取肝臟組織重量，按照重量（g）：體積 （mL）τ₌₁：9 的比例加入無水乙醇，冰水浴條件下機械勻漿， 2500r/min 離心 10min ，取上清液，根據說明書步驟操作加入蒸餾水、校準品、樣本液和樣本，孵育箱孵育后在 510nm 酶標儀中讀取吸光度值代人標準曲線，計算TG含量。

1.2.7反轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測脂肪酸合成酶（FAS）、乙酰輔酶A羧化酶（ACC1）、肉毒堿棕櫚酰轉移酶 1∝（CPT1α ）乙酰輔酶A氧化酶（AOX）脂肪酸轉運蛋白36（FAT/CD36）、肝臟脂肪酸結合蛋白（LFABP）、載脂蛋白B（ApoB）、微粒體三酰甘油轉移蛋白（MTTP）mRNA表達量：取各組肝組織加入1mL 裂解液冰浴勻漿，提取總RNA檢測濃度，引物序列見表1。逆轉錄條件和方法如下。在置于冰上的無菌無核酸的PCR管中按順序加入總 RNA 0.5μg ，oligo（ DT）18引物 1μL ，補充無核酸酶的高純水至 12μL 模板和引物的混合液輕輕混勻，短暫離心， 65^°C 孵育5min ，，冰上冷卻，離心，在置于冰上冷卻后加入 4μL5× Reaction Buffer、 1μL RNA 酶抑制劑、 2μL10mmol/L dNTPMix和逆轉錄酶 1μL ，使總體積為 20μL ，輕輕混勻，短暫離心， 42°C 孵育 60min ， 70^qC 加熱 5min 終止反應。RT-PCR擴增條件方法如下。加入SYBRGreen Master Mix 10μL ， dddH₂O₅μL， CDNA 4μL， Primer 1μL ， 95^°C 預變性 1min 、 95^°C 變性 5s 、 60^°C 退火延伸數據采集 15s 。共40個循環。采用 2^-ΔΔGt 法進行數據的相對定量分析。

1.2.8蛋白質印跡試驗（Westernblotting）檢測FAT/CD36蛋白含量：每組取4只大鼠肝組織，加入 200μL 變性裂解液，冷凍研磨機機械勻漿后蓋上純化柱蓋子室溫孵育 2min ，置于 4‰ ， 16000r/min ，離心 2min ，提取總蛋白，參照試劑盒說明書進行操作，酶標儀檢測蛋白質濃度，計算上樣體積。采用 7.5% 十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺分離膠對蛋白進行電泳，放入 20mL 脫脂奶粉中搖床封閉1h后TBST洗膜3次， 10min/ 次，加入FAT/CD36（ 1：1000 ）一抗 4^°C 冰箱 16h ；取出后TBST溶液洗膜3次， 10min/ 次，然后加入抗兔二抗（1：5000），室溫避光置于搖床孵育 ^1h ，在TBST溶液中洗膜5次， 5min/ 次，將膜放入添加超敏ECL試劑的避光盒子中孵育 3min 后在自動曝光機上顯影；Image J軟件對條帶進行灰度分析，采用 β 肌動蛋白為內參照（ β -actin），利用目的蛋白和內參照蛋白灰度值之比來反映目的蛋白的相對表達量。

1.3 統計學方法

采用SPSS26.0統計學軟件進行數據分析，符合正態分布的計量資料以（ ）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用 ΔISD-t 檢驗；非正態分布的計量資料以 M （ P₂₅ ， P₇₅ ）表示，多組間比較采用Kruskal-Wallis H 檢驗。以 Plt;0.05 為差異有統計學意義。

2結果

2.1大鼠一般狀況

實驗期間各組動物均無死亡，空白組大鼠毛發柔順、有光澤、精神狀態良好，模型組和干預組大鼠隨喂養時間增長，表現為體質量明顯減輕，毛發紊亂、無光澤，活動減弱，精神萎靡。干預結束后模型組體質量低于空白組，干預組高于模型組，差異有統計學意義（ Plt;0.05 ），見表2。

2.2大鼠肝臟形態及組織學改變結果

干預結束后空白組肝臟色澤紅潤，質地細膩，具有韌性；模型組肝臟發白，表面明顯沉積脂質顆粒，質地脆易出血；干預組的肝臟色澤和質地均明顯改善。大鼠肝臟形態表現見圖1。模型組肝臟質量高于空白組，干預組低于模型組，差異有統計學意義（ Plt;0.05 ），見表2。

油紅0染色結果顯示，空白組肝組織結構清晰，排列整齊，未發現脂質沉積；模型組可觀察到大量的紅染脂滴，部分融合成片；干預組中紅染脂滴數量較模型組降低。HE染色結果顯示，空白組肝細胞呈多邊形結構，細胞核位于中央，胞質分布均勻，未見脂滴沉積；模型組肝細胞腫脹，可見大小不一的脂滴空泡，細胞核位于邊緣，細胞邊界模糊不清；干預組的脂滴空泡較模型組減少。油紅O染色與HE染色結果見圖2＼～3。

2.3 大鼠血清ALT、AST、TG水平

3組大鼠血清ALT、AST水平比較，差異有統計學意義（ Plt;0.05 ），其中模型組ALT、AST水平高于空白組，干預組ALT、AST水平低于模型組，差異有統計學意義（ Plt;0.05 ），見表3。

2.4大鼠肝組織TG水平

3組大鼠肝組織TG水平比較，差異有統計學意義（ Plt;0.05 ），其中模型組高于空白組，干預組低于模型組，差異有統計學意義（ Plt;0.05 ），見表4。

2.5大鼠肝組織FAS、ACC1、CPT1 ∝ 、AOX、FAT/CD36、LFABP、ApoB、MTTPmRNA表達結果

3組大鼠肝組織FAS、ACC1、 CPT1α 、 AOX 、FAT/CD36、LFABP、ApoB、MTTPmRNA相對表達量比較，差異有統計學意義（ Plt;0.05 ）。模型組 CPT1α ！AOX、LFABP、ApoB、MTTP低于空白組，模型組FAT/CD36高于空白組，干預組FAT/CD36低于模型組，差異有統計學意義（ Plt;0.05 ），見表5。

2.6大鼠肝組織FAT/CD36表達水平

3組大鼠肝組織FAT/CD36表達水平比較，差異有統計學意義（ Plt;0.05 ），其中模型組高于空白組，干預組低于模型組，差異有統計學意義（ Plt;0.05 ），見表6、圖4。

3討論

與多系統疾病相關的NAFLD正隨著生活水平的提高，發病率以不同程度上升，且出現逐漸低齡化的趨勢[19-20]，其增加了肝硬化、心腦血管疾病、慢性腎臟疾病以及惡性腫瘤發病和死亡風險[21]。NAFLD的發病機制已由大多數學者所認可的“二次打擊”學說過渡為“多重打擊”學說，即在胰島素抵抗、高脂飲食以及肥胖的基礎上發生的脂質沉積，而后發生氧化反應和炎癥的級聯反應，會引起疾病的進一步發展[22]。除此之外線粒體功能異常、腸道微生物失調、細胞凋亡、炎癥因子和遺傳易感性也會參與進來［23]。脂質代謝紊亂是NAFLD發生的基礎和關鍵［24］，維持脂質穩態主要通過4種代謝途徑：脂肪從頭合成、脂肪酸氧化、脂質攝取與以極低密度脂蛋白（VLDL）的形式釋放入血，肝臟脂質的沉積和NAFLD的發生、發展均可由各種異常途徑所致［25］。既往研究也發現當脂質代謝出現紊亂時，過量的脂肪酸會導致FAT/CD36對脂肪酸的吸收增加，同時β氧化作用也會增強[2，26]

MCD飼喂4周后可導致動物VLDL的合成、分泌降低及線粒體 β 氧化酶活性降低，TG快速大量積累于肝細胞中，引起肝細胞脂肪變性而形成“第一次打擊”，并使肝臟對其他損傷敏感性提高，同時也會引起肝組織出現一系列病理變化[27]。由于肝細胞發生脂肪變性，造成了線粒體對游離脂肪酸的攝入量降低，進而激發了游離脂肪酸導致線粒體對游離脂肪酸的攝入量減少，從而刺激了游離脂肪酸 β 氧化的增強，觸發了氧化應激和脂質過氧化反應，最后造成了對肝臟的“第二次打擊”，進而形成了NAFLD［28-29]。相關研究顯示，加用抗氧化膳食補充劑的綜合精準營養干預對改善NAFLD患者炎性指標效果明顯［30] C

司美格魯肽是美國食品藥品監督管理局（FDA）批準用于治療2型糖尿病和肥胖的首個藥物，其作用機制在于激活GLP-1受體，服用司美格魯肽后患者腰圍、血脂、血糖和血壓等心臟病和糖尿病風險因素降低，整體生活質量也得到了改善［31-32]。目前國內外大量研究表明了司美格魯肽可以治療2型糖尿病伴NAFLD患者「33]，但是該藥是否是通過作用于減輕體質量來改善的 NAFLD 的嚴重程度目前尚不清楚[18.34-35]，因此研究司美格魯肽是否可以改善MCD飲食誘導的NAFLD的脂質沉積對臨床診斷以及治療尤為重要。

FAT/CD36屬于B類清道夫受體[36]，在長鏈脂肪酸跨膜轉運和調節代謝中發揮重要作用［37-39]。研究發現肝臟FAT/CD36表達增加會促進 NAFLD 的發展[40-41]。目前，FAT/CD36已被廣泛研究，揭示了其在調節脂質代謝方面的作用。AMP活化蛋白激酶（AMPK）作為一種細胞能量監測器，在維持動物細胞的能量平衡和代謝過程中扮演著至關重要的角色[42]，司美格魯肽可調節肝臟中的AMPK途徑激活沉默信息調節因子1（SIRT1），從而延長了動物壽命［43]。NAFLD進展可影響 SIRT1表達，嚙齒動物NAFLD模型可見SIRT1表達降低[44]，同時有研究發現司美格魯肽上調了 SIRT1的表達［35]此外AMPK的激活可能通過阻止雷帕霉素靶蛋白復合體1（mTORC1）來抑制過量營養物質誘導的肝脂質積累[45]雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是一種非典型的蛋白激酶，可通過參與mTORC1復合物的信號傳導途徑，對基因轉錄和蛋白翻譯產生影響［46]。研究發現NAFLD小鼠的mTOR通路被激活，進一步導致了肝臟脂肪酸轉運蛋白水平的提高[47]。小鼠肝細胞經棕櫚酸處理后mTOR信號通路表達上調，可提高肝細胞FAT/CD36表達水平，導致脂質積聚并引發炎癥反應［48]，當使用mTORC1特異性抑制劑雷帕霉素處理肝細胞可導致FAT/CD36表達抑制[49-50]，司美格魯肽減弱 途徑并增強肝臟中的胰島素信號傳導「43］。綜上本課題組認為司美格魯肽緩解了MCD飲食誘導的NAFLD的發生及發展可能是通過抑制FAT/CD36的表達來介導的。

本研究結果表明，干預組的肝組織HE染色、油紅O染色結果及肝臟TG水平較模型組改善，提示司美格魯肽對緩解NAFLD的進展有緩解作用，可能與FATCD36蛋白表達降低有關。但是司美格魯肽抑制FAT/CD36表達的機制仍需要進一步的研究明確，為臨床使用司美格魯肽注射液早期干預NAFLD提供實驗依據。

作者貢獻：張全愛提出主要研究目標，負責研究的構思與設計，研究的實施，撰寫論文；張全愛、董慧聰、盧曉飛負責飼養動物，動物組織的取材；張全愛、李沙進行數據的收集與整理；王愷悌負責統計學處理，圖、表的繪制與展示；郭永澤負責文章的質量控制與審查，對文章整體負責，監督管理。

本文無利益沖突。

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（本文編輯：鄒琳）