水氮互作對陜南烤煙煙堿合成及代謝的影響

Effects of Water and Nitrogen Interaction on Nicotine Synthesis and Metabolism of Flue-Cured Tobacco in Southern Shaanxi

HAO Sujuan'，ZHANG Aojie2， WANG Pingping^，ZHANG Mingcheng2，AI Suilong2，ZHANG Lixin2 （'Lianhu DistrictMeteorologicalServiceCenter，Xi'an7o;CollegeofLifeScience，NorhwestAamp;FUniversity， Xianyang712ioo，Shaanxi;YantaDistrict InstituteofTobaccoScience，Xi'an710000）

煙草是我國的主要葉用經濟作物之一，是卷煙生產的主要原料，還可用于提取尼古丁、木質素等，具有較高的商業價值[1]。此外，煙草在國家稅收中有著舉足輕重的地位，同時在精準扶貧方面發揮著重要作用。烤煙生產對提高農民收人、推動地方經濟發展有重要意義。

水分和肥料是影響煙草生長的最為重要的兩大栽培因素。水分是肥料發揮效用、被作物利用的基礎，肥料是水土系統中影響作物生產效率的關鍵[3]。氮是作物生產的主要驅動因素之一，與土壤水分條件有明顯互作[4-5]。施氮和灌水在提高烤煙水分利用率上存在顯著的互作效應，在土壤水分不足時，施加氮肥能夠促進烤煙對水分的利用，而在施氮量較多時，灌水又能促進烤煙對肥料的吸收利用。水氮之間的互作效應顯著促進了烤煙干物質的積累，影響烤煙株高、莖圍、葉面積等農藝性狀，從而提高煙葉產量。 ¹⁵N 穩定同位素試驗表明，水氮互作可以顯著提高烤煙的氮肥利用率[。合理的水氮組合能協調烤煙各種化學成分含量，提高煙葉品質。此外，施氮量增加可以提升烤煙的氧化防御系統，減輕水分脅迫下烤煙的氧化損傷[7]。

代謝物是細胞調控終產物，參與多種生化反應及生理調控[，最接近生物的表型或者生理狀態，其種類、含量變化可以看作是生物體對表型或基因變化響應的結果，更能反映生物的基因、環境與表型三者之間的關系。代謝組學應運而生，主要通過高通量檢測對生物體在限定條件下的代謝物進行定性、定量分析，探究其代謝產物差異及代謝途徑的變化規律來揭示內在機制[9-10]。代謝組學作為系統生物學新的分支，目前已經成為繼基因組學、轉錄組學和蛋白質組學之后新的研究熱點。Zhao等[運用代謝組學方法分析不同產地來源的烤煙代謝物差異，發現不同產地的烤煙代謝物呈現明顯的分離，不同生態區域可影響烤煙氮代謝等多種代謝途徑，進一步篩選出多種與不同產地煙葉香味特征有關的差異代謝產物，為煙葉香型的研究提供了理論依據。隨著相關技術的發展，在玉米、水稻等作物上通過代謝組學方法進行機理探索的研究逐步深入。代謝組學技術在煙草研究中的應用也逐步展開[12-15]，成為全面、系統研究煙草對環境或外界刺激響應機理的重要手段[12]。

本研究針對陜南煙區烤煙生產中的水氮供應匹配性，以云煙99為材料，探究水氮互作對烤煙煙堿含量、煙堿合成過程中關鍵酶活性的影響，同時采用代謝組學方法探究不同水氮處理影響煙堿合成的內在機制，旨在為烤煙產質量調控提供參考。

1材料與方法

1.1試驗地概況試驗于2021年4-8月在西北農林科技大學北校區曹新莊試驗站（ 34^°17^′23^′′N 108^°4^′12^′′E ，海拔 520m ）日光大棚內完成。種植土壤為陜西省商洛市洛南縣植煙黃棕壤土，基本理化性質： pH 值7.22，有機質含量 10.25g/kg ，速效氮含量 30.25mg/kg ，速效磷含量 34.25mg/kg ，速效鉀含量 127.48mg/kg 。

1.2試驗設計烤煙品種為云煙99，由陜西省煙草科學研究所提供。本試驗涉及水、氮2個因素，其中土壤水分條件3個水平：W1（土壤相對含水量75%～85% ）W2（土壤相對含水量 55%～65% ）、W3（土壤相對含水量 35%～45% ），施氮量3個水平：N1（ 4g/ 株）N2（ 5g/ 株）N3（ 6g/ 株），雙因素完全組合設計共計9個處理（表1。煙苗成苗后移入桶中，每桶定植1株，移栽前保持桶中土壤相對含水量60% ，移栽后36d進人旺長期，開始進行水分處理。采用稱重法補水，控制土壤相對含水量，控水處理進行 30d 。按照試驗處理，稱取相應克數的氮肥給每株煙苗進行基施。

1.3樣品采集于移栽后36d（旺長初期）51d（旺長中期）66d（旺長末期）85d（成熟期）分別對根部及葉片進行取樣。葉片于 105% 殺青 30min 65°C 烘干至恒重，研磨并過100目篩，用于煙堿含量測定。取根尖3cm迅速放入液氮，后保存于 -80% 冰箱，用于測定煙堿合成途徑中關鍵酶的活性、代謝產物含量。取樣方式為各處理隨機3株樣品混合，每個處理3次重復。

1.4測定項目與方法煙堿含量測定參考鄭璞帆[的方法并稍作改動，采用HCI浸提法。稱取粉碎過篩烘干的煙葉樣品 0.03g ，加人 0.5mol/L 鹽酸溶液 25mL ，活性炭1/3角匙，震蕩 10min 后過濾，定容至 100mL ，用紫外分光光度計測定 236nm 、259nm 和 282nm 波長的吸光度。

煙堿合成途徑中關鍵酶活性測定煙草根樣添加液氮后進行粉碎，取 0.1g 加人 0.05mol/L 磷酸緩沖液（pH值7.4） 1.5mL ，充分混勻后 4^°C 下8000r/min 離心 20min ，上清液用于精氨酸脫羧酶（ADC）鳥氨酸脫羧酶（ODC）腐胺 N_- 甲基轉移酶（PMT）的測定，其測定步驟按照上海通蔚生物科技有限公司的酶聯免疫試劑盒說明書進行。

代謝產物含量測定樣品前處理：煙草根樣添加液氮后進行粉碎，取根樣 0.2g ，加入 75% 甲醇溶液 400μL ，充分混勻后超聲提取 30min，4^°C 下 14000r/min 離心 20min ，上清液用 0.22μm 有機相過濾器過濾后加入 2mL 進樣瓶中，用于高分辨離子淌度液質聯用儀HRLCMS（ LC-30A+ TripleTOF5 5600+ ）上機進行正、負離子模式分析。

數據庫匹配將提取的峰信息在MassBank、Respect、GNPS這3個庫進行全庫檢索與比對。數據庫匹配參數見表2。

1.5數據統計與分析采用Excel2013、IBMSPSSStatistics26和RStudio1.3.1093.0對數據進行整理、統計分析和做圖。

2 結果與分析

2.1水氮互作對烤煙煙堿含量的影響由表3可以看出，不同水氮處理的烤煙中部葉煙堿含量在不同時間段均逐漸上升。移栽后36d，各處理的中部葉煙堿含量差異不大，此后水分控制開始，各處理的中部葉煙堿含量差異逐漸增大，在移栽后66d各處理中部葉煙堿含量差異最為顯著。整體來看，同一時期相同氮肥處理下，中部葉煙堿含量隨著土壤相對含水量的增加而降低；W1N1和W1N2處理在整個過程中保持相對平穩的增長，在移栽后85d煙堿含量均較低；W3水分條件下，各時期中部葉煙堿含量均較高。同一時期相同水分處理下，中部葉煙堿含量隨著氮肥的增加而增加。

2.2水氮互作對煙堿合成途徑關鍵酶活性的影響

由圖1可知，移栽后36d即控水之前各處理的精氨酸脫羧酶（ADC）活性無顯著差異。移栽后51d，相同氮肥處理下ADC活性呈現隨土壤相對含水量降低而升高的趨勢，且W3處理下ADC活性達到W1條件下的 1.64～1.81 倍；W1水分條件下，W1N2處理的ADC活性略低于其余處理，但無顯著差異；W2、W3水分條件下，ADC活性隨施氮量增加而增加，W2N2、W2N3處理的ADC活性較W2N1處理分別提高 10.7%.21.1% ;W3N2、W3N3處理的ADC活性較W3N1處理分別提高 0.5%.0.8% ；因此，隨土壤相對含水量降低施氮量對ADC活性的提升效果減弱。移栽后66d，W2水分條件下ADC活性最高，且隨施氮量增長ADC活性提高；W3水分條件下，ADC活性較移栽后51d下降，且隨施氮量增加呈現先增加后降低的趨勢。移栽后85d，所有處理的ADC活性均處于較高水平，施氮量對ADC活性影響效果減弱。

由圖2可知，W1、W2水分條件下，各處理的鳥氨酸脫羧酶（ODC）活性隨移栽后時間增加而增加，W3水分條件下，各處理ODC活性呈現隨移栽后時間增加先增加后降低再增加的趨勢。移栽后36d，各處理的ODC活性無顯著差異；移栽后51d，W2、W3條件下ODC活性隨施氮量增加而升高，其中W2條件下增幅較高，W2N2、W2N3較W2N1分別提高了 17.6%.28.6% ;移栽后66d，W3水分條件下，各處理較移栽后51d分別降低了 2.1%.6.9%.2.5% 移栽后85d，W1水分條件下ODC活性仍隨施氮量增加而提高，W2、W3水分條件下則隨施氮量增加呈現先增加后降低的趨勢。

由圖3可知，所有處理的腐胺N-甲基轉移酶（PMT）活性均隨著移栽時間的增加而增加，移栽后36d各處理之間的PMT活性無顯著差異；進行水分控制后，各處理PMT活性出現差異，整體表現為隨土壤相對含水量的降低PMT活性升高。移栽后36＼～66d，均以W3N3處理的PMT活性最高；移栽后85d，W1、W3水分條件下不同施氮量處理的PMT活性相近；W2水分條件下，W2N3處理的PMT活性最高，比W2N1提高了 17.6% 。

2.3水氮互作下烤煙代謝組學分析

2.3.1總體代謝物層次聚類分析對煙堿含量差距較大的W3N3和W1N1兩組處理進行代謝組學分析，由PCA主成分分析結果可知進樣過程中儀器運行較為穩定，可以用于后續的分析。對鑒定出的全部代謝物的相對定量值歸一轉化后進行層次聚類得到圖4，列為所有樣本，行為全部代謝物，紅色代表高表達代謝物，藍色代表低表達代謝物。由圖4可以看出，有部分代謝物高、低表達交互在一起，但高、低表達區域較明確。同一組別樣品的高、低表達區域較為相近，不同組別樣品間高、低表達區域差異明確。

產物中包括10種有機酸，7種胺類，5種醇類，3種酚類，2種酮類，2種酯類，1種氨基酸類，1種堿類，其他類8種。

2.3.3代謝通路富集分析如圖6所示，差異代謝產物主要富集的代謝通路為：氨酰tRNA生物合成，ABC轉運器，氨基酸生物合成，嘌呤代謝，代謝途徑，咖啡因代謝，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成，丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝，谷胱甘肽代謝，單酰胺類生物合成代射通路。氣泡圖中，氣泡顏色越深代表該通路差異顯著性越高，直徑越大代表富集到的代謝物越多。因此，在富集到的通路中，氨酰tRNA生物合成途徑富集的代謝物較少，但差異顯著性較高；代謝途徑富集的代謝物最多。

2.3.4煙堿代謝相關產物將已識別的代謝產物中與煙堿合成相關的代謝產物進行聚類分析，結果如圖7，有部分代謝物高、低表達交互在一起，但有相對明確的高、低表達區域。

a為柱狀圖，b為氣泡圖；Valine，leucineandisoleucinebiosynthesis為氨酸亮氨酸和異亮氨酸生物合成，Purinemetabolism為嘌呤代謝，Monobactam biosynthesis 為單酰胺類生物合成代謝通路，Metabolic pathways為代謝途徑，Glutathione metabolism為谷胱甘肽代謝，

Cafeine metabolism為咖啡因代謝，Biosynthesis ofaminoacids為氨基酸生物合成，Aminoacy1-tRNAbiosynthesis為氨酰tRNA生物合成，Alanine，aspartate and glutamate metabolism為丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，ABC transporter為ABC轉運器

對煙堿合成相關代謝產物含量進行相關性分析，結果如圖8。有9對代謝產物呈顯著正相關，有9對代謝產物呈顯著負相關。天冬氨酸、精氨酸含量與煙堿含量呈顯著正相關。初步判斷水氮處理對烤煙煙堿含量造成的影響可能是由于天冬氨酸、精氨酸含量的變化。

3討論

常規化學成分是判斷煙葉品質好壞的關鍵因素[17]，煙堿是煙葉最重要的化學成分之一，煙堿是煙草特有的生物堿，影響烤煙的勁頭和刺激性，其含量高低是衡量烤煙品質的重要指標[18-22]。土壤水分條件會影響煙堿含量，本研究中中部葉煙堿含量表現為土壤相對含水量 35%～45% 最高， 75%～85%最低，這與汪耀富等[3研究結果一致。氮作為煙堿的重要組成成分，其施用量與煙堿含量密切相關。水分和氮肥在作物生長中存在相互促進、相互制約的關系。馬振奇[23]進行水氮耦合研究發現，不同水氮處理下中部葉的煙堿含量均呈現隨土壤相對含水量降低而升高，隨施氮量增加而升高的規律。本研究中中部葉煙堿含量整體變化規律與之一致。

張瑞霞[24]測定了不同滲透脅迫程度下24h內烤煙葉片精氨酸脫羧酶和鳥氨酸脫羧酶的酶活性變化，發現精氨酸脫羧酶活性隨脅迫程度的加劇而顯著升高，這與本研究一致；不同的是，在該研究中隨脅迫程度加劇、時間延長，烤煙鳥氨酸脫羧酶活性無顯著變化，而在本研究中移栽后36d、51d烤煙根部鳥氨酸脫羧酶活性受土壤相對含水量影響較小，在移栽后66d土壤相對含水量 35%～45% 條件下其活性降低，這種差異是否是由取樣部位不同、處理時長不同或者是由植株生長水平不同帶來的尚需進一步研究。本研究中，不同土壤水分條件下施氮量的增加不同程度上提高了精氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶活性，但其作用機制尚不明確。黃化剛等[25]研究表明，同等用氮量下有機氮相比于無機氮可以提高鳥氨酸脫羧酶的表達量，導致烤煙上部葉煙堿含量增加。不同氮素形態也會影響精氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶活性，從而導致煙堿積累量的差異[26]。烤煙根系腐胺N-甲基轉移酶活性與葉片煙堿含量呈顯著正相關[27-28]。

近年來，代謝組學不斷發展，為煙草的提質增香及代謝機理研究奠定了基礎。本研究中，精氨酸含量與煙堿含量呈正相關。對比分析發現，這種差異的形成可能是由于取樣部位不同造成，本研究所用材料為合成煙堿的根系部位，而向海英等[29]研究對象為烤煙葉片部位，根部與葉片部位的這種差異與煙堿合成、轉運之間的關系仍需進一步研究；此外，研究共識別出4086個含有二級碎片的一級質譜峰，鑒別出245個差異代謝產物。本研究中，對不同水氮處理后煙堿含量差異較高的兩個處理進行代謝物提取及組學分析，共鑒別出190種代謝物，這種差異可能是由于取樣部位、提取效率、儀器分辨率等不同導致。識別出的代謝產物數量及精準度是代謝組學精確分析的基礎，完善植物組織中代謝產物提取方法，提高代謝產物提取效率及比對精準度是代謝組學發展的重要內容。

4結論

施氮量對煙堿合成的作用效果因土壤相對含水量不同而有所差異，中部葉煙堿含量在土壤相對含水量 35%～45% 條件下最高，且以施氮量 6g/ 株處理煙堿含量最高，煙堿含量以W1N1處理最低。不同水分條件下適宜的施氮量可以提高煙堿合成關鍵酶活性，代謝物差異分析結果表明，差異代謝物在氨酰tRNA生物合成途徑、ABC轉運器通路、氨基酸生物合成途徑及嘌呤代謝中顯著富集；煙堿合成途徑代謝產物存在顯著差異，其中天冬氨酸、精氨酸含量與煙堿含量呈顯著正相關。

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（收稿日期：2025-02-19）