草魚小瓜蟲病抗病相關免疫功能酶活性差異和氨基酸組分變化研究

多子小瓜蟲（Ichthyophthiriusmultifiliis）隸屬于原生動物門、纖毛蟲綱、膜口目、凹口科、小瓜蟲屬，是一種引起魚類“白點病”（又稱小瓜蟲病）的寄生蟲。患“白點病”的魚鰓部等多處組織發生充血現象，免疫力下降，繼而引發其他病菌感染，導致大規模死亡。由于該病具有暴發速度快、死亡率高的特征，目前尚無可靠的防治對策，因而給淡水養殖業帶來巨大的損失[1-5]。多子小瓜蟲的最適水溫為 15～20^°C ，因此秋冬及春夏交替期間是小瓜蟲病的好發季節，通常發生在水庫、溪流以及湖泊等水體中，而當魚類養殖密度較高、魚體自身免疫力較差時，該病的感染率也會增加[6-7]。

多子小瓜蟲通常寄生在魚類的鰓、皮膚等部位，此外，其他部位如鰭、口腔或者眼部也有感染現象發生[8]。多個形態學研究發現，多子小瓜蟲主要寄生在第1和第2片鰓的兩端角、背部或兩側的體表，寄生部位伴有細胞腫脹甚至壞死、毛細血管開裂以及出血的病征[9]；一旦多子小瓜蟲穿過了鰓腔膜，會對胸腺造成危害，例如，胸腺淋巴細胞以及上皮細胞受到侵蝕而出現增生現象，病魚體色發黑、黏液分泌增多并伴有鱗片脫落癥狀，嚴重影響魚類的健康[10]；當病情加劇后，白點會遍布魚體周身，導致表皮發生潰爛、脫落、甚至出現蛀鰭等現象，患病魚體呈現瘦削、反應遲鈍及游動異常等病征，極易和固體物磕碰，最終因呼吸困難而死亡。Haas等[11]分析指出，魚體的血清以及黏液等分泌物對小瓜蟲有進一步的引誘作用，盡管多子小瓜蟲沒有發達的神經系統和細胞化學感受器，但在接收到魚體分泌的不同種類的信號分子后仍會呈現多種行為模式，包括加快游動速度靠近魚體實施侵襲。

國內在小瓜蟲病防治方面的研究較多，如用食鹽、紫外線、提高水溫、綠水高溫曝曬、辣椒和生姜等方法，但這些方法均不適用于大水體環境[10，12]。本研究將感染小瓜蟲的草魚個體進行解剖，并對易感染部位進行采樣分析，根據試驗魚的感染和抗病情況將其分為健康組、抗病組和易感組，研究不同組別個體鰓部組織形態變化、酶活性以及氨基酸組分的差異，進一步揭示小瓜蟲感染后草魚鰓部形態變化，并對其致病和致死機制作出一定的推斷，明確相關免疫功能酶及氨基酸組分在抗病中的作用，以期為后續開展草魚抗小瓜蟲良種選育工作提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料和飼養條件

試驗用草魚來自農業農村部草魚遺傳育種中心。選擇無多子小瓜蟲接觸史的健康個體進行試驗，體長 （11.5±1.5）cm ，體質量 （87.6±4.2）g 。將試驗魚暫養在適宜的生長環境中，水體溫度為（25.0±0.5）^°C ， pH 為 6.7±0.3 ，溶解氧為 （5.1± 0.1）mg/L_? 。投喂飼料（四川通威股份有限公司），每日投喂2＼～3次。

為了獲取多子小瓜蟲掠食體，使用小牛血清培養高感染草魚的多子小瓜蟲包囊。

試驗草魚暫養1周后，挑選部分健康草魚用于小瓜蟲感染試驗。根據試驗魚的感染情況進行分組：未被感染的草魚為健康組，感染多子小瓜蟲48h 內死亡的草魚為易感組，感染多子小瓜蟲144h 后仍未死亡的草魚則標記為抗病組，每組設3個平行。感染期間嚴格監測水質，每日觀察試驗魚的情況。

1. 2 組織切片試驗

分別從試驗魚的背部、腹部和尾部皮膚以及鰓絲中剪取 1cm×1cm 的組織樣本。將采集的皮膚和鰓絲組織浸泡在 4% 多聚甲醛通用型組織固定液中，確保固定液充分滲透組織，持續固定^12h 以上。隨后，使用常規乙醇（體積分數為75% ）梯度脫水方法對固定組織進行脫水，然后進行浸蠟和包埋，使用石蠟取代透明劑。最后，對組織樣本進行脫蠟、染色和觀察，包括阿爾辛藍染色、席夫試劑浸染、蘇木素染色等步驟。最終，貼標簽，在顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.3 酶活性測定

在樣品處理階段，用棉拭子刮取抗病組、健康組和易感組草魚背部相同位置的皮膚黏液，將棉拭子及刮取的皮膚黏液放入含有緩沖液的EP管中浸泡1h，隨后在 4‰ 下離心 2min ，取上清液。試驗方法：采用市售試劑盒（南京建成生物工程研究所）進行酶活性測定，按照提供的說明書，設置空白管、標準管（對照組，健康草魚）和測定管（感染組，包括抗病組和易感組），每組測定管包含3個平行。采集的黏液在 4^°C 下冷藏。使用時預先在室溫條件下稀釋，根據試劑盒說明書的方法，對酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）、超氧化物歧化酶（SOD）過氧化氫酶（CAT）、溶菌酶（LSZ）、谷草轉氨酶（AST）、蛋白酶（PROT）和過氧化物酶（PER）等多種酶的活性進行測定，并對丙二醛（MDA）含量進行檢測

1.4 游離氨基酸及其衍生物測定方法

游離氨基酸及其衍生物的檢測采用高效液相色譜法（HPLC）結合WatersKairos氨基酸試劑盒進行。首先取 0.5mL 的鰓部黏液樣品，并將其溶于 5mL 質量分數為 3% 的磺基水楊酸溶液中。混合均勻后，樣品進行低溫離心提取，以去除雜質和固體顆粒。從上清液中提取樣品，并通過0.22μm 濾膜將其過濾到進樣瓶中，用于進行后續的分析。設置HPLC儀器的條件（反應柱溫度37^°C ，反應器溫度 130°C ，流速 0.1mL/min ，反應時間 65min 進行檢測

1.5 數據處理

使用SPSS21軟件進行單因素方差分析（one-wayANOVA），用圖示法檢測數據正態性，采用Duncan’s檢驗法進行多重比較。所有數據以平均值 ± 標準差表示，設顯著水平為0.05，極顯著水平為0.01。采用Origin9軟件進行繪圖。

2 結果和分析

2.1 不同組別草魚個體的組織學觀察

對3個試驗組（健康組、抗病組和易感組）草魚的鰓組織進行計數觀察（見圖1），結果顯示，與易感組草魚個體的鰓部特征相比，抗病組和健康組草魚個體的鰓絲結構相對完整，毛細血管較豐富充盈，細胞排列有序；而易感組草魚的鰓絲網狀結構受損嚴重，毛細血管明顯減少，鰓絲細胞結構紊亂，完整細胞較少，同時出現了明顯的畸形病變特征。觀察結果表明，多子小瓜蟲對草魚鰓部組織造成了不同程度的侵害。

2.2 不同組別草魚酶活性的比較

對健康組、易感組和抗病組中不同個體的體表黏液進行相關免疫酶活性測定，以比較各試驗組草魚的氧化脅迫程度，結果見圖2。抗病組草魚皮膚黏液中 ACP、AKP、CAT、LSZ、AST、PER、PROT和SOD的活性均顯著高于健康組草魚和易感組草魚（ Plt;0. 05， ；抗病組草魚皮膚黏液中MDA含量極顯著低于易感組草魚（ Plt;0.01? 。上述結果表明，與健康組和易感組相比，抗病性群體在遭受多子小瓜蟲感染后，免疫功能相關酶的活性發生了變化，酶的調節起到了抵御病原體的關鍵作用。

2.3 不同組別草魚氨基酸組分分析

為探尋功能性氨基酸對草魚個體提高免疫及存活率的意義，本研究對3組（健康組、抗病組和易感組）草魚個體分泌的黏液進行了30種游離氨基酸及其衍生物質量濃度的測定，結果見表1。結果顯示，抗病組與易感組之間有20種游離氨基酸及其衍生物存在顯著性差異（ Plt;0.05） ，表明部分游離氨基酸及其衍生物在草魚抵抗多子小瓜蟲感染的過程中可能起到了重要作用；抗病組與健康組之間有22種游離氨基酸及其衍生物存在顯著性差異（ Plt;0.05） ；而健康組與易感組之間有14種游離氨基酸存在顯著性差異（ Plt;0.05） 。統計發現，抗病組與健康組、易感組三者之間有4種存在顯著差異的共有游離氨基酸及其衍生物（ Plt; 0.05），分別是磷乙醇胺（PE）、牛磺酸（Tau）、精氨酸（Arg）和賴氨酸（Lys）。試驗結果表明，多數游離氨基酸及其衍生物在草魚抵抗多子小瓜蟲感染的過程中起到了重要作用，而磷乙醇胺、精氨酸等作為抗病組草魚個體的特異性組分，可能在抗病過程中參與多條抗病通路，在免疫系統中起到重要的作用。

3 討論

皮膚、鰓等魚類黏膜層中含有多種免疫分子，如免疫球蛋白、凝集素、半乳糖凝集素、干擾素、鈣調蛋白、組蛋白和核糖體蛋白等，是宿主抵御外界病原侵襲的首要屏障[13]。黏膜中含有廣泛的淋巴細胞，例如T細胞、B細胞、樹突狀細胞等，可以分泌特異性IgT抗體，因此當魚體受到病原感染時，可啟動特異性或者非特異性免疫應答功能來清除病原體[14-15]。魚類體表的黏液含有多種抗菌酶和廣譜性的抗細菌、真菌成分，能激活魚類體表的黏膜免疫應答機制，維護免疫穩態，阻止或抵擋多子小瓜蟲的入侵，從而減少其危害[16-17]。對抗多子小瓜蟲病草魚的黏液成分進行組間比較，探究差異表達氨基酸組分或抗菌酶的種類，將有助于了解草魚對抗病原體入侵的機制，為培育強抗病性的草魚品系提供重要指導[18-19] O

單位：mg/dL

本研究結果顯示，在小瓜蟲侵襲草魚2＼～3d后，易感組中草魚個體的體表和鰓部組織結構出現了明顯的變化，魚體體表上可觀察到白色顆粒狀物質和大量黏液，同時伴有魚鱗脫落、發黑現象，這可能是繼發性細菌感染引起的；相比易感組個體，具有抗病性狀草魚的鰓部組織結構更為完整。鰓部是小瓜蟲感染的主要器官，其結構形態的改變程度能夠有效反映草魚對小瓜蟲的抵抗能力。在面對寄生蟲感染時，具有抗病性狀的草魚能夠維持組織的完整性，避免細菌的二次感染，并能有效防止魚體狀況的進一步惡化。這種針對小瓜蟲感染的抗病性狀可能涉及多種免疫和防御機制，只有具有良好的免疫力才能更好地適應和生存。因此，深入了解這些抗病性狀的分子基礎將對探索草魚的免疫防御機制有所啟示，也為進一步提高養殖抗病能力草魚品系的選育提供了更豐富的信息。

本研究對不同組別草魚體表黏液中抗菌酶的活性進行了分析，結果表明，在感染多子小瓜蟲后，抗病組草魚ACP和AKP的活性顯著高于健康組和易感組（ Plt;0. 05） 。有研究表明，ACP和AKP能夠打開磷酸酯鍵，釋放磷酸根離子，從而有效地殺滅和清除病原體[20-21]。其中 ACP 在動物組織中廣泛分布，主要定位于溶酶體內，草魚皮膚黏液中高活性的 ACP表明其在抵御外界病原體方面發揮著重要作用[22]；AKP則廣泛存在于動物細胞的細胞膜上，參與多種化學和營養物質的吸收和轉運，以及吞噬細胞的過程。研究表明，AKP在魚體受損自我修復的初期階段發揮著關鍵作用。抗病組草魚皮膚黏液中AKP活性的顯著提高可能是因為抗病組酸性黏多糖含量較高，形成的酸性環境對AKP具有抑制作用。這表明在魚體面臨環境脅迫或寄生蟲感染時，黏液細胞會合成更多的AKP以應對外界病原體的侵襲。此外，引入MDA、CAT等多個反映細胞受損程度的酶活性或含量指標用于間接檢測細胞的過氧化水平。抗病組草魚皮膚黏液中MDA含量的極顯著降低（ Plt;0.01 ）以及CAT、SOD活性的顯著升高（ Plt;0.05） ），提示在寄生蟲等病原體侵染的過程中，魚體會產生過量的活性氧自由基，加劇細胞的衰老和凋亡。本研究中，抗病組草魚的抗氧化酶含量顯著升高，說明抗病組草魚個體的免疫水平得到了顯著提升;而基于谷草轉氨酶（AST）、蛋白酶（PROT）和過氧化物酶（PER）的比較結果可以看出，抗病組草魚表現出更高的AST、PROT和

PER活性，且與健康組和易感組草魚相比具有顯著性差異（ Plt;0.05） 。這可能意味著抗病組草魚在感染后，其體內天門冬氨酸代謝、蛋白質降解和過氧化物清除能力增強了。抗病組草魚在免疫反應能力和細胞代謝功能方面普遍增強，這一結果為探究草魚對抗病原體的生理適應機制提供了重要線索。

本研究中，對不同組別氨基酸組分的比較分析結果發現，抗病組與易感組草魚有20種游離氨基酸及其衍生物具有顯著性差異（ Plt;0.05） 。這表明在對抗寄生蟲感染的過程中，草魚鰓部黏液中的氨基酸組成發生了顯著變化。其中，抗病組相對于易感組更有利于免疫應答的氨基酸表達模式，表明其免疫反應和抗病能力更強。分析發現，抗病組與健康組草魚之間有22種游離氨基酸及其衍生物存在顯著性差異（ Plt;0.05 ），表明抗病組草魚鰓部黏液有差異的氨基酸可能為其提供了更多的生理功能和免疫保護。抗病組與健康組以及易感組草魚之間有4種游離氨基酸及其衍生物（磷乙醇胺、牛磺酸、精氨酸和賴氨酸）存在顯著性差異（ Plt;0.05） ，這些特定組分的差異可能反映了抗病組在應對寄生蟲感染時具有獨特的代謝途徑或免疫調節機制[23]

目前在草魚抗多子小瓜蟲相關理論和培育方面的研究雖然已取得了一定的進展，但鰓部組織作為寄生蟲攻擊的首要部位，有關其黏膜免疫應答機制的研究仍需要更多分子、細胞以及組織學方面的數據。因此，本研究開展對易感和抗病魚體中相關抗菌酶以及分子組分的探究，可為多子小瓜蟲的致病和致死機制提供更深層次的分子線索和理論基礎，并為后續在草魚養殖領域中開展抗小瓜蟲良種選育提供參考依據。

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Study on the differences in the activities of immune function enzymes and amino acid composition related to resistance against Ichthyophthirius multifiliis in

Ctenopharyngodon idella

CHEN Feng1，2，RAO Changhao1，2，REN Yun1，2，ZHANG Xianbo ^1，2 ， HUANG Menglu34， SHEN Yubang ^3，4

（1. Guizhou Fisheries Research Institute， Guizhou Academy of Agricultural Sciences ， Guiyang 55O025， China; 2. Engineering Center of Special Fisheries of Guizhou Province， Guiyang 550025，China; 3. Key Laboratory of Freshwater Aquatic Genetic Resources， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Shanghai Ocean University， Shanghai 2O13O6， China; 4. Shanghai Engineering Research Center of Aquaculture， Shanghai Ocean University， Shanghai 201306， China）

Abstract： To address the issue of weakened resistance of grass carp to Ichthyophthirius multifilis（Ich），and further understand the pathogenic and lethal mechanisms of Ich on grass carp，fish were divided into three groups based on their susceptibility to the disease：healthy group，disease-resistant group，and susceptible group. The histological properties of gill tissues，theactivitiesof enzyme related to disease resistance and amino acid composition were analyzedand compared.The results showed that the individuals in the healthy group and disease-resistant group had intact gillfilament structures，richand full capillaries，and orderlycellarrangement. However，the susceptible group showed typical malformed pathological characteristics，including a pronounced reduction in capillaries and a disorganized arrangement of gillfilaments.The activities ofacid phosphatase（ACP）， alkaline phosphatase（AKP），catalase（CAT），lysozyme（LSZ），aspartate aminotransferase（AST）， peroxidase （PER），protease（PROT），and superoxide dismutase（SOD） in grass carp of the disease-resistant group were significantly higher than those of the healthy group and the susceptible group（ Plt;0.05 ），while the malondialdehyde （MDA） content was extremely significantly lower than that of the susceptible group（ Plt;0.01 ）. There were significant differences in 2O amino acids and their derivatives between the disease-resistant group and the susceptible group（ Plt;0.05 ），and significant diferences in 22 amino acids and their derivatives between the disease-resistant group and the healthy group（ Plt;0.05 ）.Among them，phosphoethanolamine，taurine，arginine，and lysine were the common differential components.

Key words：Ctenopharyngodon idella；Ichthyophthirius multifilis；enzyme activity；amino acid composition; anti-infection