基于微流控芯片的腫瘤細胞球三維培養(yǎng)及藥物篩選研究

中圖分類號：TB39文獻標志碼：A

Research on three-dimensional culture and drug screening of tumor cell spheres based on microfluidic chips

XUE Zhiwei， ZHENG Lulu （School of Optical-Electrical and Computer Engineering， University of Shanghai for Science and Technology，Shanghai 20oo93，China）

Abstract： Three-dimensional culture of tumor cell spheres can truly simulate the growth environment of tumor cels in vivo， and thus be more suitable for drug screening and other related research. Combined with microfluidic technology， there are more ways to implement threedimensional cell culture technology. In this study，a microfluidic chip for high-throughput threedimensional tumor cell spheres culture was designed to enable rapid cultivation and drug screening of tumor cell spheres based on microcavity arrays. Compared to the current mainstream threedimensional culture that takes 4 days， microfluidic chips only require 15h to form tumor spheres. It significantly saves cultivation time. The reliability of three-dimensional culture in the chip was verified by tumor growth morphology monitoring and fluorescence imaging technology.

Meanwhile， this research realized multi-drug rapid screening based on chip， presented good gradient dependence and verified the feasibility of drug screening in chip. This high-throughput microfluidic chip can be applied in multiple research fields such as oncology， providing a new technological means and experimental platform for achieving rapid drug screening in tumors.

Keywords： microfluidic chip; three-dimensional culture; drug screening

引言

在世界范圍內，癌癥患者的發(fā)病和死亡數(shù)量持續(xù)增長。根據(jù)中國國家癌癥中心與美國癌癥協(xié)會的數(shù)據(jù)統(tǒng)計：2022年，中國和美國分別有大約482萬和192萬的新發(fā)癌癥病例，以及321萬和 61萬的癌癥死亡病例[1-2]。腫瘤學中最具挑戰(zhàn)性的問題之一就是抗癌藥物的開發(fā)與藥效評估速度。與其他適應癥藥物相比，腫瘤藥物從臨床前研發(fā)到I期臨床試驗獲得批準的成功率低至7% 。考慮到腫瘤藥物臨床開發(fā)的高成本和長耗時，迫切需要更好的臨床前藥物篩選平臺[3]

在培養(yǎng)腫瘤細胞時，通常采用的是二維培養(yǎng)技術。但越來越多的研究表明，相比于真實人體環(huán)境，二維培養(yǎng)單層腫瘤細胞的過程中既缺失了許多組織特異性結構，也缺少細胞與細胞、細胞與基質間的相互作用4。而采用三維培養(yǎng)獲得的腫瘤細胞球、類器官、器官芯片等則保留了許多重要的生物學功能[5-。有些功能在二維培養(yǎng)的單層細胞中會遭到破壞。這使得人們對三維培養(yǎng)技術愈發(fā)感興趣。

多細胞球培養(yǎng)方法最早由Sutherland及其同事于1970年提出，用于研究腫瘤細胞的功能表型及其療效觀察。自此，球體培養(yǎng)作為一種新的培養(yǎng)方式，應用于多種細胞的培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，從腫瘤細胞球體表面到內部致密細胞結構之間可以形成氧氣、營養(yǎng)物質、代謝物及藥物等的含量梯度差。這對研究人體中腫瘤細胞的耐藥性具有重大意義[7-8]。Karlsson 等[]提出，相比于孔板培養(yǎng)的單層細胞，三維腫瘤細胞球因為藥物擴散障礙、增殖緩慢、具有干細胞特征等原因，對同一種化療藥物會表現(xiàn)出更強的耐藥性，更加接近臨床模型。然而，在腫瘤細胞球的培養(yǎng)過程中，如何促進細胞聚團，以及保證球體大小均勻是一項高難度的挑戰(zhàn)。常規(guī)腫瘤細胞球的培養(yǎng)方法有4種：使用低吸附培養(yǎng)板培養(yǎng)、懸滴培養(yǎng)、動態(tài)灌注培養(yǎng)和基于微流控技術的細胞3D打印。

隨著超精密加工技術的進步，微腔結構對細胞生長聚團的影響效果得到重視，越來越多的研究者開始使用微孔陣列進行三維細胞形態(tài)的培養(yǎng)。2017年，Gumuscu等[10]制作了約含500個水凝膠隔間的微流控三維培養(yǎng)平臺，用于人腸道細胞與腸道細菌相互作用的高通量研究。Baptista等[1]利用聚合物薄膜微腔陣列進行了人類支氣管類器官的培養(yǎng)。他們先在基質膠液滴中進行了器官預培養(yǎng)，然后將預培養(yǎng)的器官轉人到微腔陣列芯片中。結果顯示，類器官在微腔中可繼續(xù)生長7周，從而驗證了類器官能夠在微腔環(huán)境中長時間培養(yǎng)。Brandenberg等[12在聚合物-水凝膠底物的微腔陣列中培養(yǎng)了數(shù)千個胃腸道細胞球，并進行了實時分析。

本研究基于微流控芯片加工技術，設計了一種微腔陣列芯片。采用該芯片，構建了同步完成腫瘤細胞球快速三維培養(yǎng)與高效藥物篩選的全流程解決方案。討論了常見化療藥物，吉西他濱（Gemcitabine）與伊立替康（Irinotecan）對小鼠乳腺癌細胞系（4T1）腫瘤細胞球的抑制作用。結果顯示，細胞死亡率與所用藥物濃度成正比。相比于傳統(tǒng)孔板，采用微流控芯片可縮短實驗時間、減少試劑消耗、簡化操作流程。本研究為三維細胞球的快速培養(yǎng)及藥物篩選提供了新的技術方案。

1實驗部分

1.1 試劑和儀器

實驗所用試劑：磷酸鹽緩沖鹽溶液（phos-phatebuffer solution，PBS）、RPMI1640 培養(yǎng)基、胎牛血清（fetalbovine serum，F(xiàn)BS）、青霉素/鏈霉素溶液（ 100× ）購于賽默飛公司，Calcein-AM/PI雙染試劑盒購于東仁化學科技（上海）有限公司，光刻膠SU-82150購于MicroChem公司，CountingKit-8（CCK-8）細胞增殖試劑盒購于UElandy公司，伊立替康（CPT-11）、吉西他濱（LY-188011）均購于美國Selleck公司。

主要儀器：紫外曝光機（SUSSMicroTecMJB4，德國）、臺式勻膠機（SC-1B，中國）、激光共聚焦顯微鏡（CarlZeissLSM900，德國）、酶標儀（TECANMNano，瑞士）。

1.2 微流控芯片的制備

采用autoCAD軟件進行微流控芯片的設計，使用軟光刻方法制作兩層結構的微流控芯片。用第一層光刻基座制作圍欄，見圖1（a）；用第二層光刻微柱陣列模型制作微腔陣列，見圖1（b）。在直徑為 100mm 的硅片拋光面上依次進行勻膠和光刻。首先，通過第一層掩膜版「見圖1（c）對光刻膠進行曝光，顯影后形成基座結構；然后，利用套刻對準系統(tǒng)將第二層掩膜版「見圖1（d）]的微腔結構與基座精確對準，進行二次光刻。

完成陽模制備后，將聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMs）預聚體與固化劑按 10：1 質量比混合，并充分攪拌，經(jīng)真空脫氣后澆注至經(jīng)三甲基氯硅烷疏水化處理后的模具表面，經(jīng) 80^°C 加熱固化 ^2h 后剝離。將剝離得到的PDMS層浸泡在異丙醇中，洗去表面殘留的三甲基氯硅烷，再用去離子水清洗3遍，得到PDMS微流控芯片結構。

1.3 細胞培養(yǎng)

器在芯片的每個大腔室中注入 4μL 消化好的細胞懸液（約含5000個細胞）。將芯片置于培養(yǎng)皿中，在細胞培養(yǎng)箱中靜置 30～45min ，待細胞自然沉降后，向芯片中加入培養(yǎng)基，至沒過整塊芯片。再將芯片置于培養(yǎng)箱（溫度 37^°C ，濕度95% ， CO₂ 體積分數(shù) 5% ）中培養(yǎng)。每隔1d，將芯片內舊的培養(yǎng)基沿微腔邊緣抽出，再注入新鮮培養(yǎng)基進行換液。

小鼠乳腺癌細胞系（4T1）購自美國細胞培養(yǎng)協(xié)會細胞庫，用RPMI1640培養(yǎng)基（按體積分數(shù)添加 10% 胎牛血清、 1% 青霉素和 1% 鏈霉素）在細胞培養(yǎng)瓶（Corning，430641）中進行培養(yǎng)，每隔1d更換1次培養(yǎng)基，每隔3d傳代1次，傳代比例為 1：4 。細胞培養(yǎng)環(huán)境為：溫度 37^°C ！濕度 95% ！ CO₂ 體積分數(shù) 5% 。

1.4芯片中細胞接種

接種細胞前，需將制作完成的PDMS微流控芯片用錫紙包裹，放入壓力鍋進行高溫滅菌（ 0.1MPa ， 120°C ， 20min ）。傳代時，用移液

1.5 細胞熒光染色

腫瘤細胞球在芯片上生長完成后，使用Calcein-AM/PI雙染試劑盒進行細胞染色，染色時間為 30min 。Calcein-AM可進人活細胞，在細胞內酯酶作用下水解產(chǎn)生綠色熒光；PI則不能進入細胞膜完整的活細胞，但可進入膜破損的死細胞并與核酸結合產(chǎn)生紅色熒光。通過檢測綠色熒光（活細胞）和紅色熒光（死細胞）的分布與強度，可區(qū)分細胞存活狀態(tài)及評估化合物或環(huán)境的毒性效應。

1.6 細胞活性實驗

藥物處理后細胞的活性檢測采用CCK-8細胞增殖試劑盒，并利用酶標儀進行陣列掃描，獲得檢測結果。

2 結果與討論

2.1 微流控芯片的設計

為了實現(xiàn)高通量的腫瘤細胞球培養(yǎng)，芯片設計為由多組規(guī)則間隔的微腔組成，其核心設計思路包括：1）培養(yǎng)初期，單個微腔可促進腫瘤細胞快速聚集，這是形成均勻腫瘤細胞球的關鍵；2）微腔為細胞提供穩(wěn)定且獨立的生長環(huán)境，促使細胞排列為規(guī)則陣列；3）通過調控微腔幾何結構及微環(huán)境，可實現(xiàn)對細胞球的多樣化操作。

最終確定，芯片采用直徑為 500μm 的微腔陣列結構，并采用軟光刻的方法進行塑模，見圖2（a）。制作完成后的微流控芯片外觀呈正方形，見圖2（b）。單個微腔直徑為 500μm ，每2個微腔間隔為 50μm ，9個微腔組成一個大的腔室，即構成一個單陣列，如圖2（c）所示。單個陣列為邊長 2mm 的正方形，每2個陣列之間間隔 1mm ，整個芯片由 6×6 個單陣列組成，如圖2（d）所示。每個單陣列包含 3×3 個微腔陣列，整個芯片總計324個微腔，最多可同時對6種不同藥物進行檢測，每種藥物可設置6個濃度梯度。整塊芯片可放在細胞培養(yǎng)皿中進行培養(yǎng)。

2.2芯片中細胞球的培養(yǎng)

實驗選用源于BALB/c小鼠常見的小鼠乳腺癌細胞系4T1，它被廣泛用于研究人類乳腺癌的體外腫瘤模型中。將正常傳代生長的4T1細胞消化后，取部分細胞懸液進行芯片接種。經(jīng)預實驗確定，單個微腔接種細胞數(shù)約為500個。微腔的限域效應可促進細胞快速聚團。接種完成后，通過顯微鏡持續(xù)拍攝以記錄細胞球形成過程，結果如圖3所示。可以看到：接種1h后，細胞完全沉入微腔中；6h后，細胞開始慢慢聚團生長； 15h 后，細胞開始明顯聚團，并形成細胞球體； 48h 后，細胞形成致密腫瘤細胞球，可用于

藥物篩選實驗。

傳統(tǒng)三維細胞培養(yǎng)通常采用包被過的普通細胞培養(yǎng)板或超低吸附圓底培養(yǎng)板，細胞接種后48h 才出現(xiàn)聚團效應，至第4d才形成成熟的腫瘤細胞球。而采用微流控芯片可將腫瘤細胞球形成周期縮短至 15h ，有助于顯著提升高通量藥物篩選效率。

為檢測微腔培養(yǎng) 48h 后細胞的活性，使用Calcein-AM/PI在微腔內對細胞進行染色，染色后的共聚焦熒光顯微鏡成像結果見圖4。可以看到，微腔內腫瘤細胞球直徑約為 200μm 。其中圖4（a）為PI染色結果，顯示有少量細胞核呈紅色熒光；圖4（b）為Calcein-AM染色結果，顯示細胞球形態(tài)完整，僅外圍存在未聚團的零散細胞；圖4（c）為雙染色疊加圖像，微腔內細胞大部分呈綠色熒光，極少量細胞核呈紅色熒光，表明腫瘤細胞球中細胞狀態(tài)良好。

為觀察微腔培養(yǎng)的細胞球體的立體結構，使用激光共聚焦顯微鏡對單個微腔中的腫瘤細胞球進行 z 軸掃描三維重構，掃描間隔 1μm ，總計掃描120層，重構得到的三維模型結構如圖5所示。可觀察到，腫瘤細胞球整體結構完好，細胞存活率大于 95% 。

2.3芯片中藥物篩選

針對小鼠乳腺癌腫瘤細胞球，選用吉西他濱和伊立替康這2種臨床常見的化療藥物進行篩選測試。根據(jù)初篩結果，并參考藥物臨床使用情況[13]，將復篩濃度梯度確定為： 10nmol/L 、100nmol/L ！ 1μmol/L 7 10μmol/L 和 100μmol/L 。

為驗證微流控芯片中藥物篩選結果的可靠性，同時使用96孔板進行4T1細胞的培養(yǎng)及藥物篩選實驗。每個實驗組的樣本量為3個，則1張微流控芯片可同時進行2種藥物5種不同濃度的篩選。

由于所采用的細胞系不同，測試中細胞的死亡情況與文獻報道的結果存在差異。藥物作用^48h 后，使用CCK-8試劑盒進行細胞活性檢測，結果如圖6所示。可以發(fā)現(xiàn)，吉西他濱與伊立替康對細胞的殺傷效果存在濃度依賴性，且

4T1細胞對吉西他濱相對敏感，在低濃度組即出現(xiàn)細胞死亡，而伊立替康只在高濃度時表現(xiàn)出明顯的細胞抑制作用。化療藥物對腫瘤細胞的抑制作用存在選擇性，這與Lopez等[14]的報道結果一致。由于腫瘤細胞球具有致密性，藥物對其殺傷效果較在96孔板中培養(yǎng)的二維細胞更弱，即腫瘤細胞球存活率更高。該現(xiàn)象符合文獻研究結果[9]，同時也證實了三維細胞球模型能更好地模擬腫瘤在體內的真實狀況。

3結論

本文通過軟光刻的方法，制作了一種可用于腫瘤細胞高效藥物篩選的微流控芯片，通過微腔陣列的微孔結構，促進腫瘤細胞的快速聚團生長。傳統(tǒng)的二維永生化或原代單層細胞系不能反映體內組織的異質性結構，而芯片培養(yǎng)的方法可以克服這些限制，形成更接近人體環(huán)境的腫瘤細胞球體結構。原有三維細胞培養(yǎng)耗時較長，從細胞接種到形成致密細胞球通常需要4d。且基于96孔板或384孔板的藥物篩選涉及繁瑣的細胞接種與加藥操作，且在大規(guī)模藥物篩選測試時，消耗的試劑與細胞量較多。本文設計的微流控芯片制作成本低，細胞用量少，能同時進行多種藥物的篩選。且每個單陣列中的9個微腔可同時進行細胞接種與加藥，單個陣列中不同微腔間的環(huán)境高度相似。微腔結構的設計有利于腫瘤細胞快速形成致密性的三維細胞球結構。單次實驗中，1張芯片可設計用于6種藥物6個濃度梯度的篩選。本文選取了2種臨床常見的化療藥物進行藥物篩選測試，效果良好，證實了該芯片可用于藥物篩選。

與現(xiàn)有技術相比，本文設計存在幾個關鍵優(yōu)勢：快速形成的腫瘤細胞球更適合用于藥物篩選；減少了培養(yǎng)試劑與藥物試劑的消耗；在進行大規(guī)模藥篩時，極大程度地減少了細胞培養(yǎng)與藥物篩選所需的時間。后續(xù)可進一步探究不同的微腔環(huán)境，以更好地模擬人體內結構和環(huán)境。微腔陣列芯片為快速細胞培養(yǎng)和藥物篩選提供了一個重要的平臺，在腫瘤細胞藥物篩選方面具有廣闊的應用前景。

參考文獻：

[1]XIA C F， DONG X S，LI H， et al. Cancer statistics in China and United States，2022：profiles，trends，and determinants[J]. Chinese Medical Journal，2022， 135（5）： 584-590.

[2]SIEGEL RL，MILLER K D，F(xiàn)UCHS HE，et al. Cancer statistics， 2022[J]. CA：A Cancer Journal for Clinicians，2022， 72（1）： 7-33.

[3]IMAMURA Y， MUKOHARA T， SHIMONO Y， et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drugtesting platforms in breast cancer[J]. Oncology Reports， 2015， 33（4）： 1837 - 1843.

[4]FANG Y，EGLEN R M.Three-dimensional cell cultures in drug discovery and development[J]. SLAS Discovery，2017，22（5）： 456- 472.

[5]SCHUSTER B，JUNKIN M， KASHAF S S，et al： Automated microfluidic platform for dynamic and combinatorial drug screening of tumor organoids[J]. Nature Communications，2020，11（1）： 5271.

[6]VINCI M， GOWAN S， BOXALL F， et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation[J]. BMC Biology， 2012， 10： 29.

[7]JUNG D J， SHIN T H， KIM M，et al. A one-stop microfluidic-based lungcancerorganoid culture platform for testing drug sensitivity[J]. Lab on A Chip， 2019，19（17）： 2854- 2865.

[8]GRACZ AD，WILLIAMSON IA，ROCHEKC， et al. A high-throughput platform for stem cell niche cocultures and downstream gene expression analysis[J]. Nature Cell Biology，2015，17（3）： 340-349.

[9]KARLSSON H， FRYKNAS M， LARSSON R， et al. Loss of cancer drug activity in colon cancer HCT-116 Cells during spheroid formation in a new 3-D spheroid cell culture system[J]. Experimental Cell Research， 2012，318（13）： 1577- 1585.

[10]GUMUSCU B， ALBERS H J， VAN DEN BERG A， et al.Compartmentalized 3D tissue culture arrays under controlled microfluidic delivery[J]. Scientific Reports， 2017， 7（1）： 3381.

[11]BAPTISTA D， BIRGANI Z T， WIDOWSKI H， et al. Polymer film-based microwell array platform for longterm culture and research of human bronchial organoids[J]. Materials Today Bio，2023，19： 100603.

[12]BRANDENBERGN，HOEHNELS，KUTTLERF，et al.High-throughput automated organoid culture via stem-cell aggregation in microcavityarrays[J].Nature Biomedical Engineering，2020，4（9）：863-874.

[13]SHI X H， LI Y G，YUANQ Y，et al.Integrated profilingofhuman pancreatic cancer organoidsreveals chromatin accessibility features associated with drug

sensitivity[J]. Nature Communications， 2022，13（1）： 2169.

[14]LOPEZ J S， BANERJI U. Combine and conquer： challenges for targeted therapy combinations in early phase trials[J]. Nature Reviews Clinical Oncology， 2017，14（1）： 57-66.

（編輯：李曉莉）