吳茱萸湯對酒精性胃潰瘍的影響及其機制

[摘要］目的探討吳茱萸湯對酒精性胃潰瘍的影響及其機制。方法將雌性8周齡KM小鼠120只，隨機分為正常對照組（A組）、模型對照組（B組）、雷尼替丁組（C組）和吳茱萸湯低、中、高劑量組（D、E、F組），每組各 20只。A組和B組小鼠灌胃常溫蒸餾水 （10mL/kg） ，C組灌胃雷尼替丁（ 30mg/kg） ！ D～F 組灌胃吳茱萸湯湯劑（5、10.20mL/kg） ，持續灌胃7d后從 A～F 組小鼠中各抽取10只小鼠腹主動脈全血無菌分離血清后用于細胞實驗，其余小鼠繼續灌胃蒸餾水或各藥物持續 21d 。分別于第7、14、21、28天時觀察并記錄各組小鼠的體質量和進食量。第 29天時，收集各組小鼠血清、胃液和胃組織，肉眼觀察各組小鼠胃組織的形態，通過 HE染色觀察胃黏膜組織病理學變化，檢測胃液體積、 pH 值和總酸度;通過ELISA法檢測小鼠血清IL-6、IL-1O、TNF- α 和PGE2水平；通過WB實驗檢測小鼠胃黏膜組織中PI3K/Akt/NF- κB 信號通路相關蛋白的表達；通過生化指標檢測評估各組小鼠胃黏膜組織中MDA、CAT、SOD和GSH- ?Px 水平。將人胃黏膜上皮細胞（GES-1）分為 a1～e1 組和 a2～f2 組，其中a1～e1 組細胞分別加入A、C、D、E、F組小鼠無菌血清； b2～f2 組細胞經 0.8mol/L 乙醇處理， a2 組細胞加入等體積PBS， 后 a2～f2 組分別加入 A～F 組小鼠無菌血清，通過CCK-8法檢測各組細胞活力。結果動物實驗結果顯示，與B組相比， c～F 組小鼠在不同時間點體質量均顯著升高，胃黏膜組織充血水腫、點狀潰瘍和炎性細胞浸潤情況均有不同程度改善，胃液體積和總酸度均顯著降低， pH 值顯著升高，血清IL-6、TNF- α?α∝ 、PGE2水平和胃黏膜組織 p -AKT/AKT比值、MDA水平均顯著降低，血清IL-1O 水平和胃黏膜組織 SOD、GSH- ?Px 水平顯著升高;C、E、F組小鼠在第14、21、28天進食量均顯著升高，胃黏膜組織中核內P65/胞漿P65 比值顯著降低;C、E組小鼠胃黏膜組織CAT水平顯著升高； D～F 組胃黏膜組織中 p -PI3K/PI3K比值顯著降低；E、F組小鼠胃黏膜組織中 p-IκBα/IκBα 比值顯著升高 （F=3.4～1 013.0，q=4.1～78.7，Plt;0.05） 。CCK-8實驗結果顯示，各時間點 c1～e1 組與al組相比細胞活力均無顯著性差異（ ΔPgt;0.05Δ ，培養第12、24、48小時時 c2～f2 組細胞活力均顯著高于b2組 146.1，q=4.6～22.3，Plt;0.05） 。結論吳茱萸湯對酒精性胃潰瘍具有保護作用，其機制可能與調節胃黏膜細胞PI3K/Akt/NF- ?κB 信號通路和炎癥因子水平以及抑制其氧化應激水平有關。

[中圖分類號] R573.1 [文獻標志碼] A

Effect of Wuzhuyu Decoction on alcoholic gastric ulcer and its mechanism GAO Ruiyang ，LI Jing yao ， LI Pingxiang，GE Keli（Qingdao Medical College，Qingdao University，Qingdao 266073，China）

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the efect of Wuzhuyu Decoction（WZYD）on alcoholic gastric ulcer and its mechanism. MethodsA total of120 female KM mice，aged 8 weeks，were randomly divided into normal control group（group A），model control group （group B），ranitidine group（group C），and low-， midle-，and high-dose WZYD groups （groups D ?-? F），with20 mice in each group. The mice in groups A and B were given distilled water （ 10mL/kg at room temperature by gavage，thosein group C were given ranitidine （30mg/kg ）by gavage，and those in groups D -F were given WZYD by gavage at a dose of 5，10，and 20mL/kg ，respectively. After 7 consecutive days of intragastric administration，10 mice were selected from each group，andserumwascollctedunderasepticconditionsfrcellexperiments，andtheremainingmicewerestillgivendistilldwaterorthedrugbygavageforanother21days.Bodyweightandfoodintakeofthe miceineachgroupwererecordedondays7，14，21，and 28.Onday29，serum，gastric juice，and gastrictisue samples werecolected;gastric morphology wasobserved withthenaked eye，andHEstainingwasusedtoobservethe histopathologicalchangesofgastric mucosa;thevolume，pHvalue，andtotalacidityof gastricjuice were measured；ELISA was used to measure the serum levels of IL-6，IL-1O，TNF- α ，and PGE2；Western blot（WB）wasused to measure the expression of PI3K/Akt/NF- κB pathway-related proteins in gastric mucosa；biochemical assays were used tomeasure the levels of MDA，CAT，SOD，and GSH- ?Px in gastric mucosa. Human gastric mucosal epithelial cells （GES-1） were divided into groups al-el and a2-f2 . The cels in groups al一el were treated with the aseptic serum from groups A，C，D，E，andF，respectively. The cells in groups b2-f2 were treated with 0.8mol/L ethanol，while those in group a2 were treated with an equalvolume of PBS；after 4 hours of treatment，the cells in groups a2-f2 were treated with the aseptic serum from groups A-F . CCK8 assay was usedto measurecellviabilityineach group.ResultsThe animal experiment showedthatcompared with groupB， groups C-F had a significant increase in body weight at different time points，along with varying degrees of improvements in congestion，edema，punctate ulcers，and inflammatory cell infiltration ofgastric mucosa，significantreductionsinthevolumeandtotalacidityofgastricjice，asignificantinreaseinthepHvalueofgastric juice，significant reductions in the serum levels of IL-6，TNF- α ， and PGE2 and p-AKT/AKT ratio and MDA level in gastric mucosal tissue，and significant increases in the serum level of IL-1O and the levels of SOD and GSH- .Px in gastric mucosa; groups C，E， andFhadasignifcantincreaseinfoodintakeondays14，21，and28andasignificantreductionintheratioofP65inthenucleus to P65in the cytoplasm；groups Cand Ehadasignificant increase in the level ofCAT in gastric mucosal tissue;groups D F had asignificantreductioninp-PI3K/PI3Kratioingastricmucosal tssue;groupEandFhdasignificantincreaseinp-IBa/IBaratio in gastric mucosal tissue ?F=3.4-1 013.0，q=4.1-78.7，Plt;0.05） . CCK-8 assay showed that there was no significant difference in cell viability between groups c1-e1 and group al at any time point （ Pgt;0.05） ，and groups c2-f2 had a significantly higher cell viability than group b2 at 12，24，and 48 hours of culture （F=15.5-146.1，q=4.6-22.3，Plt;0.05） .ConclusionWZYD can exert a protective effect against alcoholic gastric ulcers by modulating the PI3K/Akt/NF- κB signaling pathway，regulating inflammatory cytokines，and inhibiting oxidative stress.

[KEY WORDs]Stomach ulcer;Wuzhuyu Decoction；Qxidative stress；Phosphatidylinositol 3-kinases；Proto-oncogene pro teins c-akt；NF-kappa B; Signal transduction

酒精性胃潰瘍是一種由過度飲酒引起的胃黏膜病理性損害[]。胃黏膜組織暴露于高濃度乙醇中會發生氧化應激及炎癥反應[2]，實驗動物口服乙醇可引起胃部急性病變和潰瘍[3]。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路能夠調節細胞中多種基因轉錄和細胞因子表達，從而參與機體免疫反應及細胞的分化、增殖和凋亡[4]。核因子 κB（NF- κB 是Akt下游的關鍵轉錄因子，被激活的Akt能夠通過調控 激酶（IKK）等 NF-κB 信號通路相關分子，提高 NF-κB 的轉錄活性并啟動目標基因轉錄[5]。研究表明，吳茱萸湯對脾胃虛寒型和幽門結扎型胃潰瘍具有治療作用[6-7]，但其對酒精性胃潰瘍的作用及機制尚未可知。本研究通過建立乙醇誘導的小鼠胃潰瘍模型和人胃黏膜上皮細胞損傷模型，探究吳茱萸湯對酒精性胃潰瘍的保護作用及其機制，旨在為吳茱萸湯的臨床應用提供理論參考。現將結果報告如下。

1材料和方法

1.1 實驗材料

吳茱萸湯湯劑由青島市海慈醫院中藥制劑室提供。雷尼替丁膠囊購自石藥集團歐意藥業有限公司（國藥批號：H13021317）。無水乙醇（20220607）購自國藥集團化學試劑有限公司，RPMI-1640培養基（R8758）購自美國Sigma公司，PBS（SH30256）購自美國HyClone公司、 0.25% 胰蛋白酶（25200072）購自美國Gbico公司，胎牛血清（04-001-1ACS）購自以色列BI公司，CCK-8試劑盒（40203ES60）以及BCA檢測試劑盒（20201ES76）購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司，腫瘤壞死因子 α（TNF-α） ）血清白細胞介素-6（IL-6）、前列腺素（PGE2）、IL-1OELISA檢測試劑盒（ab181421、ab22503、ab287802、ab185986）購自英國Abcam公司，丙二醛（MDA）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）活性和細胞漿蛋白與核蛋白抽提試劑盒（S0131S、S0131S、S0101S、P0028）均購買于上海碧云天生物技術有限公司，谷胱甘肽過氧化物酶（ ΔGSH-Px 檢測試劑盒（GL2098）購自北京百奧萊博科技有限公司，山羊抗兔IgG、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、IκBα、p-IκBα及p65抗體（3900S、4288、4292、9272、4060、2682、2078、6956）購買于美國CST公司。人胃黏膜上皮細胞（GES-1）（YB-71563HC）購自鈺博（上海）生物技術股份有限公司。

1.2 動物分組及處理

SPF級健康雌性KM小鼠120只，8周齡，體質量為 （23±5）g ，飼養于青島大學實驗動物中心， 12h 晝夜循環光照，溫度 25^°C ，濕度 75% 。適應性飼養1周后，將60只小鼠隨機平均分為 A～F 組，每組20只。小鼠每日給藥劑量根據文獻8和藥理實驗當中小鼠與人體等效劑量換算公式計算，正常對照組（A組）以及模型對照組（B組）灌胃常溫蒸餾水 （10mL/kg ；雷尼替丁組（C組）灌胃雷尼替丁（ 30mg/kg ，溶于生理鹽水）；吳茱萸湯低、中、高劑量組（D、E、F組）分別灌胃吳茱萸湯湯劑（5、10、20mL/kg ），各組小鼠均每天灌胃2次，持續 ^7d 。從 A～F 組小鼠中各抽取10只小鼠，腹主動脈采集全血，靜置 30min 后，于 4^°C 下 3000r/min 離心10min ，無菌分離血清，用于細胞實驗；其余小鼠繼續進行造模，從第8天開始， B～F 組小鼠每天灌胃藥物或蒸餾水 ¹h 后再灌胃體積分數0.56的乙醇溶液 （7mL/kg） ，A組再灌胃等劑量的生理鹽水，持續 21d 。分別于處理第7、14、21、28天時記錄各組小鼠體質量和進食量。每日進食量 每籠小鼠每日食物總攝入量/籠內小鼠數量。上述處理結束后，各組小鼠禁食不禁水 24h 后稱取體質量，腹腔注射1% 戊巴比妥鈉 （40mg/kg） 麻醉后，腹主動脈采集全血并無菌分離血清， -80°C 保存。打開小鼠腹腔，結扎賁門，摘取全胃，擦凈血跡后沿胃大彎剪一小口，將胃液傾倒于刻度離心管中，沿胄小彎切取新鮮胃黏膜組織， -80°C 保存用于后續生化指標檢測以及WB實驗。分離各組小鼠胃黏膜組織，置于4% 多聚甲醛中室溫固定 24h ，用于后續蘇木精-伊紅（HE）染色。

1.3各組小鼠胃液體積 ?pH 值和總酸度檢測

使用量筒測量各組小鼠胃液體積，并使用 pH 試紙檢測 pH 值。將各組小鼠胃液置于低溫離心機中 1500r/min 離心 10min ，取上清液 1mL ，加酚紅指示劑1滴， 0.01mol/LNaOH 溶液滴定，直至胃液先呈黃色后轉為紅色 2s 內不消失，以期間消耗的 ΔNaOH 溶液體積計算胃液總酸度。胃液總酸度 溶液濃度 x 消耗的NaOH溶液體積/胃液體積。

1.4各組小鼠胃黏膜組織形態學及HE染色觀察

觀察并拍攝各組小鼠胃組織形態、胃黏膜表面潰瘍的大小和深淺。取各組小鼠以 4% 多聚甲醛固定的胃黏膜組織標本，沿胃大彎處切開并用生理鹽水洗凈，體積分數0.95乙醇脫水，二甲苯處理，石蠟包埋，切成 3μm 厚的切片，進行HE染色，于光學顯微鏡下觀察并拍照，

1.5 ELISA法檢測各組小鼠血清炎癥因子水平

取各組小鼠血清樣本，按照相應ELISA試劑盒 說明書檢測血清中炎癥因子IL-6、IL-1O、TNF- ?α 和 PGE2水平。

1.6WB實驗檢測各組小鼠胃黏膜組織中各蛋白的表達

分別用細胞漿蛋白與核蛋白抽提試劑盒提取各組小鼠胃黏膜組織中的蛋白質，BCA試劑盒法檢測蛋白質濃度，電泳分離蛋白，濕轉至PVDF膜上并進行封閉。分別加入p-PI3K、PI3K、AKT、p-AKT、IκBα?p-IκBα?1 p65 一抗（均為 1：1 000? 于 4^°C 下振蕩孵育 12h 后洗膜，加入二抗 （1：5000） 室溫下振蕩孵育 ¹h 后洗膜，ECL顯色液避光顯影，ImageJ軟件計算各蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內參計算目的蛋白相對表達水平。

1.7各組小鼠胃黏膜組織生化指標的檢測

將各組小鼠胃黏膜組織按照相應的試劑盒說明書制備為組織勻漿，并且檢測MDA、CAT、SOD和GSH- ?Px 水平。

1.8 CCK-8法檢測各組小鼠血清對GES-1細胞活力的影響

GES-1細胞接種于含 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-鏈霉素的RPMI-164O培養基中，置于 37^°C 、含體積分數 0.05CO₂ 、相對濕度 90% 的培養箱中培養，取對數生長期細胞接種于96孔板（5000個/孔）中，分為 al～f1 組和 a2～f2 組，每組設3個復孔。a1～e1 組細胞培養基中分別加入A、C、D、E、F組小鼠無菌血清。 b2～f2 組細胞經 0.8mol/L 乙醇處理 組加入等劑量PBS處理 ；隨后，a2組細胞加入A組小鼠血清，b2組細胞加入B組小鼠血清，c2組細胞加入C組小鼠血清， d2～f2 組細胞分別加人 D～F 組小鼠血清。上述各組細胞中加入的各組小鼠血清占比均為 10% 。各組細胞置于 、含體積分數 0.05CO₂ 、相對濕度 90% 的培養箱中培養，分別在培養 12、24、48h 后按照CCK-8試劑盒說明書進行操作，使用酶標儀檢測 450nm 波長下各組吸光度值并計算細胞活力。細胞活力 （對照組吸光度值一實驗組吸光度值）/對照組吸光度值，其中al、a2組為對照組。

1.9 統計學處理

采用GraphPadPrisim1O軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以 表示，多組間的比較采用單因素方差分析，多個時間點組間比較采用重復測量設計的方差分析，進一步兩兩比較采用Tukey檢驗。以 Plt;0.05 為差異有統計學意義。

2結果

2.1各組小鼠體質量和進食量比較

重復測量設計的方差分析顯示，分組、時間及分組與時間的交互作用對各組小鼠體質量和進食量均有明顯影響 （ F時間= 1 0 . 1 ， 3 . 8 ， F分組 = 4 6 1 . 1 ， 5 1 . 4 "F_交互=67.0，6.4，Plt;0.05） 。各組小鼠在不同時間點的體質量比較差異均有顯著性 ?F=9.1～383.6 Plt;0.05） ；進一步兩兩比較結果顯示， C～F 組小鼠在不同時間點的體質量均顯著高于B組 （q=5.0～ 43.2，Plt;0.05），E，F 組小鼠在第21、28天的體質量顯著高于D組 （q=17.1～32.7，Plt;0.05） 。各組小鼠在第14、21、28天時的進食量比較差異均有顯著性 （F=12.6～70.7，Plt;0.05） ；進一步兩兩比較結果顯示，C、E、F組小鼠在第14、21、28天進食量均顯著高于B組 （q=4.1～13.0，Plt;0.05），E.F 組小鼠在第14、21、28天的進食量顯著高于D組 （q=4.5～ 9.9，Plt;0.05） 。見表1、2。

2.2各組小鼠胃黏膜組織形態學及其各評價指標比較

A組小鼠胃黏膜組織未見黏膜充血水腫和潰瘍性改變，B組小鼠胃黏膜組織有明顯黏膜充血水腫和片狀紅斑， C～F 組小鼠胃黏膜組織充血水腫和點狀潰瘍均有不同程度改善，其中F組較 C～E 組病變程度更輕。見圖1。HE染色結果顯示，A組胃黏膜組織沒有明顯的損傷，形態結構完整，腺體排列緊密規則，輪廓清晰，黏膜表面胃小凹清晰可見，未見細胞脫落、壞死等現象。與A組相比，B組小鼠胃黏膜組織損傷嚴重，深層黏膜層發生嚴重出血和破壞，炎性細胞大量浸潤，腺體排列紊亂，黏膜上皮細胞大量壞死、脫落，損傷深度達胃黏膜全層。與B組相比，D組和E組小鼠胃黏膜組織炎性細胞浸潤減少，黏膜下輕度水腫和白細胞浸潤，胃黏膜層的破壞程度較輕；C組和F組小鼠胃黏膜損傷顯著改善，腺體結構完整，腺體排列緊密規則，無炎性細胞浸潤現象。見圖2。

2.3各組小鼠胃液相關評價指標比較

各組小鼠的胃液體積、 pH 值和總酸度比較差異均具有顯著性 （F=26.4～70.6，Plt;0.05） 。與A組相比，B組小鼠胃液體積和總酸度顯著升高， pH 值顯著降低 （q=13.3～22.2，Plt;0.05） 。與B組相比， C～F 組的胃液體積和總酸度均顯著降低（ 4.9～21.0，Plt;0.05），pH 值均顯著升高 _（q=5.0～ 14.2，Plt;0.05） 。與D組相比，E、F組小鼠胃液體積顯著降低，F組小鼠胃液總酸度顯著降低、 pH 值顯著升高 （q=6.6～14.2，Plt;0.05） 。與C組相比，F組小鼠胃液體積顯著性降低、 pH 值顯著升高（ ?_?q= 7.1～8.2，Plt;0.05） ，胃液總酸度無顯著性差異（ ??Pgt; 0.05）。見表3。

表1 A～F 組小鼠體質量比較

表2 A～F 組小鼠每日進食量比較

A～F 分別代表 A～F 組，紅色箭頭表示深層黏膜層嚴重出血和破壞，藍色箭頭表示黏膜下充血、水腫，黃色箭頭表示炎性細胞浸潤，黑色箭頭顯示上皮和黏膜層的組織學結構完整;HE染色，A、D：1O0倍，B、E、F：4OO倍，C：40倍

2.4各組小鼠血清中各炎癥因子水平比較

各組小鼠血清 IL-6，TNF-α，IL-10 及PGE2水 平比較均有顯著差異 （F=46.6～667.2，Plt;0.05） 。 與A組相比，B組小鼠血清中 IL-6.TNF-α 和PGE2 水平顯著升高，而IL-1O水平顯著降低 （q=20.0～ 78.7，Plt;0.05） 。與B組相比， c～F 組小鼠血清 IL-6.TNF-α 和PGE2水平均顯著降低，IL-1O水平 顯著升高 （q=6.5～44.4，Plt;0.05） ;與D組相比， E、F組小鼠血清 IL-6.TNF-α 和PGE2水平均顯著 降低，F組小鼠血清IL-1O水平顯著升高 （q=4.9～ 23.7，Plt;0.05） ；與C組相比，F組小鼠血清IL-6和 PGE2水平顯著降低，而IL-1O水平顯著升高（ ?_q=6.1～20.0，P＜0.05）， α 水平則無顯著性差異（ （Pgt;0.05） 。見表4。

2.5各組小鼠胃黏膜組織中PI3K/Akt/NF- κB 信號通路相關蛋白表達水平比較

各組小鼠胃黏膜組織p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT，p-IκBα/IκBα 、核內P65/胞漿P65比值均有顯著性差異 'F=50.9～1013.0，Plt;0.05） 。與A組相比較，B組小鼠胃黏膜組織p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT以及核內P65/胞漿 P65 比值均顯著升高， p^- IκBα/IκBα 比值顯著降低 （q=6.8～74.8，Plt;0.05） 。與B組相比較， D～F 組小鼠胃黏膜組織 p-PI3K/ PI3K比值顯著降低，C、E、F組小鼠胃黏膜組織 p^- AKT/AKT、核內P65/胞漿P65比值顯著降低（ 6.8～46.5，Plt;0.05），E.F 組小鼠胃黏膜組織中 p^- IκBα/IκBα 比值顯著升高 （q=4.5～16.5，Plt;0.05） 。與D組相比，E、F組小鼠胃黏膜組織中 p-PI3K/ PI3K、p-AKT/AKT和核內P65/胞漿P65比值顯著降低，E組小鼠胃黏膜組織 p-IκBα/IκBα 比值顯著升高 （q=9.0～57.3，Plt;0.05） 。與C組相比，F組小鼠胃黏膜組織 p -PI3K/PI3K、p-AKT/AKT和核內P65/胞漿P65比值顯著降低， p-IκBα/IκBα 比值則顯著升高 （q=7.8～35.6，Plt;0.05） 。詳見圖3、表5。

2.6各組小鼠胃黏膜組織中氧化應激標志物水平比較

各組小鼠胃黏膜組織氧化應激標志物MDA、CAT、GSH- ?Px 及SOD水平比較均具有顯著性差異（F=75.6～146.8，Plt;0.05） 。與A組相比，B組小鼠胃黏膜組織MDA水平顯著升高，CAT、GSH-Px及SOD水平顯著降低 （q=20.1～40.2，Plt;0.05） 。與B組相比， C～F 組小鼠胃黏膜組織MDA水平顯著降低，SOD和GSH- ?Px 水平顯著升高（ _（q=4.3～ 27.2 ：，Plt;0.05 ，C、E組小鼠胃黏膜組織CAT水平顯著升高 （q=4.4～6.0，Plt;0.05） 。與D組相比，E、F組小鼠胃黏膜組織MDA水平顯著降低，GSH-Px 水平顯著升高 （q=7.7～19.2，Plt;0.05），F 組小鼠胃黏膜組織SOD水平顯著升高，CAT水平顯著降低 （q=7.1～9.1，Plt;0.05） 。與C組相比，F組小鼠胃黏膜組織 GSH-Px 水平顯著性升高，MDA和CAT水平顯著降低 （q=5.3～12.0，Plt;0.05） ，SOD水平無顯著性差異 （Pgt;0.05） 。見表6。

2.7 各組細胞活力比較

重復測量設計的方差分析顯示，時間、分組及分組與時間的交互作用對于 a1～e1 組和 a2～e2 組的細胞活力均具有明顯的影響 （F_#fifi=715.1，192.6 F₃₄₄=25.3，144.4，F₃₄₄=3.4，6.9，Plt;0.05） 。 a1～ e1組細胞在不同時間點的細胞活力均有顯著性差異 （F=176.0～200.3，Plt;0.05） ;進一步兩兩比較結果顯示，在第12、24、48小時時，與a1組相比，b1組細胞活力顯著降低 （q=5.8～11.6，Plt;0.05），cl～ el組細胞活力均無顯著差異 （Pgt;0.05） 。 a2～f2 組在不同時間點的細胞活力均有顯著性差異（ F= 15.5～146.1，Plt;0.05） ；進一步兩兩比較結果顯示，在第12、24、48小時時，與a2組相比，b2組細胞活力顯著降低 （q=12.2～23.8，Plt;0.05） ；與b2組相比， c2～f2 組的細胞活力均顯著升高（ q=4.6～ 22.3，Plt;0.05） 。見表7、8。

3討論

胃潰瘍屬中醫“胃皖痛”范疇[9]，主要病因為非甾體抗炎藥的過量使用、幽門螺桿菌感染以及過量飲酒等[10]。乙醇會導致胃黏膜上皮細胞壞死[11]和黏膜下血管內皮損傷[12]，并引起局灶性潰瘍、胃黏膜水腫和炎性細胞浸潤[13]。目前臨床上用于治療胃潰瘍的藥物主要包括抗酸劑、胃黏膜保護劑和抗生素，這些藥物能在一定程度上緩解癥狀，但復發率較高，并伴有不同程度的副作用，因此需要尋找療效更好、副作用更少的新藥物。吳茱萸湯方劑出自于漢代張仲景的《傷寒論》與《金匱要略》二書[14]，由吳朱臾、生姜、人參、大棗四味中約組成，具有\"溫中補虛、降逆止嘔\"之功效，主要用于治療嘔吐、頭痛等疾病。韓蓁等[15]研究發現，吳茱萸湯在常規藥物治療脾胃虛寒型胃潰瘍中具有增效作用；張明發等[16]研究結果顯示，吳茱萸水煎劑具有治療鹽酸性胃潰瘍和消炎痛加乙醇性胃潰瘍的作用；此外，吳茱萸湯中的活性成分吳茱萸次堿對由乙酰水楊酸和水浸應激引起的小鼠胃黏膜損傷具有保護作用[17。本研究通過建立乙醇誘導的小鼠胃潰瘍模型和人胃黏膜上皮細胞損傷模型，探究吳茱萸湯對酒精性胃潰瘍的保護作用及其機制。動物實驗結果顯示， C～F 組小鼠在不同時間點的體質量和C、E、F組小鼠在第14、21、28天的進食量均顯著高于B組；其中E、F組小鼠在第21、28天的體質量和第14、21、28天的進食量顯著高于D組。與B組相比， C～F 組小鼠胃黏膜組織充血水腫、點狀潰瘍和炎性細胞浸潤情況均有不同程度的改善，胃液體積和總酸度均顯著降低，pH值顯著升高；其中，F組小鼠胃黏膜形態學損傷的改善程度較 C～E 組更為顯著。與D組相比，E、F組小鼠胃液體積顯著降低，F組小鼠胃液總酸度顯著降低、pH值顯著升高；與C組相比，F組小鼠的胃液體積顯著降低， pH 值顯著升高。這些結果提示，吳茱萸湯可緩解乙醇誘導的胃潰瘍模型小鼠胃黏膜損傷，且高劑量吳茱萸湯的療效明顯優于陽性藥物雷尼替丁和低、中劑量吳茱萸湯。此外，本研究在體外探討了吳茱萸湯處理后小鼠的含藥血清對GES-1細胞的作用，目的在于保留藥物代謝活性成分，以更真實地模擬體內藥效環境[18]。結果顯示，在第12、24、48小時時，b1組細胞活力與a1組相比顯著降低， c1～e1 組細胞活力均無顯著差異；b2組細胞活力與a2組相比顯著降低， c2～f2 組的細胞活力與b2組相比均顯著升高，提示吳茱萸湯具有保護乙醇誘導的GES-1細胞損傷的作用，并且無明顯細胞毒性。上述研究表明，吳茱萸湯對于胃黏膜損傷和對酒精性胃潰瘍具有保護作用，但具體機制有待進一步探究。

炎癥反應在胃潰瘍的發生發展中發揮重要作用。PI3K/Akt信號通路通過調控細胞內基因轉錄程序及細胞因子表達網絡，在免疫應答、細胞增殖與凋亡等生物學過程中發揮關鍵作用[4]。 NF-κB 信號通路在炎癥反應急性期發揮重要調控作用，其通過介導細胞中多種炎癥相關基因的表達參與胃黏膜損傷進程[6，19]。研究表明， NF-κB 作為Akt關鍵下游轉錄因子，其轉錄活性的恢復依賴于Akt的激活[6。當該通路被激活時，活化的 NF-κB 會發生核轉位，進而調控細胞中IL-6、TNF- α 等促炎細胞因子基因的轉錄表達[20]。IL-6和TNF- α 主要由活化的單核細胞、肥大細胞及巨噬細胞分泌，其血清濃度與胃炎嚴重程度呈顯著正相關[21-23]。IL-10 作為關鍵性抑炎因子，可通過負反饋機制調節細胞促炎因子水平，其表達水平可作為評估機體炎癥反應強度的重要指標[24-25]。PGE2可通過抑制促炎介質生成及促進黏膜修復等作用參與胃黏膜屏障穩態維持。研究表明，使用特異性抑制劑阻斷細胞內 NF-κB 信號通路從而抑制促炎因子的釋放能夠顯著改善胃黏膜病理損傷[6]。本研究結果顯示，與B組相比， C～ F組小鼠血清 IL-6.TNF-α 和PGE2水平和胃黏膜組織p-AKT/AKT均顯著降低、血清IL-1O水平顯著升高，C、E、F組小鼠胃黏膜組織中核內P65/胞漿P65 比值顯著降低， D～F 組小鼠胃黏膜組織 p-PI3K/PI3K比值顯著降低，E、F組小鼠胃黏膜組織p-IκBα/IκBα 比值顯著升高;與D組相比，E、F組小鼠血清IL-6、TNF- α 、PGE2水平和胃黏膜組織 p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、核內P65/胞漿P65比值均顯著降低;F組小鼠血清IL-1O水平顯著升高；E組小鼠胃黏膜組織 p-IκBα/IκBα 比值顯著升高；與C組相比，F組小鼠血清IL-6、PGE2水平和胃黏膜組織p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、核內P65/胞漿P65比值顯著降低，血清IL-1O水平和胃黏膜組織 p-IκBα/IκBα 比值顯著升高。上述結果提示，吳茱萸湯可能通過調控PI3K/Akt/NF- ?κB 信號通路調節炎癥因子水平，進而發揮對酒精性胃潰瘍的保護作用，且高劑量吳茱萸湯的作用明顯優于陽性藥物雷尼替丁和低、中劑量吳茱萸湯。

氧化應激與乙醇誘導的胃黏膜損傷密切相關，高濃度乙醇暴露可引發胃黏膜組織內活性氧的爆發性生成，促進脂質、蛋白質及DNA的氧化修飾，進而誘發黏膜屏障功能障礙和細胞程序性死亡[26-27]研究表明，靶向補充抗氧化劑可逆轉細胞內的氧化炎癥級聯反應，可成為酒精性胃損傷防治的新方向[28-29]。MDA是脂質過氧化終產物，其蓄積提示細胞膜結構破壞，而CAT、SOD及 GSH-Px 活性下降則反映抗氧化系統衰竭[30]。本研究結果顯示，與B組相比， C～F 組小鼠胃黏膜組織MDA水平顯著降低，SOD和 GSH-Px 水平顯著升高，C、E組小鼠胃黏膜組織CAT水平顯著升高；與D組相比，E、F組小鼠胃黏膜組織MDA水平顯著降低， GSH-Px 水平顯著升高，F組小鼠胃黏膜組織SOD水平顯著升高；與C組相比，F組小鼠胃黏膜組織GSH- ?Px 水平顯著升高，MDA和CAT水平顯著降低。上述結果提示，吳茱萸湯可能通過抑制氧化應激，進而發揮對酒精性胃潰瘍的保護作用，且高劑量吳茱萸湯的作用明顯優于陽性藥物雷尼替丁和低、中劑量吳茱萸湯。

綜上所述，吳茱萸湯對酒精性胃潰瘍具有保護作用，其機制可能與其調節胃黏膜細胞PI3K/Akt/NF-κB 信號通路和炎癥因子水平以及抑制其氧化應激水平有關。本研究為吳茱萸湯治療酒精性胃潰瘍的臨床應用提供了理論依據，有利于該治療方法的進一步推廣和應用。

倫理批準和動物權利聲明：本研究涉及的所有動物實驗均已通過青島大學附屬海慈醫院醫學倫理委員會的審核批準（文件號2021HC-12LZ018）。所有實驗過程均遵照《實驗動物福利倫理審查指南》的條例進行。

作者聲明：高瑞陽、葛科立、李平香參與了研究設計；高瑞陽、葛科立、李景堯參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

[參考文獻]

[1]LIUBH，FENGXX，ZHANGJ，etal.Preventive effectof Anji white tea flavonoids on alcohol-induced gastric injury through their antioxidant effects in Kunming mice[J]. Biomolecules，2019，9（4）：137.

[2] SHIN SK，KAISEREE，WESTFD. Alcohol induced brain andliver damage：Advantages of a porcine alcohol use disorder model[J].FrontPhysiol，2021，11：592950.

[3]ZHANG ZY，XIEHL，FARAG MA，et al.Dendrobium officinale flowers flavonoids enriched extract protects against acute ethanol-induced gastric ulcers via AMPK/PI3K signaling pathways[J]. Food Sci Hum Wellness，2024，13（6）：3661- 3679.

[4]CHENY Y，CHENY，CAO P，etal. Fusobacterium nucleatum facilitates ulcerative colitis through activating IL-17F signaling to NF- κ B uia the upregulation of CARD3 expression [J].JPathol，2020，250（2）：170-182.

[5] YOOJH，LEEJS，LEEYS，etal. Protective effect ofbovine milk against HCl and ethanol-induced gastric ulcer in mice [J].JDairy Sci，2018，101（5）：3758-3770.

[6] YAO D B，DONG M，DAI C L，et al. Inflammation and inflammatory cytokine contribute to the initiation and development of ulcerative colitis and itsassociated cancer[J].Inflamm Bowel Dis，2019，25（10）：1595-1602.

[7] KUADKAEWS，UNGPHAIBOONS，PHDOONGSOMBUT N，et al. Efficacy of a chitosan-curcumin mixture in treating indomethacininduced acute gastric ulcer in rats[J].Curr Pharm Biotechnol，2021，22（14）：1919-1931.

[8」李翼，柴劍波，趙偉國.吳朱臾吻抗大鼠幽門結孔型胃潰瘍作 用機理的實驗研究[J].中醫藥信息，2007，24（6）：53-54，83.

[9]王金貴，李華南.從《素問·舉痛論》談腰椎間盤突出癥痛證的 推拿證治思路[J].遼寧中醫雜志，2015，42（11）：2125-2127.

[10]YANG RQ，MAO H，HUANG L Y，et al. Effects of hydrotalcite combined with esomeprazole on gastric ulcer healing quality：A clinical observation study[J]. World J Gastroenterol，2017，23（7）：1268-1277.

[11] CHANG W L，BAI J， TIAN S B，et al. Autophagy protects gastric mucosal epithelial cells from ethanol-induced oxidative damage via mTOR signaling pathway[J]. Exp Biol Med （Mayw00d），2017，242（10）：1025-1033.

[12]KIMJ，CHUN S，OHK S O，et al. Amelioration of alcoholinduced gastric mucosa damage by oral administration of foodpolydeoxyribonucleotides[J].Mol Med Rep，2021，24（5）： 790.

[13]CZEKAJ R，MAJKA J，MAGIEROWSKA K，et al. Mechanisms of curcumin-induced gastroprotection against ethanol-induced gastric mucosal lesions[J]. J Gastroenterol，2018，53 （5）：618-630.

[14]葉菁，梁啟軍主編.《金匱要略》方義注解[M].北京：中國中醫 藥出版社，2022.

[15］韓蓁，李良，戚虹百.吳茱萸湯加減治療脾胃虛寒型胃潰瘍的 臨床療效觀察[J].中國醫藥指南，2016，14（25）：21-22.

[16]張明發，陳光娟，朱自平，等.吳茱萸溫中止痛藥理研究[J].中 藥材，1991，14（3）：39-42.

[17]WANG L，HU CP，DENG P Y，et al. The protective effects of rutaecarpine on gastric mucosa injury in rats[J]. Planta Med，2005，71（5）：416-419.

[18]TANR Q，ZHANG Z，JU J，et al. Effect of Chaihu Shugan Powder-contained serum on glutamate-induced autophagy of interstitial cells of Cajal in the rat gastric antrum[J]. Evid Based Complement Alternat Med，2019，2019 ：7318616.

[19]LOU T，JIANG W J，XU D H，et al. Inhibitory effects of polydatin on lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 cells [J].Inflammation，2015，38（3）：1213-1220.

[20]CHEN T，MOU Y，TANJ N，et al. The protective effect of CDDO-Me on lipopolysaccharide-induced acute lung injury in

[21] CICILIATO M P，DE SOUZA M C，TARRAN C M，et al. Anti-inflammatory effect of vanillin protects the stomach against ulcer formation[J].Pharmaceutics，2022，14（4）：755.

[22]YI LJ，LUY，YU S，et al.Formononetin inhibits inflammation and promotes gastric mucosal angiogenesis in gastric ulcer rats through regulating NF-κB signaling pathway[J]. J Recept Signal Transduct Res，2022，42（1）：16-22.

[23] AMATO A，SERIO R，MULE F. Involvement of cholinergic nicotinic receptors in the menthol-induced gastric relaxation [J].Eur JPharmacol，2014，745：129-134.

[24]ZHOU BQ，ZHANG W，WU YJ，et al.Improved efficacy of Panax notoginseng saponin loaded into BSP/alginate microspheres for the treatment of alcoholic gastric ulcers[J]. Int J Pharm，2021，596：120218.

[25]LIU QX，WANG Y C，ZHENG Q，et al. microRNA-150 inhibitsmyeloid-derived suppressor cells proliferation and function through negative regulation of ARG-1 in sepsis[J].Life Sci，2021，278：119626.

[26] WU J，MENG Q H. Current understanding of the metabolism of micronutrients in chronic alcoholic liver disease[J].World J Gastroenterol，2020，26（31）：4567-4578.

[27] AMIN R R H，AZIZ T A. Gastroprotective effect of azilsartan through ameliorating oxidative stress，inflammation，and restoring hydroxyproline，and gastrin levels in ethanol-induced gastric ulcer[J]. J Inflamm Res，2022，15：2911-2923.

[28] SUN Y T， SHI W Y， ZHANG Q，et al. Multi-omics integration to reveal the mechanism of sericin inhibiting LPS-induced inflammation[J].IntJMol Sci，2022，24（1）：259.

[29]ALISIK M，ALISIK T，NACIR B，et al. Erythrocyte reduced/oxidized glutathione and serum thiol/disulfide homeostasis in patients with rheumatoid arthritis[J].Clin Biochem， 2021，94：56-61.

[30]WANG R R，SUN FJ，REN C Y，et al.Hunan insect tea polyphenols provide protection against gastric injury induced by HCl/ethanol through an antioxidant mechanism in mice[J]. Food Funct，2021，12（2） ：747-760. （本文編輯李京蔓厲建強）