利用溴化鈉和溴化氫代替溴素染色橡膠草根乳管的形態(tài)學(xué)研究

摘" 要：橡膠草根部含有乳管，可產(chǎn)生天然橡膠，與橡膠樹乳管中產(chǎn)生的天然橡膠的結(jié)構(gòu)和性能非常相似，被認(rèn)為是理想的天然橡膠替代植物。由于形態(tài)結(jié)構(gòu)差異，傳統(tǒng)的碘溴染色方法在橡膠草的乳管形態(tài)學(xué)研究中不適用；其次，傳統(tǒng)染色劑——碘溴染液（I₂Br₂）的主成分溴素（Br₂），有強(qiáng)刺激性氣味和強(qiáng)腐蝕性，屬于第二類易制毒化學(xué)品而受到嚴(yán)格管控，且試劑價(jià)格和運(yùn)輸成本昂貴。為了探究更適合橡膠草乳管形態(tài)學(xué)的染色方法和更安全、實(shí)惠的染色試劑，本研究采用溴化鈉（NaBr）和溴化氫（HBr）代替Br₂作染色劑對(duì)橡膠草根的乳管進(jìn)行形態(tài)學(xué)研究。使用光鏡技術(shù)觀察不同NaBr和HBr染色劑配方對(duì)橡膠草根進(jìn)行染色的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示：（1）使用I₂Br₂染液對(duì)橡膠草的根進(jìn)行染色，乳管中的膠乳能被染為淺棕褐色，而且根的形態(tài)結(jié)構(gòu)破損嚴(yán)重，染色效果和切片質(zhì)量均欠佳；（2）使用NaBr代替Br₂配制染色劑對(duì)橡膠草根進(jìn)行染色，其中1 mol/L NaBr、0.2 mol/L I₂的乙酸溶液的染色效果較好，且根的形態(tài)結(jié)構(gòu)較好；（3）使用HBr代替Br₂配制染色劑對(duì)橡膠草根進(jìn)行染色，其中2.5 mmol/L HBr、0.2 mol/L I₂的乙酸溶液的染色效果最好，且根的形態(tài)結(jié)構(gòu)完整性好；（4）使用水代替乙酸做溶劑，配制NaBr+I₂和HBr+I₂染色劑，均不能使乳管著色，且形態(tài)結(jié)構(gòu)破損嚴(yán)重。研究結(jié)果表明，使用安全性更好、價(jià)格更實(shí)惠的NaBr和HBr，能夠代替Br₂作染色劑進(jìn)行橡膠草乳管的形態(tài)學(xué)研究。本研究提供的染色方法和染色劑配方，可為橡膠草、萵苣等非木本產(chǎn)膠植物的乳管形態(tài)學(xué)研究提供技術(shù)儲(chǔ)備和研究基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：橡膠草；乳管；光鏡技術(shù)；溴化鈉；溴化氫中圖分類號(hào)：S576 """""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Morphological Study on Staining the Laticifers in Taraxacum kok-saghyz Roots Using Sodium Bromide （NaBr） and Hydrogen Bromide （HBr） Replacing Bromine （Br₂）

ZHENG Shuoheng^1，2， DU Xiaoyu^2*， SHI Minjing²， YANG Shuguang²， WU Shaohua²， TIAN Weimin^3**， ZHANG Shixin^3**， ZHANG Hua^1**

1. College of Resources and Environment， Xizang Agricultural and Animal Husbandry University， Linzhi， Xizang 860000， China; 2. Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / National Key Laboratory for Tropical Crop Breeding / Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree， Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Hainan Key Laboratory for Cultivation amp; Physiology of Tropical Crops， Haikou， Hainan 571101， China; 3. Xishuangbanna Tropical Botanical Garden， Chinese Academy of Sciences， Mengla， Yunnan 666303， China

Abstract： The root system of"Taraxacum kok-saghyz"（short for TK） contains laticifers capable of producing natural rubber， and the structure and properties closely resemble the laticifers of rubber tree （Hevea brasiliensis）. So，. Tk is recognized as an ideal alternative plant source for natural rubber production. Due to morphological disparities between Hevea and Taraxacum， conventional iodine-bromine （I₂Br₂） staining proves unsuitable for laticifers morphological studies in T. kok-saghyz. Furthermore， bromine （Br₂）， the primary component of traditional I₂Br₂ staining solution， is classified as a Category II precursor chemical under stringent regulatory controls owing to its potent corrosivity， irritancy， and high procurement/transportation costs. To develop safer and more economical staining protocols for laticifer morphology， this study substituted Br₂ with sodium bromide （NaBr） and hydrogen bromide （HBr）. Light microscopic analysis of root sections stained with various NaBr/HBr-I₂ formulations revealed I₂Br₂ staining induced light tan coloration of latex in laticifer， but caused severe structural degradation， and yielding suboptimal staining and section quality， NaBr-based formulation （1 mol/L NaBr+0.2 mol/L I₂ in acetic acid） demonstrated improved staining efficacy with preserved root morphology， HBr-based formulation （2.5 mmol/L HBr+0.2 mol/L I₂ in acetic acid） achieved optimal staining intensity while maintaining perfect histological integrity， and aqueous solvent systems （NaBr/HBr+I₂ in H₂O） failed to stain laticifers and induced significant tissue damage. The results confirmed that NaBr and HBr could serve as safer， cost-effective alternatives to Br₂ for laticifer morphological studies. The developed methodologies would provide critical technical foundations for investigating laticifers in non-woody rubber-producing plants， including T. kok-saghyz， Lactuca species， etc.

Keywords： Taraxacum kok-saghyz; laticifer; optical microscopy technique; sodium bromide; hydrogen bromide

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.08.010

天然橡膠是一種重要的工業(yè)原材料和戰(zhàn)略物資，主要來源于巴西橡膠樹。巴西橡膠樹是一種原產(chǎn)于南美洲亞馬遜河流域熱帶雨林的高大喬木，對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境有極高的要求，我國(guó)主要在云南、海南和廣東種植^[1]。由于橡膠樹種植面積有限，我國(guó)每年的天然橡膠產(chǎn)量約80萬t，而我國(guó)每年的橡膠消耗量超600萬t，已成為世界第一大天然橡膠消費(fèi)國(guó)^[2]。我國(guó)的天然橡膠自給率常年不足15%，遠(yuǎn)低于30%的國(guó)際安全警戒線^[3]。世界上約有2500多種含膠植物，可以從500多種植物中得到不同種類的橡膠^[4-5]。因此，開發(fā)具有種植環(huán)境廣泛和產(chǎn)膠量高的新型產(chǎn)膠作物，是我國(guó)當(dāng)前天然橡膠產(chǎn)業(yè)的重要發(fā)展方向之一。發(fā)展新型產(chǎn)膠作物，不僅能夠保障我國(guó)戰(zhàn)略物資安全自給，而且還能減少對(duì)巴西橡膠樹單一作物的依賴。在其他產(chǎn)膠植物中，研究較多的主要有杜仲（Eucommia ulmoides Oliver）、銀膠菊（Parthenium argentatum Gray）和橡膠草（Taraxacum kok-saghyz Rodin，TK）^[6]。橡膠草是菊科蒲公英屬多年生草本植物，生于河漫灘草甸、鹽堿化草甸、農(nóng)田水渠邊，適應(yīng)性強(qiáng)，在我國(guó)分布廣泛。橡膠草根中含乳汁，可提取橡膠，可用于制造天然橡膠制品，目前是產(chǎn)膠植物研究中的熱門作物之一。與橡膠樹不同的是，橡膠樹主要產(chǎn)膠的次生乳管細(xì)胞由維管形成層紡錘狀原始細(xì)胞分裂分化而來，主要分布在樹干樹皮中；而橡膠草主要產(chǎn)膠的根中，乳管細(xì)胞是由中柱鞘細(xì)胞分裂分化而成，與維管束伴生，在橡膠草體內(nèi)著生維管束的組織（如根、莖、葉、花柄等）中均有乳管的分布^[7]。

目前，在產(chǎn)膠植物的乳管形態(tài)學(xué)研究中，常用來顯示橡膠樹、橡膠草等產(chǎn)膠組織中乳管的方法，其原理是用碘（I₂）使橡膠著色，溴素（Br₂）使橡膠變性，通過冰乙酸減少Br₂的鹵化作用，使I₂更容易透進(jìn)組織染色。使用碘溴溶液（I₂Br₂）處理可以使組織中所含橡膠變?yōu)椴蝗苡诙妆健⑹椥浴⒆厣淖冃韵鹉z。經(jīng)石蠟切片后，在光學(xué)顯微鏡下觀察，乳管細(xì)胞中含有的橡膠成分被染成棕褐色，能夠明顯地區(qū)分乳管細(xì)胞與其他細(xì)胞的形態(tài)差異^[8]。本研究橡膠樹樹皮中乳管的研究方法是基于該方法改進(jìn)而來，其中I₂Br₂染色天然橡膠的原理相同。該方法的優(yōu)點(diǎn)：（1）乳管細(xì)胞含有的天然橡膠能夠被I₂Br₂染成棕褐色，與其他細(xì)胞的顏色和形態(tài)差異明顯；（2）經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間保存不褪色和變性；（3）能夠使木質(zhì)化嚴(yán)重的樹皮、樹根軟化，更易切片。但該方法同時(shí)存在以下缺點(diǎn)：（1）試驗(yàn)步驟繁多、費(fèi)時(shí)費(fèi)力。從取樣、材料固定、脫水、I₂Br₂處理到切片觀察有40多個(gè)步驟，耗時(shí)7～10 d；（2）Br₂和冰乙酸會(huì)導(dǎo)致組織膨脹、破壞，不適宜用于橡膠草、萵苣等非木本植物或幼嫩組織的處理；（3）Br₂屬于第二類易制毒化學(xué)品，同時(shí)也是第八類危險(xiǎn)化學(xué)品，具有強(qiáng)刺激性氣味和強(qiáng)腐蝕性，在購買、儲(chǔ)存、使用和運(yùn)輸過程中均受到《危險(xiǎn)化學(xué)品安全管理?xiàng)l例》的嚴(yán)格管控，且試劑價(jià)格和運(yùn)輸成本昂貴。因此，亟需尋求一種替代Br₂的染色試劑或者其他的染色方法。

溴及溴化物在印染工業(yè)中廣泛應(yīng)用^[9]，常用的溴化劑包括溴化鈷、溴化錫和溴化鈉（NaBr），其中溴化鈷和溴化錫的印染效果較好，但價(jià)格昂貴，NaBr的印染效果雖稍差、但價(jià)格低廉，更適宜大量植物材料的染色試驗(yàn)。NaBr為白色顆粒狀粉末或無色立方晶體，無臭，味咸而微苦，易溶于水，水溶液呈中性，微溶于醇，主要在感光工業(yè)中用于配制膠片感光液，是印染工業(yè)中常用的溴化劑。溴化氫（HBr）是溴和氫的化合物，易溶于氯苯、二乙氧基甲烷等有機(jī)溶劑，能與水、醇、乙酸混溶。HBr能夠在加熱條件下釋放Br分子，可以起到印染的作用^[10]。本研究通過使用不同濃度的NaBr、HBr制作染色劑以替代I₂Br₂染色劑里的Br₂，對(duì)橡膠草根染色和對(duì)乳管的形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，獲得適合橡膠草根乳管的形態(tài)結(jié)構(gòu)研究的染色劑配方，能夠?yàn)椴煌a(chǎn)膠植物的乳管生物學(xué)研究提供技術(shù)儲(chǔ)備。

1" 材料與方法

1.1" 植物材料與試劑

本研究用到的植物材料橡膠草（TK）為本實(shí)驗(yàn)室保存的在新疆采集的橡膠草種質(zhì)，種植在人工氣候室內(nèi)，培養(yǎng)條件為：空氣濕度60%，溫度25"℃，光照時(shí)間光照16 h/黑暗8 h^[11]。選取同一時(shí)間種植、健壯且長(zhǎng)勢(shì)相同的橡膠草植株，使用游標(biāo)卡尺測(cè)量主根的直徑，選取主根直徑大小相近的橡膠草進(jìn)行試驗(yàn)，每個(gè)處理取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

主要試劑：碘單質(zhì)（I₂，編號(hào)IA02-AR-250G）、冰乙酸（Acetic acid，編號(hào)CB39-AR-0.5L）、正丁醇（Butyl alcohol，編號(hào)HC19-AR-0.5L）、無水乙醇（Ethanol absolute，編號(hào)HB15-AR-0.5L）、二甲苯（Xylene，編號(hào)IC02-AR-0.5L），購自廣州化學(xué)試劑廠；溴素（Br₂，編號(hào)IA02-AR-250G）、切片石蠟（Paraffin with Ceresin，熔點(diǎn)60～62"℃，編號(hào)117310-500g），購自西隴科學(xué)股份有限公司；固綠染料（Fast Green FCF，編號(hào)A610452-0025）、中性樹膠封片劑（Neutral Balsam Mounting Medium，編號(hào)E675007-0100），購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2" 方法

1.2.1" 石蠟切片方法" 本研究中橡膠草根的石蠟切片方法，參考實(shí)驗(yàn)室常用橡膠樹樹皮的經(jīng)典方法^[11-19]，并稍加改進(jìn)。使用單面刀片切取2～3 cm粗細(xì)均勻的橡膠草主根，立即橫切分割為厚3 mm的小塊，置于80%乙醇固定液中抽氣，室溫固定12 h以上，乙醇系列（80%、95%、100%）脫水，冰乙酸過渡后，進(jìn)行I₂Br₂染色劑或NaBr、HBr替代染色劑染色36 h（60"℃），冰乙酸脫浮色，乙醇脫水，正丁醇透明，石蠟包埋；切片厚度16"μm，展片并烘干后；經(jīng)過二甲苯脫蠟，乙醇脫水，使用固綠進(jìn)行襯染，乙醇脫浮色，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡鏡檢并拍照。

配制碘溴染色劑（I₂Br₂，含20 mmol/L I₂和2.5 mmol/L Br₂的乙酸溶液），先將20 mmol/L I₂溶于冰乙酸中，并于65"℃加熱助溶；待I₂完全溶解后，加入2.5 mmol/L Br₂，混勻備用。

1.2.2" NaBr和HBr代替Br₂配制碘溴染色劑" 使用NaBr代替Br₂，以及KI代替I₂配制染色劑，參考碘溴染色劑中20 mmol/L I₂和2.5 mmol/L Br₂的濃度，設(shè)置4個(gè)NaBr濃度（3、2、1、0.5 mol/L），3個(gè)KI濃度（0.4、0.2、0.1 mol/L）。染色劑配制方法如下：（1）NaBr+I₂+乙酸染色劑。將20 mmol/L I₂溶于冰乙酸溶液中，并于65"℃加熱助溶，待I₂完全溶解后，分別加入4個(gè)濃度的NaBr，配成染色劑溶液；（2）NaBr+KI+乙酸染色劑。將3個(gè)濃度的KI溶于冰乙酸溶液中，并于65"℃加熱助溶，待KI完全溶解后，再加入1 mol/L NaBr待其完全溶解，配成染色劑溶液；（3）NaBr+I₂/KI+水染色劑。將0.2 mol/L I₂或0.2 mol/L KI溶于水中，并于65"℃加熱助溶，待I₂或KI完全溶解后，再加入1、0.5 mol/L NaBr，待其完全溶解，配成染色劑溶液。使用HBr代替Br₂配制染色劑，參考碘溴染色劑2.5 mmol/L Br₂的濃度，設(shè)置HBr的濃度為Br₂濃度的1倍、3/4倍、1/2倍、1/4倍濃度，設(shè)置2.500、1.875、1.250、0.625 mmol/L HBr等4個(gè)濃度。（4）HBr+I₂+乙酸染色劑。將20"mmol/L的I₂溶于冰乙酸溶液中，并于65"℃加熱助溶，待I₂完全溶解后，分別加入4個(gè)濃度HBr，配成染色劑溶液；（5）以碘溴染色劑相同濃度的HBr、I₂、Br₂、NaBr、KI加入乙酸中，配成單一成分的染色劑作為對(duì)照組溶液。

此外，對(duì)上述染色劑染色效果較好的配方，在室溫條件（25～30"℃）進(jìn)行染色試驗(yàn)，觀察其染色劑配方的染色情況。

1.2.3 "染色效果和組織完整性評(píng)價(jià)" 對(duì)不同染色劑染色的橡膠草根石蠟切片，使用Leica DMLB熒光顯微鏡進(jìn)行拍照，按照相同放大倍數(shù)的照片相比較^[20-21]，比較不同染色劑對(duì)橡膠草根中乳管細(xì)胞和其他組織的染色情況，以及整個(gè)切片的組織完整性進(jìn)行分析。

2" 結(jié)果與分析

2.1" NaBr染色結(jié)果

本研究采用NaBr替代Br₂配制染色劑進(jìn)行橡膠草根的染色試驗(yàn)，對(duì)4種濃度的NaBr+ 20"mmol/L I₂染色劑染色的橡膠草根橫切面切片進(jìn)行顯微觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：3、2 mol/L NaBr的濃度太高，NaBr在乙酸溶液里面不能完全溶解，所以這2個(gè)高濃度NaBr配制的染色劑不參與評(píng)價(jià)。使用I₂Br₂染色劑對(duì)橡膠草根進(jìn)行染色，在橡膠草主根的橫切面圖中，有不連續(xù)的圓環(huán)維管束組織，乳管細(xì)胞位于維管束外圍，乳管細(xì)胞中的天然橡膠被染成棕褐色，與其他細(xì)胞的形態(tài)和顏色均有明顯差異；但整個(gè)切片的組織完整性不好，薄壁細(xì)胞大多破裂，中柱鞘位置裂開，木質(zhì)部細(xì)胞的形態(tài)完整性不好（圖1A～圖1C）。使用1、0.5 mol/L NaBr配制的NaBr+I₂+乙酸染色劑對(duì)橡膠草根進(jìn)行染色，橡膠草主根的橫切面圖中維管束組織和乳管細(xì)胞均很明顯，乳管細(xì)胞中的橡膠也可以被

染成棕褐色。與I₂Br₂染色結(jié)果相比較，1 mol/L NaBr+I₂+乙酸染色劑染色的組織完整性稍好，薄壁細(xì)胞破裂較少，中柱鞘位置裂開，木質(zhì)部細(xì)胞的形態(tài)較完整，組織完整性稍好（圖1D～圖1E）；而0.5 mol/L NaBr+I₂+乙酸染色劑與I₂Br₂染色劑效果類似，組織完整性不好（圖1G～圖1I）。可見，4個(gè)濃度的NaBr代替Br₂配制染色劑對(duì)橡膠草根進(jìn)行染色，染色效果最好的為1 mol/L NaBr，并不是NaBr濃度越高越好。

2.2" 使用NaBr、KI分別代替Br₂、I₂的染色結(jié)果

使用碘-碘化鉀（I₂-KI）染色淀粉和蛋白質(zhì)，是形態(tài)學(xué)上常用的染色方法^[22]，而I₂Br₂染色中，I₂可以使橡膠染色。為了探索KI是否能使橡膠染色，本研究采用KI替代I₂配制染色劑進(jìn)行橡膠草根的染色試驗(yàn)，對(duì)不同濃度梯度KI+NaBr染色劑染色的橡膠草根橫切面切片進(jìn)行顯微觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與I₂Br₂染色橡膠草根的結(jié)果（圖2A～圖2B）進(jìn)行對(duì)比，0.4 mol/L KI+NaBr+乙酸染色橡膠草主根的橫切面圖中，能夠觀察到不連續(xù)排列的圓環(huán)狀維管束組織，但未觀察到被染成棕褐色的乳管細(xì)胞；整個(gè)切片的組織完整性較好，薄壁細(xì)胞有少量破裂，中柱鞘位置完整未裂開，木質(zhì)部細(xì)胞的形態(tài)完整且清晰（圖2C～圖2D）。而在0.2、0.1"mol/L KI+NaBr+乙酸染色橡膠草主根的橫切面圖中，能夠觀察到不連續(xù)的圓環(huán)狀維管束組織，有少量被染成棕褐色的乳管細(xì)胞，顏色較淺；整個(gè)切片的組織完整性不好，薄壁細(xì)胞大多破裂，中柱鞘位置裂開，木質(zhì)部細(xì)胞的形態(tài)較完整，組織完整性不好（圖2E～圖2H）。因此，KI不能代替I₂作為染色劑用于橡膠草根中乳管的染色。

2.3 "用水作溶劑的染色結(jié)果

冰乙酸是一種重要的化學(xué)試劑，在形態(tài)學(xué)研究中廣泛應(yīng)用^[23]。冰乙酸常作為固定液的成分之一，能夠快速穿透細(xì)胞，與細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)發(fā)生作用，使其沉淀，固定并維持染色體結(jié)構(gòu)的完整性，增強(qiáng)染色體的嗜堿性，達(dá)到優(yōu)良染色效果^[24]。冰乙酸具有很強(qiáng)的腐蝕性，能夠?qū)ι锝M織、織物、金屬材料等產(chǎn)生腐蝕作用^[25]。由于橡膠樹樹皮材料中含有大量的石細(xì)胞，質(zhì)地堅(jiān)硬，利用冰乙酸的腐蝕作用和65"℃高溫的催化作用使樹皮軟化，利于切片。若使用I₂Br₂染色劑（冰乙酸）和高溫處理橡膠草根、葉片等幼嫩組織，會(huì)使幼嫩組織發(fā)生破損或者溶解。所以本研究探索使用水代替冰乙酸作為溶劑來配制NaBr+I₂的染色劑，進(jìn)行橡膠草根的染色處理（65 ℃，36 h）。結(jié)果顯示，1 mol/L NaBr+0.2 mol/L KI（圖3C～圖3D）、0.5 mol/L NaBr+0.2 mol/L KI（圖3E～圖3F）和1"mol/L NaBr+0.48 mol/L KI+0.04 mol/L I₂（圖3G～圖3H）的水溶液染色橡膠草主根橫切面圖顏色很淺，且只能在放大情況下勉強(qiáng)觀察到維管束組織，不能觀察到被染成棕褐色的乳管細(xì)胞；整個(gè)切片的組織完整性不好，薄壁細(xì)胞破裂，中柱鞘位置裂開，木質(zhì)部細(xì)胞的形態(tài)不完整。因此，使用水代替冰乙酸來做溶劑配制染色劑，既不能使根的組織形態(tài)更完整，也不能使乳管細(xì)胞染成棕褐色，染色效果不佳。

2.4 "溫度對(duì)染色效果的影響

由于冰乙酸具有腐蝕作用，而且65"℃高溫催化，腐蝕或膨脹效果更甚，會(huì)導(dǎo)致幼嫩組織發(fā)生破損或者溶解。通過NaBr+I₂+乙酸染色劑能夠使橡膠草根的乳管細(xì)胞進(jìn)行染色的效果，為了使根的組織形態(tài)完整性更好，本研究嘗試在室溫條件（25～30"℃）進(jìn)行橡膠草根的染色處理（25～ 30"℃，36 h）。結(jié)果顯示，在室溫條件下I₂Br₂染色橡膠草主根36 h，橡膠草主根的橫切面圖中維管束組織較明顯，且細(xì)胞破損較少、組織完整較好。但乳管細(xì)胞只被染成淺的棕褐色（圖4A～圖4C），與高溫條件下的染色效果還存在一定差距。使用20 mmol/L I₂+乙酸（圖4D～圖4F）、1 mol/L NaBr+20 mmol/L I₂+乙酸（圖4G～圖4I）和0.5"mol/L NaBr+20 mmol/L I₂+乙酸（圖4J～圖4L）染色劑室溫條件下染色36 h，橡膠草主根的橫切片圖中維管束組織較明顯，而且細(xì)胞破損少一些、組織完整也較好，但乳管細(xì)胞也只被染成淺棕褐色。因此，室溫條件下，乙酸的腐蝕和膨脹作用稍弱，組織和細(xì)胞的完整性稍好，但乳管細(xì)胞中的天然橡膠染色較淺，比高溫催化的效果差很多。

2.5" HBr的染色結(jié)果

HBr是溴和氫的化合物，HBr的水溶液為氫溴酸，HBr能夠在加熱條件下釋放Br分子，起到印染的作用。參考碘溴染色劑中2.5 mmol/L Br₂的濃度，本研究設(shè)置1/4倍濃度（0.625 mmol/L HBr）、1/2倍濃度（1.875 mmol/L HBr）、3/4倍濃度（1.25 mmol/L HBr）和1倍濃度（2.5 mmol/L HBr）等4個(gè)梯度的氫溴酸，配制4種濃度的HBr+20 mmol/L I₂+乙酸溶液對(duì)橡膠草根進(jìn)行染色處理（65"℃，36 h）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與I₂Br₂染色橡膠草根的結(jié)果（圖5A～圖5D）進(jìn)行對(duì)比，在0.625 mmol/L HBr+I₂+乙酸（圖5E～圖5H）、1.25"mmol/L HBr+I₂+乙酸（圖5I～圖5L）、1.875"mmol/L HBr+I₂+乙酸（圖5M～圖5P）和2.5"mmol/L HBr+I₂+乙酸（圖5Q～圖5T）染色劑染色橡膠草主根的橫切面圖中，均能清晰地觀察到不連續(xù)的圓環(huán)狀維管束組織，被染成棕褐色的乳管細(xì)胞顯得格外明顯，而且乳管細(xì)胞的棕褐色比I₂Br₂染色的更深；整個(gè)切片的組織完整性好，細(xì)胞輪廓清晰，薄壁細(xì)胞幾乎破裂，中柱鞘位置完整未裂開，木質(zhì)部細(xì)胞的形態(tài)完整且清晰。隨著染色劑中HBr濃度的增加，乳管細(xì)胞被染成棕褐色的顏色更深，而且細(xì)胞質(zhì)膜也能被染成棕褐色。因此，HBr可代替Br₂作為染色劑進(jìn)行橡膠草根的染色，且HBr+I₂+乙酸染色劑的染色效果明顯優(yōu)于常用的I₂Br₂染色劑。

2.6" 染色劑單一成分的染色結(jié)果

為了探究HBr+I₂+乙酸染色劑中的哪種成分起主導(dǎo)作用，本研究對(duì)染色劑中的單一成分HBr、I₂、Br₂、NaBr、KI分別配制乙酸溶液對(duì)橡膠草根進(jìn)行染色處理，觀察橫切面的效果。結(jié)果顯示：與橡膠草根染色效果最好的2.5 mmol/L HBr+I₂+乙酸（圖6A～圖6D）相比較，2.5 mmol/L HBr+乙酸（圖6E～圖6H）的染色效果略差一些，乳管細(xì)胞被染成棕褐色的顏色淺一些，維管束組織的比對(duì)度弱很多，薄壁細(xì)胞顏色更淺，有部分破損，細(xì)胞輪廓不清晰，整體形態(tài)不夠完整。20 mmol/L I₂+乙酸（圖6I～圖6L）染色的橡膠草橫切面圖中，維管束和薄壁細(xì)胞均很完整且容易辨識(shí)，但乳管細(xì)胞只染成很淺的棕褐色，薄壁細(xì)胞輪廓清晰，圖片的整體顏色偏藍(lán)，染色效果略差。2.5 mmol/L Br₂+乙酸（圖6M～圖6P）染色效果較好，維管束和薄壁細(xì)胞均完整且易于辨識(shí)，乳管細(xì)胞被染成棕褐色的顏色也更深，細(xì)胞輪廓較清晰，整體形態(tài)完整性好；乳管細(xì)胞核薄壁細(xì)胞均有深棕褐色，未顯示出固綠襯染的淺藍(lán)色。因此，HBr和Br₂可將乳管染成棕褐色。而1 mol/L NaBr+乙酸（圖6U～圖6V）和0.2 mol/L KI+乙酸（圖6W～圖6X）不僅不能使乳管細(xì)胞染成棕褐色，且薄壁細(xì)胞破損較多，整體形態(tài)不完整。

3 "討論

3.1" 橡膠草有望成為解決我國(guó)天然橡膠生產(chǎn)供應(yīng)不足問題的優(yōu)質(zhì)產(chǎn)膠替代作物

目前，已知的產(chǎn)膠植物約2500多種^[26]，但大部分產(chǎn)膠植物的天然橡膠由于分子量低或者含膠量少而缺乏應(yīng)用價(jià)值，僅有少數(shù)植物可以產(chǎn)生高質(zhì)量且有經(jīng)濟(jì)效益的天然橡膠^[27]， 如巴西橡膠樹、杜仲、銀膠菊和橡膠草。巴西橡膠樹供給了世界98%以上的天然橡膠，與橡膠樹天然橡膠生產(chǎn)比較，橡膠草具有以下幾點(diǎn)優(yōu)勢(shì)：（1）產(chǎn)膠能力較高，雖然橡膠草的單株產(chǎn)量少，但是根部天然橡膠含量可高達(dá)20%以上，個(gè)別單株可達(dá)20%～26%，單位面積種植的植株數(shù)量多，綜合來看產(chǎn)膠能力非常可觀；（2）生長(zhǎng)周期短，橡膠樹是熱帶植物，對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求較高，適合栽植的范圍有限，且需要生長(zhǎng)7～8 a才能開割，非生產(chǎn)期長(zhǎng)，而橡膠草產(chǎn)膠期短，適應(yīng)性廣，播種當(dāng)年或次年即可收獲，并且適合機(jī)械規(guī)模化生產(chǎn)；（3）適宜種植區(qū)域廣：橡膠草能夠在干旱、鹽堿地、平原、高山、坡地等多種環(huán)境中生長(zhǎng)，尤其喜冷涼氣候，抗寒性強(qiáng)，這些特性剛好能與橡膠樹進(jìn)行互補(bǔ)；（4）開發(fā)應(yīng)用廣，橡膠草是藥食同源植物，既可入藥也能作野菜食用；橡膠草的根和葉還可以提取菊糖，提膠后的殘?jiān)梢约庸こ删凭⒄託猓幌鹉z草的種植還有助于防風(fēng)固沙、減少水土流失，在新疆、內(nèi)蒙古等干旱地區(qū)，這一特性尤為重要。所以，橡膠草的綜合開發(fā)利用，有望成為解決我國(guó)天然橡膠生產(chǎn)供應(yīng)不足問題的優(yōu)質(zhì)產(chǎn)膠替代作物。

3.2" 利用NaBr和HBr代替Br₂可作為產(chǎn)膠草本植物乳管染色的形態(tài)學(xué)方法

橡膠草的根是主要產(chǎn)膠部位，有明顯的可產(chǎn)膠乳管細(xì)胞。橡膠草乳管的細(xì)胞學(xué)研究起步較晚，形態(tài)解剖學(xué)研究表明，橡膠草作為菊科的多年生草本植物，肉質(zhì)根發(fā)達(dá)，根中存在同心環(huán)狀排列的異常維管組織，乳管細(xì)胞伴隨維管束環(huán)，位于維管束外側(cè)，圍繞中央的偏木質(zhì)化的髓成集中分布。同一環(huán)中的乳管束之間常間隔多列薄壁細(xì)胞，不同層之間間隔多層薄壁細(xì)胞，內(nèi)圈的乳管細(xì)胞小，隨著向外發(fā)育，乳管細(xì)胞逐漸長(zhǎng)大，并充滿橡膠粒子^{[7， 28-29]}。由于橡膠草根為肉質(zhì)根，幼嫩且含水量高，且含有較多的菊糖、黃酮、酚類等次生代謝物，使用橡膠樹樹皮乳管的染色方法得到切片效果不理想^[28]。油紅O是一種很強(qiáng)的脂溶性染料，能溶于組織和細(xì)胞中的脂類，使組織內(nèi)的脂滴呈現(xiàn)橘紅色，主要用于油脂、水、肥皂、蠟燭、橡膠、塑料制品的著色。采用振動(dòng)切片結(jié)合油紅O染色的方法，能夠大致反映出橡膠草根中乳管細(xì)胞的位置和含膠量的多少^{[11， 19， 30]}。但油紅O染的是油脂類物質(zhì)，使用油紅O染色的橡膠草根，其表皮和髓部木薄壁細(xì)胞也是橙紅色的，說明油紅O并不能作為天然橡膠的專一染色劑。

橡膠本身無色透明，雖能被蘇丹Ⅲ、蘇丹Ⅳ、阿里坎拿、溴化法、氯化法、油溶黃、油溶藍(lán)等染色，但是，材料中的脂肪、樹脂及角質(zhì)化、木栓化的細(xì)胞壁亦往往能染上類似的顏色，或者所染的顏色在切片的保存中容易褪去^[8]。史自強(qiáng)等^[8]發(fā)明了碘+溴+冰乙酸染色液，可以專一性對(duì)含有橡膠的植物組織進(jìn)行染色，克服了橡膠染色、橡膠變性和保存褪色等問題，而且效果很好，此種染色方法一直沿用至今。由于Br₂具有刺激性氣味和強(qiáng)腐蝕性，屬于第二類易制毒化學(xué)品，同時(shí)也是第八類危險(xiǎn)化學(xué)品，其生產(chǎn)、儲(chǔ)存、使用、經(jīng)營(yíng)、運(yùn)輸受到《危險(xiǎn)化學(xué)品安全管理?xiàng)l例》嚴(yán)格管控。對(duì)產(chǎn)膠植物進(jìn)行乳管細(xì)胞學(xué)研究時(shí)，使用碘溴染色存在很大的安全風(fēng)險(xiǎn)，使用更為安全的染色方法或染色試劑進(jìn)行替代已勢(shì)在必行。本研究購置的Br₂為西隴科學(xué)股份有限公司產(chǎn)品，貨號(hào)：AR500g，售價(jià)為280元/瓶（總重500 g是包括上層約1/5用于封閉Br₂的水和下層4/5的Br₂，且不包含運(yùn)輸費(fèi)），由于危化品的運(yùn)輸需要專門的危化品運(yùn)輸途徑，費(fèi)用很高（運(yùn)輸成本300～500元/瓶），所以使用Br₂作為染色劑的成本很高（總價(jià)650～850元/瓶）。而NaBr和HBr不屬于危化品，安全性好、易于購買與運(yùn)輸，且價(jià)格實(shí)惠，NaBr售價(jià)為22.8元/500 g，HBr為75元/500"mL（采購于科研采購管理平臺(tái)，https：//www.cassbuy. com/）。NaBr+I₂+冰乙酸和HBr+I₂+冰乙酸溶液對(duì)橡膠草主根進(jìn)行染色的橫切面圖中，均能夠清晰地觀察到圓環(huán)狀且不連續(xù)排列的維管束及染成棕褐色的乳管細(xì)胞；整個(gè)切片的組織完整性好，細(xì)胞輪廓清晰，薄壁細(xì)胞幾乎破裂，中柱鞘位置完整未裂開，木質(zhì)部細(xì)胞的形態(tài)完整且清晰。可見該染色劑配方不僅安全、節(jié)約成本，而且更適合幼嫩組織的乳管形態(tài)學(xué)研究，可為不同產(chǎn)膠植物的乳管生物學(xué)研究提供良好的技術(shù)儲(chǔ)備。

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