油橄欖內生真菌的分離鑒定及其抑菌活性研究

中圖分類號：S182 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2025）11-0277-08

油橄欖（OleaeuropaeaL.）屬于木樨科木樨欖屬的一種常綠喬木，主要適生區在地中海沿岸，包括希臘、意大利、西班牙、突尼斯等國都是重要生產地[1]。我國自20世紀60 年代引種成功后，主要在西北、西南發展種植，其中甘肅省隴南市的油橄欖種植面積和鮮果產量均居全國第—[2-4]。油橄欖也是一種木本油料樹種，用其鮮果直接榨取的橄欖油富含不飽和脂肪酸、角鯊烯、植物淄醇、酚類物質和一些微量元素，具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌等功效，營養價值極高，被譽為“液體黃金”[5]。除此之外，油橄欖果實也可應用于醫藥化工、食品保健等行業，具有極高的經濟效益和社會效益[6]。植物內生真菌分布廣，種類多，在植物體內普遍存在，但其不會造成宿主植物的感染發病癥狀，它與植物之間的關系經過長期的協同進化，對宿主植物的健康至關重要[7。目前已報道由內生真菌產生的具有生物活性的次生代謝產物超過20000種，從中尋找具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤等開發潛能的生物活性物質，在醫藥開發、生物防治、研究對植物的誘導抗性方面，受到人們越來越多的關注[8-10]。通過對油橄欖內生真菌的分離與培養，可以獲得豐富的真菌資源，然后研究其次生代謝產物，期望能夠分離檢測到活性較好的化合物，從而為植物真菌資源的開發與利用提供依據和指導。

油橄欖內生真菌研究主要集中在國外，研究人員通過多種方法對油橄欖不同部位中內生真菌的多樣性進行了廣泛研究，發現油橄欖內生真菌種類和數量在不同的品種、季節、地理位置和植物部位間差別較大，其次生代謝產物在抗菌、抗腫瘤方面報道較多[1l-13]。Martins 等研究了油橄欖花與果實中內生真菌在保護寄主植物免受炭疽病侵害時的潛在作用，并確定了對油橄欖炭疽病具有生物防治潛力的候選菌株，證明了油橄欖內生真菌豐富度與炭疽病的發病率有關[14]。Malhadas等研究了3株從油橄欖葉片中分離得到的內生真菌對大腸桿菌等病原菌的抑制作用，強調次生代謝產物中的揮發性成分3-甲基-1-丁醇和苯乙醇具有抗菌潛力[15]。Mady等從埃及采集到的油橄欖葉片中分離得到的內生真菌產黃青霉（Penicilliumchrysogenum），其次生代謝產物吲哚生物堿被證明對人類乳腺癌細胞的增殖具有良好的抑制作用[16]。Liarzi等從油橄欖中分離出1株內生的炭球菌近似種Daldiniacf.concentrica，其次生代謝產物不僅有抑菌作用，而且對根結線蟲有殺滅作用[17]。李勇杰等分析了云南引種油橄欖嫩葉中抗氧化成分含量，但截至目前，國內對本土油橄欖內生真菌的研究尚是空白，對其次生代謝產物也未見報道[18]。本研究采用組織分離法分離油橄欖內生真菌，測定其次生代謝產物的抗菌活性并對抑菌活性物質進行粗提作高效液相色譜（HPLC）分析，從中篩選出具有抗菌活性的菌株，為油橄欖內生真菌資源的下一步研究做基礎。

1材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1供試材料2023年10月初健康油橄欖枝條、根、葉片均采自甘肅省隴南市武都區兩水鎮大灣溝油橄欖種植基地。

1.1.2供試植物病原菌桉樹青枯病菌Ralstoniasolanacearum（ ）、番茄瘡痂病菌Xanthomonasvesicatoria （G^-） 、枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis（ G⁺ ）和溶血葡萄球菌Staphylococcushaemolyticus （G⁺） ，由華南農業大學林學與風景園林學院植物和微生物健康實驗室提供。成團泛菌Pantoeaagglomerans（G^- ）和黃單胞桿菌Xanthomonasarboricola（ G^- ）由甘肅省隴南市經濟林研究院實驗中心提供。

1.1.3主要試劑乙酸乙酯（分析純，天津富宇精細化工有限公司）；石油醚（分析純，天津富宇精細化工有限公司）；GF254薄層層析硅膠板（青島海洋化工有限公司）；噻唑藍（MTT）生物顯色劑（Amresco公司）；硫酸鏈霉素（Sigma公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1內生真菌的分離和純化將油橄欖枝條、根、葉片分別用清水洗凈，內生真菌的分離純化采用 Shan 等的方法[19]。將枝條和根去除表皮，分成約 0.5cm×0.5cm×0.5cm 大小的塊段，將葉片葉脈周圍部分切為 0.5cm×0.5cm 片狀。取第3次漂洗的無菌水 2mL 涂布于PDA培養基中，并在相同條件下培養作為對照，若沒有真菌生長，說明消毒徹底。

1.2.2內生真菌的鑒定 形態學的鑒定主要是觀察菌絲特征和菌落形態。

分子生物學的鑒定具體方法如下：將保種的內生真菌接種到PDA培養基活化后再接種至含有20mL 液體培養基（PDB）的三角瓶（規格 50mL ））中，后放置在 28°C 搖床上以 150min 振蕩 6～ 7d 。將菌絲球加入液氮研磨至粉末狀。采取北京擎科生物科技股份有限公司植物DNA提取試劑盒（TSINGKE）提取真菌DNA。然后使用通用引物ITS1/ITS4（ITS1 .5^′ -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3^′;ITS4;5^′ -TCCTCCGCTTATTGATATGC- ?3^′ 擴增真菌ITS序列，擴增體系為 50μL ：ITS1和ITS4各2μL，1×TSE101 金牌mix 45μL 、DNA模板 1μL 完成后放人PCR儀。擴增程序為： 98°C3min ： 個循環； 72^°C 延伸 5min ， -4^°C 保存。擴增產物送北京擎科生物科技股份有限公司（成都）完成測序。在NCBI采用Blast檢索比對，使用MAFTTversion7處理下載的相似性較高的序列和其近緣屬的序列，用MEGA7.0.26軟件采用最大似然法（maximumlikelihood）構建系統發育樹，Bootstrapmethod中重復抽樣次數設置為1O0O，模式為Kimura2-parametermodel。模式菌株用粗體表示。

1.2.3油橄欖內生真菌次生代謝產物的制備將菌株活化后，接種于 50mL 的三角瓶中，每瓶裝20mL PDB液體培養基，在 25°C.160r/min 下培養7d，每種真菌培養3瓶。培養完成后，每罐大米培養基接種1瓶菌液，重復3次，共發酵3個月。發酵完成后用乙酸乙酯浸泡發酵產物3次，每次 7d 。發酵液使用旋轉蒸發儀進行減壓濃縮，將粗提物放置到干凈的西林瓶中 4^°C 保存備用。

1.2.4抗細菌活性的測定通過TLC-MTT-生物自顯影法測定其抗細菌活性[20]。用點樣毛細管（內徑 0.5mm ）均勻輕點在薄層板上，少量多次，每個點擴散直徑不要超過 5mm 。展開劑為石油醚：乙酸乙酯 δ=6：1 （體積比）。抗菌活性檢測時陽性對照為 0.2mg/mL 硫酸鏈霉素，點于點樣板最右端。然后將供試細菌使用LB液體培養基培養，置于溫度為 28^°C 、速度為 160r/min 的恒溫振蕩搖床中搖培 ^12h 。在加熱至融化的LB半固體培養基（瓊脂質量濃度為 5g/L 中加入菌液，搖晃均勻；將菌液混合液快速倒至薄層板上，輕振使其表面保持薄厚均勻。將該板放人加入適量無菌水并鋪有濾紙的培養皿中 25^°C 保濕培養， ^12h 后向薄層板噴適量 5mg/mL MTT溶液。通過計算抗菌斑點的遷移率 （R_f） ，對樣品中抗菌物質的數量和極性進行初步估算，然后根據抑菌斑點的直徑判斷抑菌能力的強弱。遷移率 （R_f） 計算公式如下：

遷移率 展開劑前沿與點樣處之間的距離 斑點與點樣處之間的距離

1.2.5次生代謝產物的HPLC分析將內生真菌粗提物取少量至干凈西林瓶中，用氮吹儀吹干稱重并用色譜甲醇溶解，將粗提物濃度控制在 10mg/mL 左右，用 0.22mm 濾膜過濾去除雜質。試驗使用色譜乙腈-水反相色譜梯度洗脫，內生真菌粗提物洗脫梯度如下： 0～1min 使用 30% 色譜乙腈梯度洗脫， 1～16min 色譜乙腈濃度由 30% 線性遞增至100% ， 16～21min 使用 100% 色譜乙腈進行等度洗脫， 21～22min 色譜乙腈由 100% 線性遞減至 30% ，22～29min 使用 30% 色譜乙腈對色譜柱進行平衡[每1L流動相中均需加人 0.1mL 三氟乙酸（TFA）]，柱溫頭 40°C ；流速 1mL/min ；進樣量10mL ;采用二級管陣列檢測器（DAD）進行全波長掃描。

2 結果與分析

2.1 油橄欖內生真菌的分離和鑒定結果

共分離到15株真菌，其中從油橄欖枝條中分離 到5株，根內分離到6株，葉片內4株。通過觀察菌 落形態，合并后得到13株具有明顯差異的內生真 菌，分別命名為 Oef-1～Oef-13 （圖1）。

不規則，呈淺綠色。除 Oef-11 和 Oef-13 ，其他內生真生長速度較快，尤其Oef-8生長最快。Oef-11和Oef-13菌絲致密，生長緩慢，Oef-13在生長過程中會產生黃色色素，將整個培養基染成黃色。

結合分子鑒定，將ITS序列提交至NCBI，獲得登錄號，構建系統發育樹，見圖2。13株內生真菌分屬于9個不同的屬，分別是鐮刀菌屬（Fusarium）頂孢霉屬（Acrocalymma）指狀叢赤殼屬（Dactylonectria）、卡納霉屬（Canariomyces）、間座殼屬（Diaporthe）、鏈格孢屬（Alternaria）、亞隔孢殼屬（Didymella）、光黑殼屬（Preussia）殼格孢屬（Camarosporium）。最終鑒定結果見表1。

2.2油橄欖內生真菌次生代謝產物的抗細菌活性如表2所示，除 和Oef-12外，其余菌株均有一定的抑菌活性，大多對桉樹青枯病菌抑制效果最好。其中9株真菌可對青枯病菌產生抑菌活性， 存在 R_f 值為 0.00～0.12，0.35～ 0.40和 0.49～0.51 的3種極性的抗青枯病菌成分； Oef-2 存在 R_f 值為 0.00～0.20 和 0.32～0.44 的抗青枯病菌成分，最大抑菌圈直徑大于 10mm ：_0ef-9 存在 R_f 值為 0.00～0.15 的抗青枯病菌成分，且抑菌圈直徑大于 10mm;Oef-4，Oef-5 Oef-6.0ef-7.0ef-8 均在不止1個極性范圍測定出抗青枯病菌活性成分。此外， Oef-2 和Oef-9對其他4種供試細菌中均表現出抑制活性， Oef-9 對枯草芽孢桿菌和溶血葡萄球菌的抑制活性均強于陽性對照，其抑菌斑直徑大于 10mm 。多數內生真菌粗提物抑菌斑的 R_f 在 0～0.20 之間，說明具有抑菌活性的物質極性較大。

2.3油橄欖內生真菌次生代謝產物HPLC分析

真菌次生代謝產物具有多元生物活性，因此，能產生豐富次生代謝產物的資源真菌，更具拮抗病原菌的潛能。本研究首先將13株內生真菌進行次生代謝產物的HPLC化學篩選。根據高效液相色譜圖結果（圖3）顯示，13株內生真菌的粗提物中的次生代謝產物種類（紫外吸收峰個數）都較為豐富，主要以大中等極性物質為主，其中 2～15min 內的中大極性化合物的含量在總粗提物中含量的占比最高， 20min 以后有較少的小極性物質，13株菌的粗提中的次生代謝產物大部分分布（保留時間）相同，但含量（紫外吸收相對高度）存在較大差異。

3結論與討論

根據現有文獻和GenBank數據庫中關于油橄欖內生真菌的記錄，大概從油橄欖中分離出245株內生真菌，鑒定到種的只有116株，其中以子囊菌居多[12]。這些研究主要圍繞油橄欖主產區地中海地區國家展開，對我國油橄欖內生真菌的研究尚是空白。本研究從我國甘肅隴南地區的油橄欖枝條、果實和葉片中分離得到13株內生真菌，從不同的植物部位分離到的內生真菌存在差異。這些內生真菌都屬于子囊菌門，而研究發現子囊菌門真菌在由植物分離到的內生真菌中占比最多[21]。大量研究表明，包括內生真菌的植物微生物組的組成受到植物組織特異性的顯著影響，這可能源于宿主提供的營養類型和細胞微環境的差異[22]。例如，水稻根內部、根表面和根瘤層的微生物的比較組學分析揭示了顯著的生物多樣性差異，這些發現強調了對植物不同部位內生真菌群落結構及其生態功能進行系統性分析的必要性，特別是通過高通量測序技術和轉錄組學方法，為下一步研究提供了思路[23]

此外，季節性變化對于植物內生真菌群落結構具有深遠的影響，植物內生真菌群落的組成與植物生理活動的季節性變化以及環境因子的季節性波動直接相關[24]。長期觀測研究表明，內生真菌的群落組成不是靜態的，而是隨著季節和植物生長周期而變化[25]。這些變化可能會影響植物的適應性和生長表現，因此，深入理解植物內生真菌群落季節性變化對于預測植物對全球生態系統功能的影響至關重要。同時或許有些真菌只能在油橄欖體內存活，不能在人工配制的培養基上生長，從而影響到分離出內生真菌的種類。

此次分離得到的13株內生真菌中有鐮刀菌屬、間座殼屬和鏈格孢屬等真菌，在其他植物中多為植物病原菌，如 F .oxysporum能引起多種植物的枯萎病和根腐病，A.alternata可以引起核桃黑斑病和其他病害，D.novem 可對大豆造成毀滅[26-29]。某些真菌物種在不同環境條件或宿主生理狀態下，可以表現為病原體或是促進宿主生長的內生真菌，這種現象的分子機制仍然不完全清楚，但可能涉及宿主免疫系統的激活與抑制、真菌致病因子的表達調控，以及環境壓力對宿主和病原體互作的影響。研究這種復雜的相互作用對于開發新的農業管理策略，以提高作物產量和抗病性具有重要意義。

許多內生真菌通過產生抗微生物化合物或誘導宿主植物的防御機制來參與植物的生物防御過程，增加植物抵抗環境脅迫的能力。這些真菌代謝物不僅可以對抗植物病原體，也有可能對抗害蟲。理解這些化合物的生物合成途徑和作用機制對于生物防御策略的開發有著重要的應用前景[7.30]。本研究中菌株Oef-2和Oef-9表現出較好的抑菌活性，與Oef-2相似度最高的菌株為A.walkeri，而Zeng等從水稻中分離出同屬真菌游動頂孢霉（A.vagum），發現該菌不僅能提高水稻產量，還能誘導水稻對稻瘟病菌的抗性，而本研究首次發現菌株Oef-2對多種病原細菌產生抑制作用，可對該屬真菌的抑菌潛能進行深入挖掘[31]。與Oef-9相似度最高的菌株為A.alternata，該菌雖然可引起植物葉斑病，但Malhadas等從健康油橄欖葉片中分離出該菌，對其他病原菌也有很好的抑制效果，可能這2株真菌參與了油橄欖生物防御過程，還有待于進一步研究[15，32]。 _0ef-5 和 Oef -6在生長過程中表現不同，抑菌活性也稍有不同，鑒定結果均與座囊菌綱真菌Dothideomycetessp.（KU059942）相似度最高，可能由種間差異引起。此次供試細菌中的 P agglomerans 和 X. arboricola都為核桃黑斑病的病原菌[33]

內生真菌廣泛存在于植物體內，目前已經從內生真菌的次生代謝物中分離得到的黃酮類、萜類、甾體類、酚類等活性物質，表現出抗氧化、抗菌、抗腫瘤等多種活性[34-36]。鏈格孢屬和鐮刀菌屬是2個重要的能產生毒素的真菌類群，真菌毒素除了可應用于致病性研究，對抗病品種的誘導、開發新型除草劑等也有重要作用。研究發現，莖生殼二孢（Ascochytacaulina）與其自身產生的3種毒素的混合物共同使用時可以提高對藜的防治效果[37]。此外有研究表明，鐮刀菌可誘導三七合成皂昔，還可產生生物堿類等物質[38]。為了尋找次生代謝產物代謝產量高、構類型豐富、活性較好的真菌菌株，不能僅依賴傳統的活性篩選方法[39]。因此本研究除對分離得到的13株內生真菌進行抑菌活性試驗外，還對其進行乙酸乙酯冷浸提取，采用HPLC對13株植物真菌提取物進行化學篩選。分析其譜圖中各代謝產物的紫外吸收、吸收強度和保留時間發現，13個菌株的次生代謝產物極性大都較為適中，其中Oef-3的次生代謝產物種類最為豐富且含量高，Oef-1、Oef-6、Oef-9 和Oef-13的次生代謝產物較為豐富且含量相對較多，剩余菌株的次生代謝產物都較為平均，因此結合抗菌試驗結果，選擇Oef-9進行后續試驗。

系統性地研究內生真菌及其與宿主植物的相互作用對于理解生態系統中的生物多樣性、生態功能以及對環境變化的影響極其重要；此外，對于開發可持續的農林業發展策略、保護生物多樣性以及應對全球氣候變化具有直接的應用價值。今后的研究中，可以充分考慮內生真菌具備促進生長和增強抗逆性的作用，通過開發植物內生真菌的豐富資源，可以提取到具有天然抗菌特性的活性成分，探討內生真菌的生理生態功能，為真菌源農藥的研發開辟一條新路，從而推進對這類真菌的深層次探索。

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