基于LC－MS技術分析亞硒酸鈉毒害對水稻根系特征及酚酸類、黃酮類化合物積累動態(tài)的影響

中圖分類號：S511.01 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2025）11-0261-09

硒是人類和動物必需的微量營養(yǎng)元素[1]，世界衛(wèi)生組織建議人類飲食中硒攝人量為 50～55μg/d ，長期缺硒會導致人類心臟衰弱、關節(jié)軟骨組織萎縮壞死、甲狀腺功能異常等[2，食用富含硒的食物能夠降低這些疾病的發(fā)生。水稻是我國重要的經濟作物之一， 60% 人群將稻米作為主食。亞硒酸鈉是最常用的硒肥之一，施用硒肥能夠增加稻米中的硒含量[3]，但是硒對植物的重要性存在爭議，低劑量的硒可以保護植物免受各種非生物脅迫，促進植物的生長發(fā)育；然而，高濃度的硒作為促氧化劑，將誘導植物的氧化應激反應或者形成畸形硒蛋白，造成植物硒中毒。Cartes等報道，低濃度的硒降低了鋁（Al）脅迫下黑麥草中過氧化氫（ H₂O₂ ）含量[4]；Cupta等研究發(fā)現(xiàn)，適量的硒濃度可以引發(fā)生長素的生物合成和運輸，刺激煙草主根的伸長和側根的生長[5]。然而，Kapolna等研究發(fā)現(xiàn)，葉面噴施100mg/L 亞硒酸鈉造成胡蘿卜葉片壞死，肉質根枯萎[;高濃度亞硒酸鈉能夠對甘蔗產生毒害效應，導致根系活力降低、植株矮小、葉片枯黃等現(xiàn)象[7]

植物次生代謝物是一系列有機化合物，不直接參與植物的生長和發(fā)育，但在特定條件下發(fā)揮特殊功能，其缺乏會導致植物的生存能力受損[8]。酚酸類、黃酮類化合物作為廣泛存在于植物中的兩大類次生代謝產物，對于植物的生長發(fā)育具有重要的作用。暴露于不同的環(huán)境（干旱、重金屬、低溫/高溫、強光等）脅迫下，通過激活抗氧化防御系統(tǒng)，抑制產生活性氧（ROS）的酶活性，從而減少ROS的含量，保護植物的正常代謝活動[9-10]。干旱脅迫能夠調節(jié)酚酸和黃酮的生物合成途徑，導致這些化合物的積累增強，而這些物質的增加可以防止植物免受缺水條件的不利影響[]。干旱脅迫增強了莧菜中酚酸含量，抗氧化能力增加[12]。Yang 等證明，干旱脅迫誘導黃酮類化合物的積累，從而促進干旱馴化[13]。在重金屬脅迫下，酚酸類和黃酮類化合物可以增強金屬螯合過程，降低植物細胞中有害的羥基自由基水平[14-15]。Chen 等研究發(fā)現(xiàn)，酚酸（綠原酸、阿魏酸、咖啡酸）通過清除自由基和參與鎘（Cd）、鋅（ Zn^? ）的吸收過程，對緩解重金屬脅迫具有重要的地位[16]。鋁脅迫誘導山茶花中類黃酮代謝物（兒茶素、槲皮素等）顯著積累，進而增強其鋁解毒能力[17]

盡管硒在調控植物的生長發(fā)育方面具有重要作用，但是水稻根系中酚酸類、黃酮類化合物對過量亞硒酸鈉的響應機制鮮有報道。本試驗以哈育粳十一號為試驗材料，采用不同濃度的亞硒酸鈉（0，40，80，400mg/L） 進行葉片噴施處理;通過對水稻根系參數(shù)測定，篩選出對亞硒酸鈉脅迫處理反應最顯著的樣品;同時，將 0mg/L 處理與其進行廣泛靶向代謝組分析，比較2組樣品在亞硒酸鈉脅迫下酚酸類、黃酮類化合物含量的變化，以期為亞硒酸鈉在水稻分子育種中的應用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1 試驗材料

供試水稻品種為哈育粳十一號，由哈爾濱市農業(yè)科學院水稻研究室提供。

于2023年4月在農業(yè)農村部甜菜品質檢驗測試中心采用水培試驗。用 5% 次氯酸鈉（NaCIO）溶液給種子表面消毒， 10min 后用蒸餾水清洗3次，將瀝干水分的種子均勻放入發(fā)芽盒（長 18cm× 寬 12cm× 高6cm ）中，每個發(fā)芽盒內放置100粒種子，3次重復。發(fā)芽盒放置于恒溫培養(yǎng)箱（溫度： 25°C ，相對濕度：40% ）中進行培育。7d后，將生長大小均勻一致的幼苗移入水培盒（長 30cm× 寬 20cm× 高 10cm ）中，每盆水培盒中移人30株幼苗，每盆重復3次，每周更換1次霍格蘭植物培養(yǎng)液（Hoagland's）。水稻幼苗生長條件為光一暗周期 16h-8h ，溫度 22‰ 。待幼苗長至4葉期時，參照饒玲的方法[18]對水稻幼苗葉片噴施不同濃度亞硒酸鈉溶液［0（CK）、40、 ，共噴施3次，水稻苗開始出現(xiàn)表型上的差異時收取樣品，每個處理挑選10株大小相同的水稻苗根部，收集的樣品立即放于 -80°C 冰箱保存。每個處理重復3次。

1.2根系參數(shù)測定

根長：用直尺測量莖稈基部至整株根尖的距離；

根部鮮、干重：將整株根部表面的水分用濾紙吸干，稱量鮮重；然后于105 C 恒溫箱中殺青30min ，后將溫度降至 80°C 烘干至恒重，再稱量干重；

根系活力：采用氯化三苯基四氮唑（TTC）還原 法測定水稻根系活力[19]

1.3代謝物的檢測

將水稻根部樣品放置于LGJ-12A型凍干機（北京四環(huán)起航科技有限公司）中真空冷凍干燥，使用 KZ-III-FP 型高速低溫組織研磨儀（武漢塞維爾生物科技有限公司）將樣品研磨成粉末（粒徑 ? 0.25mm ）。稱取 50. 00mg 樣本粉末，加入預冷（ -20^°C 的 70% 甲醇水內標提取液 1.2mL ，使用渦旋振蕩儀將樣品混合均勻， 10000r/minΩ?⁴Φ^c 離心 10min 。取上清，過微孔濾膜（孔徑 0.22μm ，直徑13mm ），并保存于進樣瓶中，上機測定[20]。UPLC－MS/MS操作參數(shù)和規(guī)格按照Wang等的設置[21]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Analyst1.6.3軟件處理質譜數(shù)據(jù)，采用Excel2019、SPSS23.0、Origin2022軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計、分析、繪圖。利用MetaboAnalyst（https：//www.metabpanalyst.ca/）在線平臺繪制主成分分析（PCA）圖和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）圖。

2 結果與分析

2.1亞硒酸鈉脅迫下水稻根系參數(shù)分析

由圖1可知， 400mg/L 亞硒酸鈉脅迫處理后，哈育粳十一號的根系生長明顯受到抑制，與 0mg/L 處理相比， 400mg/L 亞硒酸鈉處理的水稻根長、根鮮重、根干重分別顯著下降了 33.09%.45.89% 、58.47% （ Plt;0.05 ）。其中，根系活性隨著亞硒酸鈉濃度的增加呈現(xiàn)明顯下降趨勢， 的亞硒酸鈉處理后，根系活性較 0mg/L 處理分別下降了28.63%.51.82% 。結果表明， 400mg/L 的亞硒酸鈉處理能夠顯著抑制水稻幼苗根系的生長。

2.2 0?400mg/L 亞硒酸鈉處理水稻根部代謝產物PCA分析和OPLS-DA分析

對樣品進行PCA分析可知，PC1、PC2的方差貢獻率分別為 60.06% .14.31% ，CK與亞硒酸鈉脅迫處理間呈現(xiàn)明顯的分離趨勢，表明在亞硒酸鈉脅迫處理下水稻幼苗根部代謝物存在明顯差異（圖2-A）。

OPLS-DA分析可以與PCA分析互補，使組間區(qū)分最大化。對 0.400mg/L 亞硒酸鈉處理的水稻根部代謝產物進行OPLS-DA組間差異性分析，結果再次證明，CK與 400mg/L 亞硒酸鈉處理之間的代謝物成分差異顯著，與PCA分析結果一致（圖2-B）。

2.3 400mg/L 亞硒酸鈉脅迫下水稻幼苗根部代謝物分析

基于廣泛靶向代謝組分析測定在 400mg/L 亞硒酸鈉脅迫下哈育粳十一號根部中代謝物和差異代謝物的成分。經過質量評估，共鑒定出1594種差異代謝產物（DAMs），被分為10類，其中次生代謝物主要有黃酮類、酚酸類、生物堿類、萜類化合物、有機酸類、木脂素、香豆素等。由圖3-A分析可知， 400mg/L 亞硒酸鈉處理后的大部分DAMs含量明顯低于 0mg/L 處理。

GO分析結果顯示，在代謝中，DAMs主要參與次生代謝物的生物合成代謝、輔助因子生物合成代謝和氨基酸生物合成；在基因信息處理中，DAMs主要參與硫傳遞系統(tǒng)和氨酰基tRNA生物合成；在環(huán)境信息處理中，DAMs主要參與植物激素信號轉導、磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)和ABC轉運蛋白。京都基因與基因組百科全書（KEGG）分析結果顯示，共發(fā)現(xiàn)了90條代謝通路，DAMs富集最多的代謝通路主要為代謝通路、輔助因子的生物合成代謝、核苷酸代謝、ABC轉運蛋白等（圖3-B、圖3-C）。

2.4 400mg/L 亞硒酸鈉脅迫下水稻幼苗根部中的關鍵差異代謝物分析

由圖4可知，以倍數(shù)變化（foldchange，F(xiàn)C） ?2 或 FC?0.5 且變量重要性投影（VIP值） gt;1 為條件篩選DAMs，在1594種DAMs中共鑒定出顯著變化的差異代謝物質904種（803種下調表達，101種上調表達），顯著變化的差異次生代謝物包括黃酮類（140種， 15.4% ）、酚酸類（129種， 14.3% ）、生物堿類（87種， 9.6% ）、木脂素和香豆酸類（34種，3.8% ）、萜類（26種， 2.9% ）、有機酸類（67種，7.4% ）以及其他類代謝物（421種， 46.6% ）。這些代謝物的變化可能是為了抵抗ROS破壞，維持細胞滲透勢，保護細胞膜結構。

與 0mg/L 處理相比，在 400mg/L 亞硒酸鈉處理下酚酸類和黃酮類的差異代謝物含量最高，其中黃酮類代謝物主要成分包括黃酮（82種， 58.6% ）、黃酮醇（32種， 22.9% ）、二氫黃酮（11種， 7.9% ）、異黃酮（8種， 5.7% ）查爾酮（3種， 2.1% ）、二氫黃酮醇（2種， 1.4% ）黃烷醇類（2種， 1.4% ）。

2.5 400mg/L 亞硒酸鈉脅迫下水稻幼苗根系中差 異代謝物質的變化

從DAMs篩選中可以發(fā)現(xiàn)，鑒定出的顯著差異代謝物質中黃酮類化合物和酚酸類代謝物的含量比例位于前列，因此本研究重點關注了酚酸類和黃酮類物質的變化。

在 400mg/L 亞硒酸鈉處理下，水稻根系中鑒定出129種差異顯著的酚酸類物質，包括110種酚酸下調表達：咖啡酸、2-氨基-3-甲氧基苯甲酸、綠原酸、2-羥基-3-苯基丙酸、阿魏酸、香豆酸甲酯、對香豆醇、丁香酸、2-0-咖啡酰蘋果酸、對香豆酰奎寧酸、芥子酸、苯甲酰蘋果酸等，19種酚酸上調表達：肉桂酸、4-羥基-3-甲氧基苯甲醛、4-羥基苯甲醛、甲基丁香酚、間苯三酚、4-甲基苯甲酸、肉桂酸乙酯、香草酸乙酯等。

400mg/L 亞硒酸鈉脅迫后水稻幼苗根系中黃酮類化合物大部分呈現(xiàn)表達量下降的趨勢，有119種黃酮類下調表達，包含1種查爾酮（羥基異甘草素葡萄糖苷）、10 種二氫黃酮（圣草酚-8-C-葡萄糖苷 -4^′-O- 葡萄糖苷、6-碳葡萄糖基-2-羥基柚皮素等）1種二氫黃酮醇（二氫山柰酚-3-0-葡萄糖苷）、67種黃酮（香葉木素、金圣草黃素-5-0-葡萄糖苷、6，7，8-三羥基-5-甲氧基黃酮等）31種黃酮醇（鼠李檸檬素、山柰酚 -4^′- O-葡萄糖苷、槲皮素-3-0-洋槐糖苷、丁香亭等）1種黃烷醇類[沒食子兒茶素-（ ）-兒茶素]、8種異黃酮（8－甲氧基丙二酰基芒柄花苷、染料木素 -7-0- 半乳糖苷-鼠李糖 ?^2′- 羥基染料木素等）。21種黃酮類上調表達，包括15種黃酮[異甜橙黃酮、6-甲基黃酮、香葉木素 -8-C- （2^′-O- 阿拉伯糖基）葡萄糖苷 ，7，4^′- 二羥基黃酮等]、2種查爾酮（2，4-二羥基 -4^′- 甲氧基查爾酮、根皮素 -4^′-O- 葡萄糖苷），二氫黃酮、二氫黃酮醇、黃酮醇苷、黃烷醇各1種，分別為 3^′，4^′，5，6 7-五甲氧基黃烷酮、二氫山柰酚-7-0-葡萄糖苷、異鼠李素、兒茶素。

本研究大部分酚酸類和黃酮類物質表達下調，表明 400mg/L 亞硒酸鈉處理能夠明顯抑制水稻根系中黃酮和酚酸物質的合成。

2.6亞硒酸鈉脅迫下水稻幼苗根系中差異代謝物的代謝途徑分析

2.6.1酚酸類物質的代謝途徑分析苯丙烷代謝途徑是酚酸生物合成的主要途徑[22]，在該途徑中鑒定出10種表達變化明顯的酚酸類代謝物，包括L-酪氨酸、亞精胺、對香豆醇、綠原酸、對香豆酰奎尼酸、芥子酸、阿魏酸、咖啡酸，這8種酚酸物質在400mg/L 亞硒酸鈉處理后均下調，而肉桂酸、甲基丁香酚表達上調。值得注意的是，對香豆酰奎寧酸不僅參與苯丙烷代謝途徑的酚酸合成與代謝，也參與黃酮生物合成代謝途徑。表明各個代謝通路之

間具有一定的關聯(lián)性，DAMs既能參與某個特定的 明水稻幼苗根系遭遇亞硒酸鈉脅迫是一個復雜的代謝通路，也能在其他通路中發(fā)揮作用，進一步闡 調控網(wǎng)絡（圖5）。

2.6.2黃酮類物質的代謝途徑分析本研究發(fā)現(xiàn)，參與黃酮類物質的合成有2個關鍵代謝途徑，分別為黃酮類生物合成代謝途徑、黃酮和黃酮醇生物合成代謝途徑。在黃酮類生物合成代謝途徑中鑒定出7種明顯變化的黃酮類代謝產物，其中有5種黃酮類代謝物質表達水平顯著下調，分別是木犀草素（3^′，4^′，5，7- 四羥基黃酮）、對香豆酰奎寧酸、4－香豆酰莽草酸酯、3，5，7-三羥基黃酮，而D-兒茶素和 ^7，4′- 二羥基黃酮這2種黃酮類代謝物顯著上調表達。同時，在黃酮和黃酮醇生物合成代謝途徑中也發(fā)現(xiàn)了7種顯著變化的黃酮類代謝產物，包括野漆樹苷、木犀草素、忍冬苦昔、三葉豆苷 ?3^′，5- 二羥基 ^{-3，4′，7-} 三甲氧基黃酮、蕓香苷、丁香素，這些代謝物質均顯著下調表達。有趣的是，木犀草素同時參與黃酮類生物合成代謝途徑、黃酮和黃酮醇生物合成代謝途徑，該代謝物質表達水平在2個黃酮類物質合成關鍵途徑中均顯著下調。總的來說，這14種顯著變化的黃酮類代謝物質大部分呈現(xiàn)表達水平下調的趨勢（圖6）。

3討論與結論

在高濃度亞硒酸鈉脅迫下，植物的表型性狀和生長狀態(tài)出現(xiàn)顯著變化，且地上部分指標（株高、植物莖、葉物質干重、生物量）和地下指標（根長、根粗、根面積、生物量）更容易受到影響[22]。水稻吸收的亞硒酸鈉是稻田土壤中有效硒的主要形式之二[24]，被吸收后，大部分亞硒酸鈉被轉移到根細胞的質體中，并在非酶促下還原為硒化物的谷胱甘肽，然后與其他反應酶進行結合生成硒代蛋氨酸和硒代半胱氨酸，這2個物質可以中斷蛋白質的正常功能并引起毒性[25]

根系活力泛指根的吸收能力、合成代謝等功能，可以直接反映植物根系的生長狀況，根系活力的強弱決定了植物對生長所需的礦質元素和水分吸收能力，而礦質元素和水分含量的增加可以促進植物根系生長、增強養(yǎng)分吸收和氧化還原能力[26]與 0mg/L 處理相比，在 400mg/L 亞硒酸鈉處理下，根長、根鮮/干重和根系活力顯著下降。可能是高濃度的亞硒酸鈉阻礙了水稻根系對營養(yǎng)物質的吸收、破壞了其氧化還原能力，進而抑制根系的生長。

酚類化合物可以調節(jié)植物體內生長素的代謝，改變生長素的含量，從而影響植物的生長發(fā)育[27]，酚酸類和黃酮類是酚類化合物的主要構成物質。酚酸類化合物參與控制不定根的形成和發(fā)育，在生根過程中通過抑制生長素（IAA）氧化酶系統(tǒng)來增強生長素活性，從而防止IAA 損傷[28]。咖啡酸處理能夠顯著提高內源IAA含量，提高牡丹生根率[29]

Mandal等研究發(fā)現(xiàn)，原兒茶酸、香豆酸和4-羥基苯甲醛也可以促進根莖的形成和根系的生長發(fā)育[30]。黃酮類化合物被認為可以調節(jié)側根發(fā)育[31]。IAA氧化酶活性受黃酮負向調節(jié)，生長素水平升高會增加細胞中活性氧（ROS）積累，從而抑制植物根毛的發(fā)育[32-33]。在擬南芥中，黃酮醇通過清除 ROS 調控側根的產生[34]

同時，酚酸和黃酮類化合物具有強大的抗氧化能力，在非生物脅迫下可以清除植物體內的ROS^[35-36] 。例如，在鹽脅迫下提高植物體內的酚酸類物質含量能夠有效清除 O₂^- ·，提高植物的抗氧化能力[37]。在UV-B輻射處理下，增加小麥中酚酸類物質的積累可以增強其抗氧化活性[38]。方紫雯等研究報道，適量的阿魏酸處理可以顯著提高楊山牡丹葉片中的抗氧化酶活性，降低ROS積累，從而減少干旱脅迫對植株的傷害[39]。在鹽脅迫中，過量積累黃酮類物質的擬南芥表現(xiàn)出高抗氧化性，能夠減少ROS 積累，延長對鹽脅迫的耐性[40]。Jan 等的研究表明，熱脅迫下植物體內的氧化損傷增加，而黃酮類含量的積累能夠減輕其損傷[41]

本研究結果表明，在 400mg/L 亞硒酸鈉脅迫下，水稻根系生物量明顯受到抑制（根長縮短、根鮮/干重下降、根活性降低），根系中大部分的酚酸類、黃酮類物質表達量呈現(xiàn)下降趨勢，高濃度亞硒酸鈉處理可能已經超過水稻根系耐受閾值，致使水稻根系中抑制IAA氧化酶系統(tǒng)物質含量減少，生長素活性降低，導致內源IAA含量顯著下降，水稻側根、不定根的形成和發(fā)育受到嚴重抑制或者抗氧化代謝產物積累的減少，驅動側根出現(xiàn)大量的超氧化物，削弱了水稻根部對過量亞硒酸鈉解毒能力，造成毒害物質的大量增加，破壞了水稻根系的正常生長。

本研究以哈育粳十一號為試驗材料，隨著亞硒酸鈉濃度的增加，水稻根長、根鮮/干重和根系活力逐漸呈現(xiàn)下降的趨勢，與 0mg/L 相比， 400mg/L 亞硒酸鈉處理下的水稻根長、根鮮重、根干重分別下降了 33.09%.45.89%.58.39% 。因此，將 0mg/L 和 400mg/L 亞硒酸鈉處理樣品進行廣泛靶向代謝組測序，共鑒定出1594種DAMs，其中顯著變化的DAMs有904種，黃酮類化合物140種和酚酸類化合物129種。與 0mg/L 相比，在 400mg/L 濃度的亞硒酸鈉處理下酚酸類和黃酮類的差異代謝物下調表達最明顯。在差異代謝物KEGG功能注釋及富集上共發(fā)現(xiàn)了90條代謝通路，DAMs富集最多且顯著的代謝通路主要為代謝通路、輔助因子的生物合成、ABC轉運蛋白、碳代謝途徑等。在苯丙烷代謝途徑中鑒定出10種表達水平變化明顯的酚酸類代謝物；在黃酮類生物合成代謝途徑、黃酮和黃酮醇生物合成代謝途徑檢測到的140種中有14個DAMs含量變化顯著，這10種酚酸類化合物和14種黃酮類化合物大部分下調表達。以上結果為了解亞硒酸鈉脅迫下水稻根系次生代謝物的變化提供了理論依據(jù)。但是本研究屬于室內研究結果，實際效果會受到自然因素（高溫、干旱、大風、暴雨）的影響，須要進行大規(guī)模的田間試驗來驗證實際應用的效果。

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