基于UHPLC-QE-MS技術識別穩定型心絞痛 患者血清代謝組學特征

【DOI10.16806/j.cnki.issn.1004-3934.2025.07.018

Identification of Serum Metabolomics Characteristics in Patients with Stable Angina Pectoris Using UHPLC-QE-MS

JIANG Hanmei，RUAN Hongwei，LIU Ping，LIANG Junjie，JIANG Yan，LUO Gang

（Southwest MedicalUniversityDepartmentofCardiovascularedicine，AfliatedrditionalineseMedicineHospital， Southwest Medical University，National Traditional Chinese Medicine Clinical Research Base，Luzhou 646o，Sichuan， China）

【Abstract】ObjectiveStableangina pectoris（SAP）isoneofthemaintypesofcoronaryheart disease.New methods forthe prevention，earlydiagnosisandtreatmentofSAPeededtobeexploredclinicalyandthresearchtoachievethisgoalfocuothe discoveryofnewbomarkers.MethodsInthisstudy，3Opatients withSAP（SAPgroup）and30patientswithoutcoronaryarterystenosis （CON group）wereselected.First，UHPLC-QE-MStechnologywasusedtodetectserummetabolitesinbothgroups，ndthenmultiariate stiticalanalysisandpathayanalysisereusedtoevaatetechangesinserummetabolicprofiles.ResultsOP-Aanalyisidetfed significandiferencesinteserummetabolicprofilesbetweenSAPgoupndCOgroup，nd26diferentialmetabolitesereentified. Pathwayaalyisfoundtattseieretialetablteeoldineretabolismidativerssuieetablidotr metabolicpathways.ConclusionBycomparingtheserummetabolicproflesofSAPgroupndCONgroup，26potentialbiomarkersand 7 metabolic pathways were identified，which can be used to guidethe prevention，early diagnosis and treatmentof SAP.

【Keywords】 Coronary heart disease;Stable angina pectoris;Metabonomics;Clinical study

近年來，中國心血管疾病患者呈逐年增加趨勢，其中冠心病（coronaryheart disease，CHD）的患病人數居于心血管疾病第二位，其發病年齡近年來逐漸年輕化，極大地威脅了人類健康，增加了經濟負擔[1-2]。穩定型心絞痛（stableanginapectoris，SAP）是CHD的主要類型之一。臨床上尚無藥物可逆轉 CHD^[3] ，因此，CHD的診斷和預防顯得十分重要。CHD診斷的金標準是冠狀動脈造影[3]，因該技術具有侵入性，很多患者不愿接受此項檢查。因此，需探索有利于SAP預防、早期診斷和治療的新的生物標志物。

歸功于近幾年來技術的進步，研究人員能使用多種技術有效地表達某些特定疾病的個體特征。其中，代謝組學是一種檢測患者細胞、組織和生物流體中的低分子量代謝物（相對分子質量lt;1500）的方法[4]，目前已運用在CHD 的研究中[5]。代謝組學技術為 CHD生物標志物的研究帶來了新的機遇，如4-乙酰胺基丁酸[6]不飽和脂肪酸[7]、磷脂酰肌醇[8]、酪氨酸[9]、三碘甲狀腺原氨酸[\"0]脂質代謝物[]等，但目前可用于臨床診斷CHD的代謝組學標志物不多。因此，盡管目前取得了一些進展，但仍需開展更多標準方法的研究并加以驗證。

本研究采用UHPLC-QE-MS技術對SAP患者的血清代謝組學特征進行檢測，以發現更多潛在生物標志物，用于指導SAP的預防、早期診斷和治療。

1材料和方法

1.1 患者和研究標準

本研究選取了60例來自于2021年3月—2021年9月在附屬中醫醫院就診的患者。符合下列納人標準的30例患者設為SAP組，經冠狀動脈造影或冠狀動脈CT血管造影明確無冠狀動脈狹窄的30例患者設為CON組。使用國際心臟病學學會及世界衛生組織在1979年發布的《缺血性心臟病的命名和診斷標準》作為SAP組的診斷標準。

本研究納入標準：（1）年齡40～80歲；（2）1年內冠狀動脈造影或冠狀動脈CT血管造影顯示至少1支冠狀動脈滿足以下條件： 50%? 主干狹窄 lt;75% 或 50%? 分支狹窄 lt;100% ;（3）CON組患者的性別、年齡等均需與SAP組患者相匹配。排除標準：（1）不穩定型心絞痛；（2）肥厚型心肌病；（3）其他疾病導致的胸痛，如神經官能癥、更年期綜合征、頸椎病、胃食管反流等疾病；（4）心肌梗死（入組前至少3個月）和研究前幾個月出現心肌梗死前癥狀；（5）合并有嚴重心力衰竭或影響血流動力學的惡性心律失常；（6）其他嚴重系統性疾病，如艾滋病、惡性腫瘤、消化道出血、胃潰瘍、有出血傾向者；（7）非心源性肝腎功能損害；（8）未行手術的心臟瓣膜病；（9）未行手術的先天性心臟病；（10）活動性心肌炎；（11）計劃妊娠、正在妊娠或哺乳期；（12）有原發器官（肺、肝、心、骨髓、腎）移植史；（13）心理疾病；（14）近2個月參加過其他臨床研究。

所有患者及其家屬均已知情且同意匿名使用其數據，并簽署知情同意書。本研究獲得了附屬中醫院倫理委員會的批準（KY2021008-FS01）。

1. 2 樣本采集

采集患者晨間空腹靜脈血 5mL ，將其在 25‰ 下靜置 30min，3 000r/min 離心 10min ，取上清液 500μL 轉移至凍存管，經液氮速凍保存至 -80°C 的冰箱中，用于測量和實驗。

1.3樣本制備

取 50μL 樣品置于EP管中，加入 150μL 萃取液（ 100% 甲醇，含同位素標記的內標混合物），旋渦混勻30s ，超聲 10min （冰水浴）， -40°C 孵育 ^1h 。隨后，樣品在 4‰ 以 12 000r/min 離心 15min ，取其上清液到干凈的玻璃小瓶中進行分析。最后，將所有樣品的上清液等量混合制備質量控制（qualitycontral，QC）樣品。

1.4代謝組學研究

實驗方法參考《質譜優化與測試》“化合物鑒定的庫搜索算法”[12]，使用VanquishUHPLC系統（購于賽默飛世爾科技公司）耦合QExactiveHF-X質譜儀（購于賽默飛世爾科技公司）進行UHPLC-QE-MS分析。具體色譜條件如下：色譜分析采用UPLCHSST3（ 2.1mm×100mm，1.8μm） ；流動相由 5mmol/L 醋酸銨 .5mmol/L 乙酸水溶液（A）和乙腈（B）組成。梯度洗脫程序設定為： 0～0.7min，1%B;0.7～9.5min 1%～99%B;9.5～11.8 min ，99%B;11.8～12.0min ，99%～1%B ： 12.0～14.8min，1%B ，柱溫 35^°C 。將自動進樣器的溫度設置為 4^°C ，每次的進樣量為 3μL 。

通過Xcalibur軟件（Thermo，ver：4.0.27）獲取光譜數據，在IDA模式下，軟件連續評估全掃描質譜。ESI源條件設置為鞘氣流量 30Arb ，輔助氣流量10Arb ，毛細管溫度 350‰ ，全質譜分辨率60000，質譜/質譜分辨率7500，NCE模式下碰撞能量 10/30/ 60，噴霧電壓（ +4.0kV 或 -3.8kV ）。

為了監測UHPLC-QE-MS系統的穩定性，將所有血清樣本隨機抽取，在樣品序列開始時，先注射2個空白樣品和1個QC樣品以確認基線穩定后，每10個樣品注射一次QC樣品。

1.5統計分析和數據處理

利用ProteoWizard將Xcalibur軟件獲取的原始數據轉換為mzXML格式，再使用R開發的基于XCMS的內部程序將這些數據進行峰值判別、過濾、對齊、整合和識別。將存有這些預處理后數據的Excel文件導入SIMCA-P16.0.2軟件，進行正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA分析），識別出不同的代謝物。樣品的聚集和分散程度在OPLS-DA圖中被展示出來。然后，利用代謝組數據庫HMDB和METLIN進行代謝物鑒定，再用BiotreeDB內部MS2數據庫進行代謝物注釋，注釋的截止值設置為0.3。根據相關條件篩選潛在生物標志物，采用層次聚類分析和相關性分析進行分析。本文數據采用SPSS25.0軟件檢驗兩組之間的顯著性水平， Plt;0.05 為具有顯著性。

2結果

2.1 參加者特征

總共有60例患者符合本次研究的條件，每組30例。采用 χ_t 檢驗對兩組的基本資料進行分析比較，SAP組與CON組在性別、年齡等方面差異無統計學意義（ Pgt;0.05） ；其人口學及臨床特征見表1，數據以均數 ± 標準差表示。

表1兩組受試者人口學及臨床特征

2.2 系統穩定性

通過QC樣品間同位素標記內標混合物響應峰高的差異來判斷穩定性。如圖1所示，內標在QC樣品中的保留時間以及響應強度比較穩定。

注：A為所有QC樣品的同位素標記內標 ESI+ 和ESI-模式EIC;B為QC樣品的UHPLC-QE-MS檢測 ESI+ 和ESI-模式TIC。

圖1QC樣品間同位素標記內標混合物響應峰高

2.3SAP患者與CON組代謝譜之間的差異

經過正負兩種模式的預處理保留了7124個峰和1640個代謝物。用SIMCA16.0.2軟件包（賽多利斯斯泰帝公司，瑞典）對這些包含了峰數、樣本名稱和標準化峰面積信息的數據進行多變量分析。主成分分析顯示SAP組和CON組之間無顯著差異。

為進一步比較血清代謝輪廓的差異，進行了OPLS-DA分析，結果顯示，SAP組和CON組之間具有顯著的差異（如圖2）：（1）差異代謝物的標準為變量投影重要性（variable importance in projection，VIP） gt;1 ：（2）配對 χ_t 檢驗比較單因素統計分析中兩組間鑒定的代謝物的相對量（峰面積）（ Plt;0.05） 。將 ΔVIPgt;1 并且Plt;0.05 的候選代謝物作為差異代謝物，通過代謝組數據庫HMDB和Metlin共鑒定出89個有意義的代謝物，并通過火山圖將結果過濾（如圖3）。在MS2數據庫中評分 gt;0.8 的條件下，26個差異代謝物被篩選出來作為SAP的潛在生物標志物（如表2）。

圖2OPLS-DA圖

注：聚集程度越高，代表樣品中存在的代謝物含量和成分差異越小;若越分散，則差異越大。

圖3火山圖

注：橫坐標代表該組對比各物質的倍數變化;縱坐標表示 log₁₀P 值；散點大小代表OPLS-DA模型的VIP值;紅色代表顯著上調的代謝物；藍色代表顯著下調的代謝物；灰色代表非顯著差異的代謝物。

表2基于UHPLC-QE-MS分析的SAP患者的血清潛在生物標志物

續表2

為更好地了解SAP組和CON組之間的代謝差異和表征代謝物的變化，本實驗進行了層次聚類分析（圖4A）和相關分析（圖4B），觀察到SAP組代謝產物有3種含量增加，23種含量減少。其中，糖基脫氧膽酸、脂肪酸和L-精氨酸含量升高，膽堿、1-磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate，S1P）、 β -胍基丙酸（β-guanidinopropionicacid， β -GPA）、黃嘌呤、溶血磷脂酰膽堿（lysophosphatidylcholine，LPC）等的含量降低。

圖4熱力圖

注：A為血清中潛在生物標志物的聚類分析及相關性分析熱圖：橫坐標代表不同實驗分組，縱坐標代表該組對比的差異代謝物：紅色表示高表達，藍色表示低表達。B為血清樣本中測定的代謝物相關性分析熱圖：橫、縱坐標代表該組對比的差異代謝物，紅色表示正相關，藍色表示負相關，顏色越深代表相關性越強。

2.4 代謝路徑分析

在分析潛在生物標志物的代謝通路時，本研究使用Metaboanalyst5.0軟件，發現了SAP組的7個代謝通路（如圖5）。

圖5通路分析

注： 值表示 P 值取以e為底的負對數（負自然底對數），A為甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，B為精氨酸和脯氨酸代謝，C為D-精氨酸和D-鳥氨酸代謝，D為咖啡因代謝，E為鞘脂代謝，F為甘油磷脂代謝，G為氨酰轉運RNA生物合成，H為嘌呤代謝。

3討論

CHD近年來的患病人數居于心血管疾病第二位，其發病年齡逐漸年輕化，極大地威脅了人類健康，增加了經濟負擔。本研究為了探索更多潛在生物標志物指導SAP的預防、早期診斷和治療，篩選出了26個與氧化應激、糖代謝、脂肪酸代謝和氨基酸代謝等相關的潛在生物標志物。

與CON組相比，SAP組的異棕櫚酸呈下降趨勢，異棕櫚酸屬于單甲基支鏈脂肪酸，可刺激過氧化物酶體增殖物激活受體 α∝^[13] 。過氧化物酶體增殖物激活受體 ∝ 的激活可抑制一些關鍵基因的表達，如載脂蛋白A1、A2等，調節和促進血管內炎癥，參與降脂和動脈粥樣硬化保護，以降低心血管疾病的風險[14]。因此，SAP組血清中較低的異棕櫚酸水平可能與這些患者中較高的炎癥水平相關。

甘氨熊去氧膽酸（glycoursodeoxycholicacid，GUDCA）被認為具有抗凋亡、抗氧化和抗炎特性[5]研究[16發現，GUDCA可減少神經系統中乳酸脫氫酶、腫瘤壞死因子 ∝ 和白細胞介素-1β的產生，并減少神經變性模型中細胞色素C過氧化物酶的產生。另有研究17發現，GUDCA可延緩動脈粥樣硬化的發展，可能與GUDCA下調載脂蛋白A1mRNA受體的表達、減少氧化低密度脂蛋白的攝取以及抑制巨噬細胞泡沫細胞的形成有關。然而，目前尚無GUDCA與CHD及其亞型的病理生理和發展聯系的研究，未來可進一步探究二者之間的聯系。

膽堿是乙酰膽堿的前體，對脂質代謝至關重要。研究[18]表明，膽堿的主要來源是雞蛋、牛奶、新鮮蔬菜、魚、肉和面包，其中動物性食物來源是膽堿攝入的最重要貢獻者。有研究發現，在急性心肌梗死的患者中，其血槳膽堿水平比無急性心肌梗死的患者更低。本研究發現，CON組相對于SAP組，LPC水平有所降低，未來的研究可探索這一觀察結果的潛在機制。

正常心功能所需能量來源于脂肪酸和葡萄糖的代謝。大多數ATP是由心肌細胞中脂肪酸氧化產生[20]。脂肪酸首先在ATP、輔酶A和鎂離子的存在下被酰基輔酶A合成酶催化生成脂酰輔酶A，然后脂酰輔酶A再被轉移到線粒體基質中進行 β 氧化[2]。本研究發現SAP患者的脂質增加，底物的增加表明脂肪酸的氧化可能受到限制，導致缺血心肌ATP生成減少，能量供應不足。

AMP活化的蛋白激酶（AMP-activatedproteinkinase，AMPK）通路是糖代謝和脂代謝的主要調節通路，其在調節細胞能量中起關鍵作用，它被認為可促進 ATP 的產生，同時可抑制 ATP 的消耗[2-23]。AMPK可通過促進葡萄糖攝取和線粒體氧化，維持線粒體呼吸功能，減少氧化應激和炎癥損傷，保護心肌免受損傷[24]。 β -GPA是一種內源性AMPK激動劑[25]。近年來，有研究發現 β -GPA可競爭性地調節肌酸激動活性，從而降低原發性高血壓大鼠的血壓[26]，還可降低骨骼肌細胞中的線粒體耗氧量，增加自噬通量，從而減輕代謝性疾病的影響[27]。然而， β -GPA在心血管疾病方面的研究很少，二者之間的相關性仍然未知。本研究首次發現了在SAP患者和對照組之間存在顯著的血清 β -GPA差異。然而，需開展更大規模患者隊列的進一步研究來驗證這些觀察結果。

LPC是磷脂酰膽堿的代謝產物。在一研究中發現，LPC（ ） .LPC（18：0） 和LPC（ 與CHD的發生和發展直接相關[28]，還有一些研究發現磷脂酰膽堿的多種類型可用于CHD 事件的預測[29]。本研究也在SAP組中發現了多種相關的LPC類型。

有研究[30]發現，內皮細胞S1P受體1在維持血腦屏障功能、微血管通暢以及在缺血狀態下血液通過側支吻合重新流向低灌注腦組織方面發揮著重要作用。另有研究31表明，S1P可通過調節S1P受體1～5減少炎癥反應和心肌細胞凋亡，減輕心臟缺血再灌注損傷，發揮心臟保護作用，保護缺血心肌。在本研究中，SAP組中S1P含量減少可能意味著在這些患者中S1P的心臟保護效果減弱。

本研究發現，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、D-精氨酸和D-鳥氨酸代謝、鞘脂代謝、甘油磷脂代謝、氨酰轉運RNA生物合成、嘌呤代謝等通路與SAP相關。

在前期的一些研究中，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路，D-精氨酸和D-鳥氨酸代謝通路，以及甘油磷脂代謝通路與CHD 的相關性已被確定[32-34]。本研究進一步發現上述3條代謝通路也與SAP相關，這為進一步研究SAP提供了一些新的思路。有研究[35]發現，精氨酸和脯氨酸代謝的異常可能通過影響腫瘤微環境、腫瘤的代謝特征以及免疫逃逸等機制，對肺腺癌的發展產生影響。但這條通路在心血管疾病中的研究還未涉及，本研究發現該通路與SAP相關，這可能是未來的研究方向。

有研究[36]發現，鞘脂可能通過調節心肌細胞增殖、凋亡或炎癥反應影響心臟修復過程，其具有作為心血管疾病預后標志物和治療靶點的潛力。還有研究[7]表明，鞘脂代謝對維持內皮細胞穩態起著至關重要的作用。本研究發現，這條代謝通路也與SAP相關。

在一些研究中發現，氨酰轉運RNA生物合成這一代謝途徑與胃癌和亨廷頓病相關[38-39]，但其與心血管疾病的相關性暫未得到證實。本研究發現這條代謝途徑與SAP相關，這可能為后續的研究提供了一些新方向。多項研究發現，嘌呤代謝與骨質疏松癥[40]、卵巢癌[41]結腸癌[42]等疾病相關。并且，嘌呤代謝在一項研究中被證實與SAP的氧化應激相關[32]，這與本研究得出的結果一致。

需要強調的是本研究存在一定的局限性。首先，本研究納入的樣本量相對較小，還需更大臨床樣本量的研究進一步證實；其次，本研究未收集尿液和組織樣本，無法對所有代謝物進行全面的定性和定量分析；此外，本研究獲得的結果還需更大規模、多中心的前瞻性研究來驗證。

本研究采用UHPLC-QE-MS技術比較和評估SAP組和CON組的血清代謝譜，確定了與SAP相關的異棕櫚酸、糖基脫氧膽酸、膽堿、脂肪酸、 β -GPA、LPC、S1P、L-精氨酸、黃嘌呤等26個生物標志物，以及甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、D-精氨酸和D-鳥氨酸代謝、鞘脂代謝、甘油磷脂代謝、氨酰轉運RNA生物合成、嘌呤代謝7個代謝通路，這些結果可為SAP的進一步研究提供一些新的方向，后續可通過動物實驗如小鼠動脈粥樣硬化模型來驗證是否可用于指導SAP的預防、早期診斷和治療。

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收稿日期：2024-12-09