番茄Slβ-Hex的分子特征及啟動子sgRNA分析

中圖分類號：S641.2；X502 文獻標志碼：A 文章編號：1001-4330（2025）05-1131-08

0 引言

【研究意義】N-糖蛋白在植物細胞器中廣為分布，主要包含寡甘露糖N-聚糖（paucimanno-sidicN-glycans）和復雜N-聚糖（complex N-glycans）兩類低糖鏈[1]。糖苷水解酶（glycoside-hydrolase）屬于糖蛋白類，在細胞壁結構和功能方面具有重要的作用，主要作用于各種糖昔和寡糖，形成游離N-聚糖Glycans，會直接影響果實細胞壁和細胞膜的化學組成成分，從而破壞細胞壁的完整性，導致番茄果實軟化（PriemB，1993）[2]其中β-氨基己糖苷酶（ 是糖苷水解酶家族20（GH20）的成員，屬于外切糖苷酶，催化位于N-糖蛋白非還原性末端的N-乙酰氨基葡萄糖降解，使N-糖蛋白攜帶的復雜N-聚糖變為寡甘露糖N-聚糖，造成游離N-聚糖積累，加速番茄果實成熟軟化[3-4]。果實軟化裂解主要是酶催化的細胞壁聚合物降解的結果，其中糖苷水解酶 β-D-N-ζ 酰氨基己糖苷酶（ （β-Hex） 在果實成熟期間特異性表達，是糖蛋白糖基化最后階段的關鍵酶，對果實的成熟軟化發揮著重要作用。【前人研究進展】利用轉基因技術在番茄中過表達Slβ-Hex會導致果實過度軟化，轉入Slβ-Hex的RNAi基因則會抑制SIβ-Hex的表達，可以降低果實的成熟軟化速率、延長保質期，N－聚糖加工與果實成熟軟化過程有關，為通過突變失活 β-Hex 酶基因的表達，抑制番茄細胞壁水解程度調控番茄果實軟化提供了思路[5-8]。【本研究切人點】目前利用CRISPR-Cas系統靶向編輯加工番茄細胞壁糖苷水解酶相關基因改良耐貯性的報道較少。番茄為呼吸躍變型果實，容易過熟軟化腐爛，嚴重影響番茄的種植和加工。把番茄SIβ-Hex的RNAi基因轉人番茄，能遲滯果實軟化，但轉基因插入植物基因組位點存在不確定性，使得該項技術的推廣應用受到一定限制[9-10] 。目前，以多種新型高效的DNA靶向內切酶為基礎建立的基因組編輯技術，可以對植物靶基因進行定點突變或替換，不必再通過導人反義基因或RNAi基因等外來轉基因調控靶基因功能[1-3] 。而且番茄是自花授粉作物，可較為便利的通過自交分離剔除編輯植株的轉基因組分，為番茄耐貯性改良提供新途徑。【擬解決的關鍵問題】分析番茄 Slβ-Hex 基因的分子特征、數字表達譜及其上游啟動子區域的順式作用元件和sgRNAs分布及特異性，篩選出高特異性的基因編輯靶位點，為利用基因編輯技術調控抑制番茄SIβ-Hex的表達、降低細胞壁水解軟化程度、提高番茄果實耐貯性的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1. 1. 1 Slβ-Hex蛋白質基本特性

利用NCBI搜索SIβ-Hex蛋白質序列及其保守結構域;利用Expasy-ProtParamtool分析Slβ-Hex理化性質。

1.1.2 Slβ-Hex的染色體定位和基因組結構

利用NCBI數據庫查詢Slβ-Hex的cDNA，從GenBank 搜索到 Slβ-Hex 的序列，以Slβ-Hex基因的cds作query，在番茄的基因組數據庫進行Blast，確定Slβ-Hex的基因組結構以及外顯子所在染色體位置。

1.2 方法

1. 2. 1 番茄 Slβ-Hex 基因的克隆

以加工番茄8號幼嫩葉片為材料，采用植物總RNA提取方法提取番茄總RNA；根據NCBI已報道的 β-Hex（GenBankAccession：NM_001247679.2）序列，設計合成特異物，進行RT-PCR擴增、對其擴增產物進行測序對比。

1. 2.2 表達譜的建立

以番茄的功能基因組數據庫（TomatoFunc-tional GenomicsDatabase，TFGD）（http：//ted.bti.cornell.）中RNA-seqdata的數據作基礎，建立Slβ-Hex基于RNA-seq的表達譜。

1.2.3Slβ-Hex啟動子順式作用元件

根據 SIβ-HexgDNA 所在染色體信息，獲取Slβ-Hex基因上游的啟動子序列，利用PlantCare服務器分析SIβ-Hex啟動子序列分布的順式作用元件。

1.2.4 sgRNA的選擇及引物設計

根據CRISPR-Cas系統靶點設計原則，利用CRISPR-P尋找 Solyc01g081610 （ {β-Hex ）的sgRNAs，PAM序列選擇NGG，優先選擇在外顯子上，特異性好，GC含量適中，無特殊RNA結構的序列作為靶標序列并設計引物，挑選2個靶標序列。

2 結果與分析

2.1 Slβ-Hex的分子特征

研究表明，從GenBank搜索到番茄Slβ-Hex的蛋白質序列（GenBankAccession： NP_- 001234608），該蛋白由575個氨基酸組成，平均分子量64023.42 g/mol ，分子式為C2884H4377N757O852S23，不穩定系數為30.14，屬于穩定蛋白。帶負電的殘基總數（ Asp+Glu） 53個，帶正電的殘基總數（ Arg+Lys）38 個，總平均親水性（Grand average of hydropathicity，GRA-VY）為-0.175，屬于親水蛋白。 Slβ-Hex 脂溶指數（Aliphaticindex）為81.55，消光系數131125M-1cm-1 ，理論等電點pI為5.56。

2.2Slβ-Hex的保守域和活性位點

研究表明， Slβ-Hex 含有信號肽，位于第1-23位氨基酸。信號肽下游含有2個保守域，第30-147位氨基酸為Glycoh_ydro_20b2家族保守域，第167-549氨基酸為GH20_HexA_HexB-like保守域，活性位點在178，207，261，330..331，378，404，430，432，494，496位。

2.3Slβ-Hex的基因組結構和定位

研究表明，以Slβ-Hex序列（GenBank Ac-cession：NM_001247679.2）作querry在番茄基因組數據庫進行Blast分析，Slβ-Hex位于番茄的第1號染色體互補鏈（（NC_015438.3），mR-NA1893bp，CDS1728bp，位置在80657804-80660745nt 之間，編碼575aa，分子量為64023.42g/mol ，長 2942nt ，由2個外顯子、1個內含子組成。第1外顯子位于80659673-88660745nt，長1073nt ，編碼區位于80659673-80660450nt，長

778nt ，第2外顯子位于 長 1087nt ，編碼區位于 ，長 950nt ，中間被長度 782nt 的內含子相隔。圖1

2.4 基于RNA-seq的Slβ-Hex轉錄組

研究表明，SIβ-Hex基因在果實中表達量較高，尤其在破色期表達量急劇上升，而在莖、葉、花蕾、花朵中的表達水平較低，驗證了SIβ-Hex是果實成熟相關基因。圖2

Fig.1Slβ-Hex genomic constructure and its location on the chromosome.of tomato

圖1 Slβ-Hex 的基因組結構和染色體位置

圖2基于RNA-seq的番茄栽培品種及野生近緣種醋栗番茄不同組織的 Slβ-Hex 的轉錄組 Fig.2 Transcriptomic analysis of Slβ -Hex in different tissues of tomato cultivars and wild relatives gooseberry tomato based on RNA -seq

注：1.花蕾；2.開放的花；3.1cm大的果實；4. 2cm 大的果實；5. 3cm 大的果實；6.青熟果實；7.轉色果實；8.轉色后期果實；9. 根；10.葉；11.醋栗番茄未熟綠果；12.醋栗番茄轉色果實;13．醋栗番茄轉色后期果實；14.醋栗番茄葉片 Notes：1.unopenedflowerbuds;2.fullyopenedflowers；3.1cmfruits；4.cmfruits；5.3cmfruits;6.maturegreenfruits;7beaker fruits;8.breaker +10 fruits;9.roots;1.laves;11.pimpiellfolumimmaturegeefruits;12.pimpinelifolimbreakerfruits；13.pimpinellfolium breaker +5 fruits ;14.pimpinellfolium leaves.

Slβ-Hex基因在果實的表皮、外果皮、隔膜和種子中均有表達。在SA3中，表皮的表達水平在花后不同時間均高于隔膜和種子，尤其花后7d的表皮表達水平最高；在SA4中，花后7d的隔膜表達水平最高，而在花后4和10d的表皮表達水平高于隔膜和種子。圖3

2.5 Slβ-Hex啟動子順式作用元件分析

研究表明，基因表達主要受其上游的啟動子序列上分布的順式作用元件調控。利用在線工具PlantCare分析Slβ-Hex上游 840bp 啟動子上分布的順式作用元件。結果顯示，該序列除了含有典型的TATA-box、CAAT-box核心啟動子元件外，還分布有ABRE、AE-box，ARE，Box4，G-Box、GCN4_motif，GT1-motif，HD-Zip 3，MYB，MYB-like sequence，MYC，Myb，TCT-motif，TGA-element，chs-CMA2a等順式作用元件。表1

2.6Slβ-Hex啟動子序列 sgRNA分布和評價

研究表明，SIβ-Hex起始密碼子上游 840bp 的啟動子序列上分布著27條sgRNA，其中分布7條正鏈和20條負鏈，其中在起始密碼子上游 140bp 內有7條sgRNA位于外顯子鄰接處或者含有TTTTs序列，因此在使用polIII啟動子時應盡量不選擇。在其他20條sgRNA中，有10條sgRNA含有16個順式作用元件，包含9個CAAT-box，2條TGA-element，2條ARE，另外還含有1個CArG-box和2個ASR1bindingsite，預示若對這些sgRNA進行基因編輯，有可能使其所含的順式元件序列突變，隨之啟動子調控的SIβ-Hex表達模式發生改變，對其進行定點突變使其失活，抑制細胞壁水解程度，進而調控果實過度軟化，改善番茄果實的耐貯性。圖4

注：1.SA3花后4d的表皮和外果皮；2.SA3花后4d的隔膜和種子;3.SA3花后7d的表皮；4.SA3花后7d的隔膜;5.SA3花后7d的種子；6.SA3花后10d的表皮；7.SA3花后 10d 的隔膜；8.SA3花后 10d 的種子；9.SA4花后4d的表皮和外果皮；10.SA4花后4d的隔膜和種子；11SA4花后7d的表皮；12.SA4花后7d的隔膜;13.SA3花后7d的種子;14.SA3花后10d的表皮；15.SA3花后10d的隔膜;16.SA4花后10d的種子。

圖3 基于RNA-sequence的番茄 Slβ-Hex 在果實不同部位的轉錄組 Fig.3 TheSlβ-Hextranscriptomeprofilingofthreefruit tissuesd baded on RNA -sequence

表1 Slb-Hex 啟動子順式作用元件

Tab.1 Predicted cis-regulatoryelements in Slb-Hex promoter

2.7 加工番茄Slβ-Hex基因的克隆

研究表明，以加工番茄8號的RNA為模板，以設計的 Slβ-Hex-F/Slβ-Hex-R 為引物，進行RT-PCR擴增，對其擴增產物進行測序獲得Slβ-Hex的cDNA 序列，CDS大小為 1728bp 。表2，圖5

2.8Slβ-HexsgRNA的篩選、設計和選擇

研究表明，利用CRISPR－P尋找 Solyc01g 081610（β-D-N-乙酰氨基己糖苷酶，β-Hex）的sgRNA，PAM序列選擇NGG，N為任意核苷酸，優先選擇在外顯子上，特異性好，GC含量適中，無特殊RNA結構的序列作為靶標序列并設計引物，一個基因挑選2個靶標序列。篩選出的 β -Hex兩個靶點在一個外顯子上。表3，圖6

3討論

3.1游離N－聚糖是促進果實成熟的重要信號分子，注射外源游離N－聚糖能加速番茄果實成熟軟化[14]。 β-Hex 在果實成熟軟化過程中特異性表達，參與果蔬果實的成熟軟化過程， β -hex可催化N-糖蛋白攜帶的復雜N-聚糖變為寡甘露糖N-聚糖，造成游離N-聚糖積累，加速成熟番茄果實的軟化[15-16]。研究發現，利用 RNAi干擾技術抑制a-Man或 β-Hex 表達后均可提高番茄果實硬度和延長保質貯藏時間，而且未對包括產量在內的其他表型性狀產生負面影響[5]RNAi技術一般是把反向重復基因序列通過轉基因導入植物，轉錄產物通過序列互補形成雙鏈結構，雙鏈RNA降解成小片段RNA，觸發細胞內同源mRNA降解，阻斷靶基因的表達。RNAi是轉錄后水平的基因沉默（post-transcriptionalgenesilencing，PTGS）。能否在轉錄水平上調控Slβ-Hex基因的表達，值得進一步探討。

圖4 Slβ-Hex 啟動子包含的誘導型順式作用元件和sgRNAs

Fig. 4The position of cis-acting elements and sgRNAs in the promoter of Slβ-Hex

圖5Hex 電泳 CDL 2000 Marker：2000、1000、750、500、250 和100 bpFig.5 Hex electroph-0res is 2000、1000、750、500、250 and 100 bp

圖6雙sgRNA靶位點在SIβ-Hex中的位置

Fig.6The position of the dual sgRNA targeting sife in Slβ-Hex

表2 基因克隆所用引物

Tab.2 Primersusedinthisstudy

表3包含β-HexsgRNA的引物序列

Tab.3 Primer sequence containingβ -Hex sgRNA

啟動子是位于結構基因5端上游的一段DNA序列，它調控著下游基因的表達方式[17]。本研究基于RNA-seq的Slβ-Hex的轉錄組分析表明，SIβ-Hex在果實中表達量較高，尤其在破色期表達量急劇上升，而在莖、葉、花蕾、花朵中的表達水平較低，進一步證實了SIβ-Hex啟動子主要驅動SIβ-Hex基因在果實中表達，促進果實成熟軟化。降低 Slβ-Hex 啟動子的活性，在轉錄水平調控 Slβ-Hex 的表達量，將為提高番茄耐貯性開辟新途徑。

3.2啟動子本身不編碼任何蛋白質，對下游基因的表達調控主要通過其包含的順式作用元件與對應的反式作用因子的結合來實現。SIβ-Hex啟動子包含眾多順式作用元件，其中一些重要元件包含在sgRNA序列中，預示著利用基因編輯技術可以敲除這些元件，改變啟動子的功能[18]。番茄MADS-box 轉錄因子SIRIN（RIPENING IN-HIBITOR）是果實成熟過程中的正調控因子[19]在RIN轉錄因子功能缺失的rin突變體中，許多成熟相關的代謝途徑受到影響。轉錄因子ASR1（Abscisicacid stressripening1）是非生物脅迫調控基因編碼的低分子量植物特異性蛋白質。當番茄中的 SIRIN 或 SIASR1 的表達被抑制時，SIβ-Hex啟動子活性降低、Slβ-Hex酶表達量減少[20]。SIRIN 和 SIASR1 分別與 SIβ－Hex 啟動子含有的順式作用元件CArG-box和ASR1結合位點（C2-3（C/G）A）結合[21]，調控 Slβ-Hex 啟動子活性。研究表明，在Slβ-Hex基因起始密碼子上游840bp的啟動子序列中，含有3個CArG-box和2個ASR1結合位點，其中1個CArG-box和2個ASR1結合位點分別包含在sgRNA序列中，預示著可以利用基因編輯技術將這3個順式元件敲除，降低Slβ-Hex啟動子活性，在轉錄水平調控SIβ-Hex的表達，提高番茄耐貯性。

番茄Slβ-Hex是一個基因家族，基因組搜索結果表明，還存在 Slβ-Hex2 和 Slβ-Hex3 ，分別位于第5和第11條染色體上，3條 Slβ-Hex 基因在基因組結構、序列組成、表達模式等方面存在顯著差異。進一步探明3個基因及其上游啟動子的功能和調控模式，將為進一步利用基因編輯技術精準改善番茄耐貯性及其它相關重要農藝性狀提供依據。

4結論

番茄Slβ-Hex基因位于番茄第1號染色體的互補鏈上，由2個外顯子、1個內含子組成，編碼575個氨基酸。Slβ-Hex含有Glycoh_ydro_20b2家族保守域和GH20_HexA_HexB-like保守域。基于RNA-seq 的SIβ-Hex 轉錄組分析表明， Slβ-Hex 主要在番茄的果實中表達，尤其在果皮中表達量較高。分析SIβ-Hex起始密碼子上游 840bp 的啟動子序列分布的順式作用元件，該序列除了含有典型的TATA-box和CAAT-box核心啟動子元件外，還分布有ABRE、AE-box，ARE，Box4，G-Box、GCN4_motif，GT1-mo-tif，HD - Zip 3，MYB，MYB - like sequence，MYC，Myb，TCT- motif，TGA-element，chs-CMA2a等眾多順式作用元件。在線工具CRISPRdirect分析表明，該啟動子的正鏈分布7條sgRNA，負鏈分布20條sgRNA，其中的10條sgRNA含有16個順式作用元件，包含9個CAAT-box，2個TGA-element，2個ARE，2個ASR1binding site，1個 CArG-box ，根據CRISPR-Cas9靶點設計原則，最終篩選出的 β-Hex 兩個靶點在一個外顯子上，預示選用高特異性sgRNA進行基因編輯，有可能使其所含的順式元件序列突變，抑制改變 Slβ-Hex 的表達，調控果實過度軟化，從而提高番茄果實的耐貯性。

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Molecular characteristics and promoter analysis of Slβ-Hex gene in tomato

ZHANG Xiying，LIU Jiangna，BAI Yunfeng，LI Rongxia，ZHANG Aiping （Institute of Agricultural Sciences， Sixth Division， Xinjiang Production and Construction Corps ，Wujiaqu Xinjiang 831300，China）

Abstract：【Objective】Playing an important role in fruit ripening and softening，In order to inactivate the tomato cell wall glycoside hydrolase gene β-Hex by mutation of CRISPR -Cas system and inhibit the degradation of n -glycoprotein and the production of free n-glycan，to reduce the degree of hydrolytic softening of cell wall and regulate the excessive softening of tomato fruit lay the foundation for further research. CRISPRCas gene editing system will be used to regulate tomato fruit softening by site-specific mutation. 【Methods】 The characteristics，conserved domain，genome structure，digital expression profile and promoter cis-acting elements of Slβ-Hex polypeptide were systematically analyzed using biological online tools，and suitable sgRNAs were designed and screened according to CRISPR - Cas9 target design principles to promote the construction of tomato gene editing efficient expression vector.【Results】 Tomato SLβhex gene was located on the complementary chain of tomato chromosome 1，and composed of 2 exons and1 intron，encoding 575 amino acids. Transcriptome analysis of Slβ -Hex based on RNA -seq showed that Slβ -Hex was mainly expressed in the fruit of tomato，especiallyin the peel.The positive chain of the promoter distributed7 Sgrnas，negative chain distributed 2O Sgrnas，of which 10 Sgrnas contained 16 cis-acting elements.【Conclusion】High - specific sgRNA is selected for gene editing to mutate the cis -element sequence and inhibit the expresion of Slβ - Hex.

Key words：tomato； molecular characteristics of Slβ -Hex； promoter; Cis -acting element； sgRNA