火龍果中仙人掌X病毒實時熒光定量PCR檢測體系的建立及應用

摘要

仙人掌X病毒（cactus virus X，CVX）嚴重威脅世界火龍果產業的發展。為實現對該病毒的定量檢測，本研究根據CVX外殼蛋白（CP）的保守序列設計特異性引物CVXF/R，建立了引物濃度150 nmol/L，退火溫度62℃的SYBR Green I實時熒光定量PCR檢測方法。該引物擴增效率為97.38%，R2為0.996 5，對標準品的檢測極限濃度為8×102拷貝/μL，其靈敏度是普通PCR的100倍。對火龍果不同組織中CVX的相對表達量進行檢測發現，病毒在花絲中的含量最高，之后依次為花萼、花瓣、嫩枝、老枝和根。對采自貴州黔南州的40份火龍果樣品進行檢測，共檢測出32份陽性樣品。上述結果表明，本研究建立的實時熒光定量PCR特異性強、靈敏度高，為今后CVX的檢測提供了重要的技術補充。

關鍵詞

仙人掌X病毒; 火龍果; 實時熒光定量PCR; 檢測

中圖分類號：

S 436.67

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2024443

Establishment and application of a realtime fluorescence quantitative PCR assay for the detection of cactus virus X in pitaya

BAI Ziqin*， LUO Hui*， XIE Pu， ZHENG Wei， LIU Tao

（Fruit Research Institute， Guizhou Academy of Agricultural Sciences， Guiyang 550000， China）

Abstract

Cactus virus X （CVX） poses a significant threat to global pitaya （dragon fruit） production. To enable accurate quantification of CVX， this study developed a realtime fluorescence quantitative PCR （RTqPCR） assay using SYBR Green I. Specific primers （CVXF/R） targeting the conserved region of the CVX coat protein （CP） gene were designed. The optimized assay conditions included a primer concentration of 150 nmol/L and an annealing temperature 62℃. The amplification efficiency was 97.38%， with a correlation coefficient value （R2） of 0.996 5. The assay had a detection limit of 8×102 copies/μL， exhibiting a 100fold greater sensitivity than conventional PCR assay. CVX titers in various pitaya tissues were quantified， with the highest viral load detected in filaments， followed by calyx， petals， young stems， mature stems and roots. Among 40 pitaya samples collected from Qiannan prefecture， Guizhou province， 32 tested positive for CVX using this RTqPCR method. These results demonstrate that the developed RTqPCR assay offers high sensitivity and strong specificity， providing an effective tool for CVX detection and epidemiological studies.

Key words

cactus virus X; pitaya; realtime fluorescence quantitative PCR; detection

火龍果Selenicereus undatus又名霸王花，為多年生攀援肉質灌木，屬于仙人掌科Cactaceae蛇鞭柱屬 Selenicereus。火龍果原產于中南美洲，因其易栽培，果實營養豐富，具有良好的經濟價值和社會效益，目前廣泛種植于我國福建、廣東、廣西、海南、臺灣和貴州［1］。由于火龍果主要通過扦插無性繁殖，易于病毒的積累和傳播，因此病毒病害成為阻礙我國火龍果產業發展的重要因素之一。

仙人掌X病毒（cactus virus X，CVX）是馬鈴薯X病毒屬Potexvirus中一種桿狀、大小為520 nm×13 nm的正義單鏈RNA病毒［2］。CVX最早于1958年在德國的單刺仙人掌Opuntia monacantha上被發現［3］，隨后中國、委內瑞拉、韓國、美國、馬來西亞等也相繼有該病毒發生的報道［48］，其中，我國于1996年首次在臺灣省檢測出CVX，目前已在海南和貴州省等火龍果產區流行，對火龍果的產量和品質造成了嚴重影響［4， 910］。CVX寄主廣泛，可通過嫁接、扦插或摩擦的方式侵染仙人掌、蟹爪蘭、曇花和火龍果等仙人掌科中幾十個屬的植物，以及香蕉等經濟作物［1112］。除典型的系統性斑駁黃化外，CVX在不同寄主上還能產生不規則的褪綠暈圈、紅棕色邊緣的斑點、淺表凹陷壞死等癥狀［8］。

鑒于CVX與馬鈴薯X病毒屬的其他病毒造成的癥狀容易產生混淆，且目前缺乏有效的防治藥劑，因此使用無病毒種質是防控CVX最重要的手段，而建立快速、準確的檢測方法，對CVX的防控具有重要意義［11］。目前已基于多種技術建立了CVX的檢測方法，其中包括逆轉錄聚合酶鏈式反應（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RTPCR）和逆轉錄環介導等溫擴增（reverse transcription loopmediated isothermal amplification，RTLAMP）［9，13］。但是這些方法都無法對CVX進行定量分析。為此，本研究建立了一種基于SYBR Green Ⅰ的實時熒光定量PCR檢測方法，以期為CVX的早期預防、準確監測和定量研究提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

分別感染CVX，蟹爪蘭X病毒（Zygocatus virus X，ZyVX），仙人指X病毒（Schlumbergera virus X，SchVX）和火龍果X病毒（pitaya virus X，PiVX）的火龍果植株和1年生實生健康火龍果植株由貴州省農業科學院果樹科學研究所保存。所有樣品經RTPCR檢測后確定攜帶目標病毒;火龍果不同組織中CVX的含量測定試驗所用樣品于2024年6月在貴州省羅甸縣采集;田間樣品檢測所用40份表現黃綠色斑駁及不規則褪綠斑點的樣品于2023年6月-9月采集于貴州省羅甸、望謨、冊亨、鎮寧等縣。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及逆轉錄

使用EASYspin Plus多糖多酚/復雜植物RNA快速提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）提取1.1中所述樣品總RNA后，利用PrimeScriptRT reagent Kit（TaKaRa）將獲得的總RNA逆轉錄生成cDNA。

1.2.2 PCR擴增、克隆與測序

根據CVX分離株（BK011045）外殼蛋白（CP）的保守序列，使用Primer Explorer 5.0設計特異性引物：CVXF：5′CCAAACCTTGTCCTCCTCCC3′和CVXR：5′GAAGACCCGTTGTCAAAGCA3′。預期擴增片段長度為180 bp。用NCBI的PrimerBLAST 進行引物的特異性驗證。反應體系為：2×Green Taq Mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司） 10 μL， CVXF/R（10 μmol/L）各0.3 μL，ddH2O 8.4 μL，1 μL cDNA。擴增程序：95℃ 3 min;95℃ 20 s，62℃ 15 s，72℃ 20 s，35個循環;72℃延伸5 min。PCR產物經DNA純化回收試劑盒（TaKaRa）純化后連接到pGEMT Easy Vector（Promega），并轉化大腸桿菌JM109感受態細胞（上海唯地生物技術有限公司）。經PCR鑒定后隨機挑選3個陽性菌落送北京擎科生物科技股份有限公司測序。

1.2.3 檢測體系的優化

以CVX陽性樣品總RNA逆轉錄合成的cDNA為模板，使用實時PCR儀qTOWER3G IVD（德國Analytik Jena公司）進行擴增。20 μL反應體系包括：cDNA模板1 μL、BlasTaqTM 2×qPCR Master Mix（上海唯地生物技術有限公司） 10 μL、10 μmol/L CVXF/R（分別設置100、150、200 nmol/L共3個引物濃度），超純水補足至20 μL。擴增條件：95℃預變性3 min;95℃變性15 s，退火15 s（分別設58℃、60℃、62℃、64℃和66℃共5個退火溫度），72℃延伸20 s，40個循環。以熔解曲線峰單一且CT值小為標準，篩選最佳引物濃度及最佳退火溫度。

1.2.4 標準品制備和標準曲線構建

選擇序列正確的陽性克隆樣品用于質粒提取。利用NanoDrop One/OneC微量UVVis分光光度計（美國Thermo Scientific公司）測定質粒濃度，并將其按10倍梯度稀釋成8×102～8×109拷貝/μL的標準品，每個樣品進行3個技術重復，用于標準曲線的構建并計算擴增效率［14］。

1.2.5 檢測體系特異性和靈敏度檢測

以分別感染ZyVX、SchVX和PiVX的火龍果植株總RNA反轉錄生成的cDNA用于CVX實時熒光定量PCR法的特異性檢測。以8個濃度梯度（8×102～8×109拷貝/μL）的質粒標準品作為模板用于普通PCR和實時熒光定量PCR的靈敏度檢測。

1.2.6 火龍果中CVX的空間分布

共采集9株經RTPCR檢測為CVX陽性的火龍果植株不同組織（嫩枝、老枝、根、花瓣、花萼和花絲），每3株植株各組織混為1個樣品，共3個樣品，每個樣品進行3次技術重復。按照1.2.1中的方法，提取不同組織的總RNA。鑒于actin基因在火龍果中的表達量較高且穩定［15］，且擴增效率與CVX引物的相近（前者為98%，后者為97.38%），因此以actin基因為內參，引物序列為actinF： 5′GCGGCAGACCACCTACAACTC3′和actinR： 5′GCGGATTCATCGT

ATTCACCC3′［16］，依據2-ΔΔCT計算不同組織CVX的相對表達量。采用Tukey檢驗結果差異顯著性。

1.2.7 田間樣品檢測

2023年在貴州省黔南州火龍果產區，采集了40份表現斑駁癥狀，疑似感染病毒的火龍果樣品，采用普通PCR和實時熒光定量PCR法進行檢測。

2 結果與分析

2.1 RTPCR擴增與克隆鑒定

以提取的火龍果植株總RNA為模板，用引物CVXF/R進行RTPCR 擴增，結果顯示，部分樣品及陽性對照均能擴增出1條大小為180 bp的特異性條帶，健康樣品無特異性擴增。序列經BLAST比對，其與CVX分離物（BK011045）相應序列的相似性為100%，由此確定擴增片段正確。

2.2 CVX實時熒光定量PCR檢測體系的優化

以感染CVX植株的總RNA為模板，優化引物濃度和退火溫度。所用引物濃度均為150 nmol/L，退火溫度62℃時，相對熒光強度最高，CT值最小（圖1），且熔解曲線為單一峰。后續試驗均使用優化后的反應體系進行擴增。

2.3 標準曲線的建立

采用優化的反應體系進行檢測，結果顯示，以8×102～8×109拷貝/μL濃度的質粒標準品為模板時，所得CT值與模板濃度呈良好的線性關系。線性方程為y=-3.386 3x+39.612 （y為CT值，x為質粒濃度的對數值），R2=0.996 5，擴增效率為97.38%（圖2）。

2.4 特異性檢測

分別檢測感染CVX、ZyVX、SchVX、PiVX的火龍果樣品。結果顯示，僅有感染CVX的樣品出現了正常的擴增曲線，其他樣品均無明顯擴增曲線，且熔解曲線無峰，結果表明該方法可用于特異性檢測CVX（圖3）。

2.5 實時熒光定量PCR和普通PCR靈敏度比較

以準備的質粒標準品為模板，比較實時熒光定量PCR和普通PCR的靈敏度。結果顯示，實時熒光定量PCR對CVX的檢測限為8×102 拷貝/μL，普通PCR的檢測限為8×104 拷貝/μL。表明實時熒光定量PCR檢測CVX的靈敏度為普通PCR的100倍（圖4）。

2.6 不同組織火龍果CVX相對表達量

為明確CVX在火龍果中的空間分布，使用實時熒光定量PCR檢測火龍果病株嫩枝、老枝、根、花瓣、花萼和花絲的CVX相對表達量。檢測結果顯示花絲中CVX的相對表達量（25.71）最高，其次依次為花萼（5.12）、花瓣（2.83）、嫩枝（1.00）、老枝（0.43）和根（0.39）（圖5）。由此可見，花是最佳檢測部位，其次可選擇嫩枝進行檢測。

2.7 田間樣品檢測

應用本研究所建立的實時熒光定量PCR檢測方法對采自黔南州羅甸、望謨、冊亨、鎮寧等縣的40份黃綠色斑駁及不規則褪綠斑點的枝條進行檢測。結果發現，共有32份樣品檢測出了CVX（表1），樣品CVX平均檢出率為80%。

3 結論與討論

CVX是危害火龍果的主要病毒之一，近年來在我國海南、貴州等多個火龍果產區蔓延，引起植株莖干斑駁黃化，樹勢減弱，產量和品質降低，嚴重威脅了火龍果產業的健康發展［1，910］。因此對田間CVX的發生情況進行早期的定量檢測與監控具有十分重要的意義，目前國內外尚無CVX的定量檢測方法。本研究以在植物病毒中較為保守的CP基因作為靶標設計引物，通過優化引物濃度和退火溫度建立了特異性強、靈敏度高的CVX實時熒光定量PCR檢測方法。該檢測方法在以質粒作為標準品時R2為 0.996 5，擴增效率為97.38%，且CT 值與其拷貝數顯示出良好的線性關系，這表明該體系具有較好的檢測效率。

在對40份田間樣品進行檢測時發現，本試驗建立的實時熒光定量PCR檢測方法與普通PCR的檢測結果具有一致性。但前者能準確檢測植株中CVX的含量，且更適用于對低豐度病毒樣品的檢測。此外，運用此方法對6月-9月采集的田間樣品檢測結果表明，該方法檢測的樣品采集不受高溫季節的限制，為CVX的早期監測、預警以及有效防控提供了重要的技術支撐。本研究在貴州火龍果產區采集樣品過程中，發現田間枝條病毒病癥狀普遍顯現，主要類型有系統性斑駁黃化、不規則褪綠暈圈或斑點、扭曲變紅、淺表凹陷壞死等，結合本研究中CVX在顯癥枝條上的平均檢出率結果，可初步判斷貴州火龍果產區已經受到CVX威脅，因此今后在發展火龍果產業時應加大對苗木/繁殖材料的監管力度。

參考文獻

［1］ 秦永華. 火龍果優質豐產栽培彩色圖說［M］. 廣州： 廣東科技出版社， 2022.

［2］ ATTATHOM S， WEATHERS L G， GUMPF D J， et al. Identification and characterization of a potexvirus from California barrel cactus ［J］. Phytopathology， 1978， 68（10）： 14011406.

［3］ AMELUNXEN F. Die viruseiweiβspindeln der kakteen. darstellung， elektronenmikroskopische und biochemische analyse des virus ［J］. Protoplasma， 1958， 49： 140178.

［4］ CHEN M J， TZENG D D. Identification of cactus X potexvirus in Taiwan and localization of its existence and multiplication in infected cells ［J］. Plant Pathology Bulletin， 1996， 5（1）： 6367.

［5］ IZAGUIRREMAYORAL M L， MARYS E. Interactions between irradiance levels and cactus X virus infection on the crassulacean acid metabolism in Nopalea cochenillifera and Acanthocereus tetragonus plants ［J］. Journal of Plant Physiology， 1996， 149（1/2）：3542.

［6］ KIM J S， PARK C Y， NAM M， et al. First report of cactus virus X infecting Hylocereus undatus in Korea ［J］. Plant Disease， 2016， 100（12）：2544.

［7］ GAZIS R， POUDEL K， DEY K K， et al. First report of cactus virus X in Hylocereus undatus （dragon fruit） in Florida ［J］. Plant Disease， 2018， 102（12）：2666.

［8］ MASANTO M， SIJAM K， AWANG Y， et al. First report of necrotic spot disease caused by cactus virus X on dragon fruit （Hylocereus spp.） in Peninsular Malaysia ［J/OL］. Journal Perlindungan Tanaman Indonesia， 2018， 22（1）： 1. DOI： 10.22146/jpti.23763.

［9］ 管麗婷， 文曉鵬， 洪怡， 等. 火龍果主要病毒RTPCR檢測方法的建立及應用［J］. 中國南方果樹， 2019， 48（5）： 2832.

［10］PENG Chao， YU Naitong， LUO Zhiwen， et al. Molecular identification of cactus virus X infecting Hylocereus polyrhizus （Cactaceae） in Hainan Island， China ［J］. Plant Disease， 2016， 100（9）： 1956.

［11］EDZEL E， DARBY J T， ANGELO M B， et al. A brief review of plant diseases caused by cactus virus X ［J/OL］. Crop Protection， 2021， 143： 105566. DOI： 10.1016/j.cropro.2021.105566.

［12］MIAH B， JEONG H L， DONG R J， et al. First report of cactus virus X infecting banana （Musa spp.） in Korea ［J/OL］. Journal of Plant Pathology， 2022， 104（3）： 1137. DOI： 10.1007/s4216102201097z.

［13］ZHANG Yuliang， HUANG Qixing， YIN Guohua， et al. Rapid detection of cactus X virus in pitaya by an efficient reverse transcription loopmediated isothermal amplification ［J］. Austin Journal of Biotechnology amp; Bioengineering， 2016， 3（1）： 1055.

［14］陳洪明， 周彥， 王雪峰， 等. 應用實時熒光RTPCR檢測柑橘黃化脈明病毒［J］. 園藝學報， 2016， 43（1）： 168174.

［15］CHEN Canbin， WU Jingyu， HUA Qingzhu， et al. Identification of reliable reference genes for quantitative realtime PCR normalization in pitaya ［J/OL］. Plant Methods， 2019， 15： 70. DOI： 10.1186/s1300701904553.

［16］楊鵾. 火龍果干旱響應miRNA/isomiR的克隆及靶基因驗證［D］. 貴陽： 貴州大學，2019.

（責任編輯：田 喆）