重組膠原蛋白在不同離體皮膚滲透性差異研究

在醫學與化妝品領域，皮膚滲透性研究一直占據著重要地位。在醫學上，了解皮膚滲透性對藥物經皮吸收效果的影響，有助于開發更有效的透皮治療方案[1]。而在化妝品領域，皮膚滲透性則關乎各類功效成分能否安全且有效地作用于皮膚深層[2]。離體皮膚模型被廣泛應用于研究皮膚的滲透性[3，4]。

然而，不同種屬來源以及同一種屬不同部位的離體皮膚，其結構和功能存在顯著差異，這些差異會直接導致皮膚滲透性的不同[5，6]。

目前，離體豬皮和離體鼠皮是最為常用的代替人體皮膚的模型。然而，離體豬皮在組織結構上與人體皮膚較為相似。離體鼠皮成本低、易獲取，在初步篩選研究中被廣泛應用，二者在結構和功能上存在差異，對化妝品成分的滲透性表現也存在著差別[5，7，8]。

本研究通過Franz擴散池研究RHCⅢ在兩種離體皮膚滲透量的差異，并借助二次諧波（secondharmonicgeneration，SHG）結合雙光子熒光（two-photonexcitedfluorescence，TPEF）成像技術直觀呈現RHCⅢ在兩種離體皮膚透皮行為的差異，明確這兩種離體皮膚的滲透性差異，對于化妝品的配方優化、安全性評估以及功效預測有著重要意義。本研究旨在深入探討離體豬皮和離體鼠皮的滲透性差異，為化妝品的透皮性能測試方面提供科學依據。

Part1

材料和方法

1.1材料、試劑與儀器

RHCⅢ（分子量55kDa，純度≥95%），江蘇江山聚源生物技術有限公司；BCA試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司；iFluor?405succinimidylester，AATBioquest；透析袋（lt;1kDa），南京森貝伽生物科技有限公司。TK-12D透皮擴散儀（藥物透皮試驗儀），上海玉研科學儀器有限公司；SpectraMaxM2e型多功能酶標儀，美谷分子儀器（上海）有限公司；LSM880NLO雙光子激光共聚焦顯微鏡，卡爾蔡司光學有限公司；LeciaCM1950冷凍切片機，徠卡顯微系統（上海）貿易有限公司。

1.2離體皮膚采集

離體豬皮由邳州市東方養殖有限公司提供，取自巴馬香豬（合格編號：202360244），離體鼠皮取自6～8周齡SD大鼠。取皮前清洗全身皮膚，電動脫毛器小心剃去背部皮膚的被毛，切斷巴馬香豬前肢動脈使其缺血致死（大鼠斷頸處死），剝離背部皮膚，把皮膚平鋪在干凈的玻璃板上，讓角質層向下，用小刀片沾生理鹽水剔除皮下脂肪、組織和毛細血管，然后用生理鹽水反復沖洗干凈、擦干，用鋁箔紙包裏置于儲存袋中，-20℃保存備用。

1.3重組膠原蛋白皮膚透過量分析

1.3.1受試物制備

取RHCⅢ100mg，溶于10mL生理鹽水中，配制為質量分數1%溶液，蛋白質溶液的濃度為10mg/mL。

1.3.2皮膚暴露與蛋白含量測定

開啟透皮擴散儀，調節轉速為300r/min，水浴溫度達到（32±0.5）℃。接收池加入8mL的生理鹽水，將解凍好的兩種離體皮膚從儲存袋中取出，用生理鹽水洗凈后再用吸水紙將皮膚表面的水分沾干，裁剪為2.5cm×2.5cm的正方形。將豬皮和大鼠皮固定于擴散池的供給室與接受池之間，角質層朝上，排盡接收池內的氣泡，擴散池組裝好后平衡20min。兩種離體皮膚均設置生理鹽水對照組和受試物組（RHCⅢ組），對照組供給池加入1mL生理鹽水，受試物組供給池加入1mLRHCⅢ溶液，每組設三個平行。將擴散池放入水箱上部相應槽孔內，于第1h、2h、4h、6h、8h、12h從接收池中取樣1mL，將樣液置于試管中，然后向接收池補充1mL生理鹽水。

采用BCA法分析接收液中的蛋白質含量。接收液按下列公式計算各時間點的單位面積累積透皮滲透量（Qn，mg/cm2）。式中，Qn為單位面積累積透皮量，Cn為第n次取樣時蛋白質濃度，V為接收池體積（8mL），Ci為第i次取樣時蛋白質濃度，Vi為第i次取樣時取樣體積，A為有效接觸面積（2.2cm2）。

1.3.3數據統計與分析

使用Origin21軟件進行數據處理，采用獨立樣本Student'st-test檢驗，plt;0.05表示差異有統計學意義。

1.4重組蛋白熒光成像

1.4.1熒光標記

取RHCⅢ100mg溶于10mL1M磷酸鹽緩沖液（pH8.5–9.0）制備RHCⅢ的10mL蛋白標記儲備液。向iFluor405（1mg）中加入無水DMSO1mL得到熒光染液。然后，將1mL的熒光染液加入蛋白標記儲備液中并充分搖動。將反應混合物在4℃下旋轉12h。將反應混合物裝入透析袋（lt;1kDa）中并在黑暗中置于含有超純水的大燒杯中。每2h更換一次水，直到在超純水中沒有檢測到熒光，透析袋內溶液熒光強度不再變化，說明游離的未被標記的熒光染料已全部被析出，將反應混合物取出得到iFluor-RHCⅢ。

將1mL的熒光染液加入10mL1M磷酸鹽緩沖液（pH8.5–9.0）的小瓶中并充分搖動，作為對照溶液。

1.4.2皮膚暴露

組裝擴散池，分別取iFluor-RHCⅢ溶液及iFluor405對照溶液1mL置于供給室上方，用錫箔紙覆蓋供體蓋。將擴散池放入水箱上部相應槽孔內，每組設三個平行。

加入iFluor-RHCⅢ的時刻為起始時間，12h后，吸出擴散池中供給室上殘留的樣品，用生理鹽水清洗皮膚表面3—5次后，將擴散池中皮膚取出，立刻進行熒光圖像采集與皮膚切片。

1.4.3皮膚組織的SHG-TPEF成像

通過雙光子激光共聚焦顯微鏡從真皮獲得圖像。使用950nm的激發波長和465—485nm的發射濾光片來隔離SHG信號，使用405nm的激發波長和420—450nm的發射濾光片獲取TPEF信號圖像。將所得圖像進行ZEISSZEN3.10圖像渲染處理。

1.4.4皮膚切片的SHG-TPEF成像

通過冷凍切片采集皮膚縱切面，切片厚度10μm。重復上述掃描過程以觀察兩種iFluor-RHC及iFluor405對照溶液的透皮吸收情況。激光條件設置與用于上述SHG-TPEF皮膚成像的激光條件設置一致。

Part2

結果與討論

2.1重組膠原蛋白皮膚透過量

擴散池法測試RHCⅢ在兩種皮膚的經皮吸收結果見表1，結果顯示在豬皮組、受試物組和對照組接收液中累計蛋白滲透量并無明顯差異（pgt;0.05），表明豬皮組接收池中的蛋白均來自離體皮膚中的蛋白滲透，而非受試物，RHCⅢ并未穿過皮膚進入接收池中。而在鼠皮組，受試物組的累計蛋白滲透量顯著高于對照組（plt;0.05），表明RHCⅢ已透過皮膚進入接收池中，并且隨著透皮時間的延長，RHCⅢ的透皮量顯著增加（圖1）。

2.2皮膚組織的SHG及雙光子熒光成像

在加入iFluor-RHCⅢ溶液12h后，首先掃描SHG信號確定皮膚真皮層，進一步掃描TPEF信號。結果如圖2所示，紅色為SHG信號即真皮層中的膠原蛋白，藍色為熒光標記的RHCⅢ與iFluor405的TPEF信號。在豬皮真皮層中可檢測到iFluor405的TPEF信號，表明iFluor405滲透角質層并到達真皮層，而未檢測到iFluor-RHCⅢ，表明RHCⅢ未透過皮膚表層進入真皮層中。在大鼠皮膚真皮層中均可檢測到iFluor405和iFluor-RHCⅢ，表明iFluor405和iFluor-RHCⅢ均可透過皮膚角質層屏障，到達皮膚真皮層。

2.3皮膚切片的SHG及雙光子熒光成像

為了測試結果是否存在假陽性，通過皮膚切片進行垂直平面觀察。結果顯示，離體豬皮中iFluor405已進入皮膚深層，而iFluor-RHCⅢ僅停留在豬皮表層，未通過皮膚角質層。離體鼠皮中iFluor-RHCⅢ和iFluor405均可通過皮膚角質層，到達皮膚真皮層，這與真皮層的SHG-TPEF成像的結果一致（圖3）。

2.4討論

本研究結果顯示，離體鼠皮的皮膚滲透性明顯高于離體豬皮，這一結果與兩種離體皮膚的結構和功能差異密切相關。

從結構上看，豬皮表皮層厚度為12～15μm，角質層神經酰胺與膽固醇的比例較高，接近人類皮膚的屏障特性；而大鼠表皮層較薄，角質層的神經酰胺與膽固醇比例低于豬皮，導致屏障功能較弱[9-11]。在細胞外基質（extracellularmatrix，ECM）與真皮結構方面，豬皮的ECM成分（如膠原蛋白、糖蛋白）與人類高度相似，膠原纖維排列更均勻有序，真皮層較厚；大鼠皮膚ECM組成與人類差異較大，真皮層較薄[12]。此外，豬皮毛囊形態和密度與人類相似，大鼠毛囊較小且結構不同并且密度較高，從而為物質的滲透提供了更多的通道[11，13]。

在功能方面，雖然兩者都具備皮膚的基本屏障功能，但由于進化和生理特性的差異，它們對不同物質的親和性和轉運能力有所不同。豬皮滲透性特征與人類皮膚接近，尤其對親脂性物質的屏障作用更優。大鼠皮對親水性藥物滲透性較高，使得離體鼠皮對某些化妝品成分的吸收和擴散更為高效，進而高估人類皮膚的吸收率[14，15]。

除此之外，蛋白酶活性的差異影響了重組膠原穩定性與滲透，豬皮因天然膠原切割位點豐富，易競爭性抑制重組膠原降解穩定性；而大鼠高酯酶活性加速載體分解，降低滲透效率。酶分布上，大鼠酯酶集中于表皮易致淺層降解，豬蛋白酶則在真皮層起作用[16，17]；分子層面，豬皮高密度GFOGER位點競爭整合素結合，HSP47結合位點N端聚集可能削弱重組膠原局部滯留，共同影響其靶向與降解過程[18，19]。

選用離體豬皮和離體鼠皮代替人體皮膚進行研究，具有重要意義。一方面，人體皮膚獲取難度大且涉及倫理問題，而離體豬皮和離體鼠皮來源相對廣泛[8]。另一方面，離體豬皮在組織結構上與人體皮膚高度相似，能較好模擬人體皮膚對化妝品的反應；離體鼠皮成本低、易獲取，便于進行大規模的初步篩選實驗[8]。綜上所述，并結合本研究結果，可以明確在評價化妝品的透皮吸收性能進行離體皮膚測試時更適宜選擇離體豬皮而非離體鼠皮。

Part3

結論

本研究借助重組人源Ⅲ型膠原蛋白在不同離體皮膚的透皮吸收實驗，成功揭示了不同離體皮膚滲透性的差異。實驗運用Franz擴散池和雙光子熒光成像技術，獲取了較為可靠的數據。最終結果表明，離體鼠皮的皮膚滲透性顯著高于離體豬皮。這一結論不僅豐富了皮膚滲透領域的理論知識，還為藥物研發、皮膚護理、產品的優化提供了重要參考，有助于開發更具針對性、效果更優的相關產品。通過對這兩種常用離體皮膚模型的深入研究，能夠為化妝品的研發、質量控制和安全性評估提供更為可靠的依據，有利于推動化妝品行業的科學發展。