鼠李糖乳桿菌胞外蛋白的化妝品功效研究

近年來，微生物發酵技術在化妝品原料開發中的應用受到學界及產業界的廣泛關注。以雅詩蘭黛“小棕瓶”精華、蘭蔻“小黑瓶”面部精華液和SK-II“神仙水”為代表的產品，充分驗證了該技術在化妝品產業化中的重要價值。隨著化妝品行業轉型升級，消費者需求已從單一功效轉向對“天然、綠色、溫和”特性的綜合追求[1]。作為生物制造技術的重要分支，微生物發酵技術不僅能滿足化妝品功效原料的開發需求，還能通過生物轉化來富集活性成分、賦予產物新功能特性[2]，并有效降低天然提取物的毒性[3]。

鼠李糖乳桿菌（Lactobacillusrhamnosus），是一種革蘭氏陽性益生菌，屬乳桿菌屬，鼠李糖亞種，常存在于人和動物的腸道內，具有厭氧、耐酸且不產芽孢的特性[4]。其顯著的耐酸、耐膽汁鹽及耐多種抗生素的生物學特性，使其能夠在胃酸和膽汁的嚴苛環境中存活，并以活菌形式到達腸道，發揮益生菌功能[5，6]。鼠李糖乳桿菌可用于發酵生產乳制品、嬰幼兒食品、果汁等食品，還可用于藥品制備，起到調節腸道菌群、預防和治療腹瀉[7]、促進腸道健康和免疫力提升等功效[8]。作為一種不利用乳糖的乳酸菌，鼠李糖乳桿菌能夠發酵產生單糖、蛋白質等多種活性物質[9，10]，具有優異的抗氧化、抗炎活性，為其作為化妝品功效原料開發提供了可能。

為探究鼠李糖乳桿菌的研究現狀及其在化妝品領域的應用潛力，本研究采用文獻調研法，檢索了中國知網和WebofScience數據庫近五年以鼠李糖乳桿菌為主題的相關文獻，并利用VOSviewer軟件進行關鍵詞聚類分析。調研結果顯示，當前研究熱點主要集中于鼠李糖乳桿菌的抗氧化、抗炎、抑菌及益生菌特性，以及以胞外多糖為代表的活性物質，而對胞外蛋白的研究較為匱乏。為驗證鼠李糖乳桿菌胞外蛋白是否具有與胞外多糖相似的抗氧化和抗炎活性，本研究通過微生物發酵法制備鼠李糖乳桿菌發酵液，并采用硫酸銨鹽析法提取50%和75%兩個鹽濃度梯度下的胞外蛋白（ECP-Ⅰ和ECP-Ⅱ）。通過相關實驗評價了ECP-Ⅰ和ECP-Ⅱ的抗氧化性、抗炎性、細胞毒性及安全性，以判斷其是否符合化妝品功效原料開發的要求，并探討其在化妝品領域的潛在應用價值。

Part1

材料與方法

1.1實驗材料

MRS培養基，鼠李糖乳桿菌，北京和益源生物技術有限公司；硫酸銨、PBS溶液、脂多糖（LPS）、CCK-8試劑盒，北京百瑞極生物科技有限公司；ABTS試劑盒、FRAP試劑盒、TNF-α試劑盒、IL-6試劑盒、IL-8試劑盒、IL-1β試劑盒，碧云天生物技術有限公司；DPPH，Sigma公司；硫酸亞鐵、水楊酸—乙醇、過氧化氫，國藥集團；人永生化角質形成細胞（HaCaT細胞），中國檢驗檢疫科學研究院；MEM培養基，美國Gibco公司。

1.2實驗儀器

高壓滅菌鍋，上海申安醫療器械；恒溫培養箱，寧波江南儀器廠；低速大容量離心機，無錫市瑞江分析儀器；ME-104E精密天平，梅特勒—托利多儀器；酶標儀，ThermoFisher科技公司；WJ-80A-Ⅱ型CO2恒溫培養箱，上海圣科儀器設備有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1鼠李糖乳桿菌胞外蛋白的制備

將鼠李糖乳桿菌菌粉以3%接種量接入MRS培養基，在43℃恒溫培養箱中培養24h后，在12000rpm、4℃下，離心15min，收集上清液，即得鼠李糖乳桿菌發酵液。向發酵液中加入硫酸銨（144g/L菌液），在磁力攪拌器上以200rpm、25℃攪拌均勻后，于4℃冰箱靜置1—2h。在12000rpm、4℃下，離心15min后，收集上清液和蛋白沉淀，用蒸餾水溶解沉淀，制得25%鹽濃度下的蛋白質溶液。因25%鹽濃度下蛋白沉淀量極少，故不予收集。向上述上清液中繼續加入硫酸銨（158g/L菌液、176g/L菌液），分別制備50%和75%鹽濃度的溶液，重復上述攪拌、靜置和離心步驟，收集蛋白沉淀并用蒸餾水溶解，分別得到50%和75%鹽濃度下的鼠李糖乳桿菌胞外蛋白溶液。

將上述胞外蛋白溶液分別通過0.22μm水相濾膜過濾，裝入500Da透析袋中，透析2d，每日換液3—4次。透析完成后，分別獲得50%鹽濃度下鹽析得到的鼠李糖乳桿菌胞外蛋白（記為ECP-Ⅰ）和75%鹽濃度下鹽析得到的鼠李糖乳桿菌胞外蛋白（記為ECP-Ⅱ）。

1.3.2ECP-Ⅰ和ECP-Ⅱ分子量的測定

采用凝膠滲透色譜法（GPC）測定ECP-Ⅰ和ECP-Ⅱ的分子量分布。

1.3.3總抗氧化能力測定

采用ABTS試劑盒法和FRAP試劑盒法分別測定ECP-Ⅰ和ECP-Ⅱ溶液的ABTS自由基清除率和FRAP鐵離子還原能力，詳細操作步驟參照試劑盒說明書進行。

1.3.4DPPH自由基清除實驗

準確稱取8mgDPPH，溶于100mL無水乙醇，配置成2×10-4mol/L的DPPH溶液，避光保存。將ECP-Ⅰ和ECP-Ⅱ用蒸餾水稀釋成0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125和0.015625mg/mL六個質量濃度梯度，取各濃度樣品液與DPPH溶液按1∶1體積比混勻，避光靜置30min后，于517nm測定吸光度（A1）；以等體積蒸餾水替代樣品溶液，與DPPH溶液按1∶1體積比混勻，避光靜置30min后，于517nm測定吸光度（A0）；取等體積的ECP-Ⅰ和ECP-Ⅱ樣品溶液，與蒸餾水按1∶1體積比混勻，避光靜置30min后，于517nm測定吸光度（A2）。按公式（1）計算DPPH自由基清除率：

1.3.5羥自由基（·OH）清除實驗

準確稱取0.223gFeSO4·7H2O溶于100mL蒸餾水，配置成8.0mmol/LFeSO4溶液；準確稱取0.02g水楊酸溶于50mL無水乙醇，配置成3.0mmol/L水楊酸溶液；取200μLH2O2，加入9.8mL蒸餾水，配置成0.02mol/LH2O2溶液。將ECP-Ⅰ和ECP-Ⅱ用蒸餾水稀釋，配置成2.0、1.0、0.5、0.25、0.125和0.0625mg/mL六個質量濃度梯度，備用。

取若干2mLEP管，依次加入0.15mL8.0mmol/LFeSO4溶液、0.5mL3.0mmol/L水楊酸溶液、0.5mL不同濃度ECP-Ⅰ或ECP-Ⅱ樣品溶液、0.225mL蒸餾水和0.125mL0.02mol/LH2O2溶液，混勻后于37℃恒溫箱中孵育1h。在4000rpm下離心10min，取上清液于510nm測定吸光度（A1）。以0.5mL蒸餾水替代樣品溶液，共加入0.725mL蒸餾水，其他溶液加入量與A1組一致，混勻后于37℃孵育1h，后續操作與A1組一致，得吸光度（A0）；以0.5mL不同質量濃度樣品溶液替代3.0mmol/L水楊酸溶液換為同體積，其他溶液加入量與A0組一致，混勻后于37℃孵育1h，后續操作與A1組一致，得吸光度（A2）。按公式（2）計算羥自由基清除率：

1.3.6細胞毒性實驗

將HaCaT細胞以1×104個/孔的密度接種于96孔培養板中，設置空白對照組，于37℃恒溫培養箱中孵育24h后，用150μLPBS溶液洗滌2—3次。用MEM培養基將ECP-Ⅰ和ECP-Ⅱ稀釋成1.0、0.5、0.25、0.125、0.0625mg/mL五個質量濃度梯度，分別加入96孔板中，記為樣品組。以等體積MEM培養基替代樣品溶液，記為細胞對照組，每組設三孔平行，于37℃恒溫培養箱中孵育24h后，用150μLPBS溶液洗滌2—3次，后續操作嚴格按照CCK-8試劑盒說明書操作。用酶標儀于450nm測定吸光值。按公式（3）計算細胞存活率：

1.3.7LPS誘導HaCaT細胞炎癥模型及細胞存活率測定

將HaCaT細胞以1×104個/孔的密度接種于96孔培養板中，設置空白對照組，于37℃恒溫培養箱中孵育24h后，用150μLPBS溶液洗滌2—3次。加入200μg/mLLPS，于37℃恒溫培養箱中孵育24h后，用150μLPBS溶液洗滌2—3次。用MEM培養基將ECP-Ⅰ和ECP-Ⅱ稀釋至2.0、1.0、0.5、0.25、0.125mg/mL五個質量濃度梯度，分別加入96孔板中，記為樣品組。以等體積MEM培養基替代樣品溶液，記為細胞對照組，每組設三孔平行，于37℃恒溫培養箱中孵育24h后，用150μLPBS溶液洗滌2—3次，后續操作嚴格按照CCK-8試劑盒說明書操作。用酶標儀于450nm測定吸光值。按公式（3）計算細胞存活率。

1.3.8炎癥因子含量測定

選取1.0mg/mLECP-Ⅰ和0.5mg/mLECP-Ⅱ樣品溶液作為實驗對象，采用IL-6、TNF-α、IL-8和IL-1β試劑盒，通過酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測樣品對LPS誘導HaCaT細胞中IL-6、TNF-α、IL-8和IL-1β四種炎癥因子含量的影響，實驗嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.3.9紅細胞溶血實驗

將兔血于離心機1500×g離心10min，棄上清，保留沉淀。將沉淀與PBS溶液按2∶5體積比混勻，再次以1500×g離心10min，棄上清，重復洗滌2—3次，完成洗血步驟。取最后一次離心沉淀，用PBS溶液按1∶49體積比稀釋，制備紅細胞懸液（RBC）。取0.5mLRBC溶液與4.5mL蒸餾水混勻，于541nm測定吸光度，吸光度在0.5±0.025范圍內即可用于后續實驗。將ECP-Ⅰ和ECP-Ⅱ用PBS溶液稀釋至2.0、1.0、0.5、0.25、0.125和0.0625mg/mL六個質量濃度梯度。取各濃度樣品溶液與RBC溶液按1∶3體積比混勻，于室溫搖床孵育60min后，以10000×g離心1min終止孵育，取上清液于560nm測定吸光度（A1）；以等體積PBS溶液替代樣品溶液，與RBC溶液按1∶3體積比混勻，按上述條件孵育和離心，作為陰性對照，于560nm測定吸光度（A0）。以等體積蒸餾水替代樣品溶液，與RBC溶液按1∶3體積比混勻，按上述條件孵育和離心，作為陽性對照，于560nm測定吸光度（A2），按公式（4）計算紅細胞溶血率：

1.4數據處理與分析

所有實驗均重復三次，數據統計及計算采用MicrosoftExcel2021處理，用GraphPadPrism10軟件進行作圖。使用單因素方差分析進行統計分析，用T檢驗驗證組間差異顯著性（nsPgt;0.05，#，*Plt;0.05，##，**Plt;0.01，###，***Plt;0.001）。當Plt;0.05時，差異具有統計學意義。

Part2

結果與討論

2.1ECP-Ⅰ和ECP-Ⅱ的分子量分布

ECP-Ⅰ和ECP-Ⅱ的分子量（Mw）及峰面積分布如表1和圖1所示。ECP-Ⅰ的平均分子量為9.4958×104Da，主峰（峰3）占比92.92%；ECP-Ⅱ的平均分子量為6.0361×104Da，主峰（峰5）占比92.77%。隨鹽濃度梯度增加，分子量減小，可能是由于高鹽濃度通過影響電荷間的相互作用改變蛋白質結構，從而表現為較小的分子量[11，12]。ECP-Ⅰ的多分散系數（Mw/Mn）為8.34，ECP-Ⅱ為5.17，表明ECP-Ⅰ的分子組成更復雜。

2.2體外抗氧化活性研究

ABTS自由基清除實驗[13]、FRAP還原能力實驗[14]、DPPH自由基清除實驗[15]是評估樣品總抗氧化能力的常用方法。·OH是氧化性最強的自由基之一，可對人體產生多種氧化損失[16，17]。通過上述實驗評估ECP-Ⅰ和ECP-Ⅱ的抗氧化活性。

如圖2a所示，在4.0mg/mL的測定濃度下，ECP-Ⅰ的ABTS自由基清除率和FRAP還原能力分別相當于0.37mmol/LTrolox、1.15mmol/LTrolox，而ECP-Ⅱ分別相當于0.05mmol/LTrolox、0.30mmol/LTrolox，初步表明ECP-Ⅰ的總抗氧化能力高于ECP-Ⅱ。經過顯著性分析發現，ECP-Ⅰ的ABTS自由基清除能力（Plt;0.05）和FRAP還原能力（Plt;0.01）顯著優于ECP-Ⅱ，顯示出更強的抗氧化活性。

如圖2b、c所示，隨著質量濃度的增加，ECP-Ⅰ和ECP-Ⅱ的DPPH自由基清除率和·OH清除率均呈現上升趨勢，且ECP-Ⅰ抗氧化能力優于ECP-Ⅱ。在低質量濃度下，ECP-Ⅰ和ECP-Ⅱ的DPPH自由基清除率和·OH清除率差異均較小；但隨著質量濃度升高，二者清除率差距均逐漸增大。當質量濃度為0.5mg/mL時，ECP-Ⅰ的DPPH自由基的清除率為90.94%，而ECP-Ⅱ為55.19%；當質量濃度為2.0mg/mL時，ECP-Ⅰ的·OH清除率為48.71%，而ECP-Ⅱ為21.17%。IC50值越低，表明抗氧化劑的自由基清除能力越強。統計分析表明，ECP-Ⅰ清除DPPH自由基和清除·OH的IC50分別為0.0425mg/mL和3.0625mg/mL，而ECP-Ⅱ分別為0.3760mg/mL和10.8390mg/mL。結合圖2和IC50可以看出，ECP-Ⅰ的IC50值低于ECP-Ⅱ，表明ECP-Ⅰ清除DPPH自由基（Plt;0.05）和清除·OH能力（Plt;0.05）顯著優于ECP-Ⅱ。綜上所述，ECP-Ⅰ抗氧化能力均高于ECP-Ⅱ，表現出更強的抗氧化活性。

2.3細胞毒性實驗

CCK-8法通過測定吸光值間接反映細胞代謝活性及存活率，是評估細胞毒性和增殖能力的常用方法[18]。如圖3所示，ECP-Ⅰ在各質量濃度下對HaCaT細胞幾乎無細胞毒性，且表現出一定的促增殖作用，在0.5mg/mL時細胞存活率達157.56%，促增殖效果最強。ECP-Ⅱ在質量濃度低于0.5mg/mL時無明顯細胞毒性，且具有促增殖作用，在0.125mg/mL時細胞存活率達116.92%，促增殖效果最佳。統計分析表明，在質量濃度≤0.25mg/mL時，ECP-Ⅰ和ECP-Ⅱ均無細胞毒性，且ECP-Ⅰ的促增殖能力顯著優于ECP-Ⅱ（Plt;0.05）。

2.4LPS誘導HaCaT細胞炎癥模型的存活率測定

LPS可通過與細胞表面Toll樣受體4（TLR4）結合，激活NF-κB等信號轉導通路[19]，誘導細胞釋放腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）等炎癥因子，從而引發炎癥反應[20]。為篩選后續抗炎實驗的安全濃度，本研究采用LPS刺激HaCaT細胞建立炎癥模型，并測定不同質量濃度下ECP-Ⅰ和ECP-Ⅱ的細胞存活率。如圖4所示，HaCaT細胞存活率隨樣品質量濃度升高呈先上升后下降的趨勢。ECP-Ⅰ在1.0mg/mL時存活率最高，達112.07%，其他濃度均低于100.00%；ECP-Ⅱ在0.5mg/mL時存活率最高，達110.62%，低于0.25mg/mL或高于1.0mg/mL時存活率低于100.00%。因此，選取1.0mg/mL的ECP-Ⅰ和0.5mg/mL的ECP-Ⅱ作為安全濃度，用于后續抗炎實驗。

2.5ECP-Ⅰ和ECP-Ⅱ對炎癥因子含量的影響

IL-6、TNF-α、IL-8和IL-1β是炎癥反應中的關鍵因子，當炎癥反應發生時，四種炎癥因子表達水平會迅速上升，導致皮膚紅腫、瘙癢和組織損傷[21，22，23]。IL-6是一種多功能細胞因子，通過促進角質形成細胞增殖和真皮成纖維細胞中膠原蛋白生成，改變皮膚結構，導致紅腫，在炎癥級聯反應調控中發揮核心作用[21]。TNF-α是炎癥反應中的關鍵介質，可誘導IL-6、IL-8及自身正反饋表達，形成炎癥因子風暴，導致皮膚紅腫和瘙癢[23]。IL-8是一種趨化因子，通過吸引中性粒細胞到炎癥部位，促進其遷移和激活，導致皮膚紅腫和組織損傷[23，24]。IL-1β是一種促炎因子，可誘導細胞凋亡及組織損傷，加重皮膚炎癥[25]。

如圖5所示，空白組的IL-6、TNF-α、IL-8和IL-1β含量分別為31.04、19.77、384.28和6.91pg/mL；模型組對四種炎性因子含量顯著上調，分別為67.99、55.77、527.05和11.18pg/mL。經ECP-Ⅰ處理后，四種炎癥因子含量分別降至34.17、29.57、400.47和8.24pg/mL；經ECP-Ⅱ處理后，含量分別降至40.21、34.28、440.66和9.56pg/mL。結果表明，ECP-Ⅰ和ECP-Ⅱ均可有效抑制IL-6、TNF-α、IL-8和IL-1β的分泌（Plt;0.05）。單因素方差分析顯示，兩種蛋白處理組與模型組間相比均具有顯著性差異（Plt;0.05），且ECP-Ⅰ在所有炎癥因子上的抑制效率均顯著高于ECP-Ⅱ（Plt;0.05），此差異可能與其蛋白組分濃度梯度及結構特性相關，推測ECP-Ⅰ含有更多抗炎活性位點[26]。結果表明，ECP-Ⅰ抑制細胞內炎癥因子釋放的作用更強，具有更高的抗炎活性。

2.6樣品的安全性評價

原料的安全性是化妝品產品安全的前提條件，通過實驗篩選出安全溫和的原料，能夠避免因原料刺激引發的皮膚問題，從而為產品功效提供可靠保障。紅細胞溶血試驗基于紅細胞在溶血條件下釋放血紅蛋白的特性，通過評估受試物誘導紅細胞膜破裂并釋放血紅蛋白的程度，用于檢測物質的潛在刺激性和安全性。

結果如圖6所示，ECP-Ⅰ和ECP-Ⅱ的紅細胞溶血率均隨質量濃度增加而升高，但均低于5%，未出現明顯溶血現象。當質量濃度為2.0mg/mL時，ECP-Ⅰ的紅細胞溶血率為4.68%，ECP-Ⅱ為4.58%，統計分析顯示，ECP-Ⅰ和ECP-Ⅱ的溶血率無顯著差異（Pgt;0.05）。實驗結果表明，在0.0625—2.0mg/mL時，ECP-Ⅰ和ECP-Ⅱ均具有低刺激性和高安全性。

Part3

結論

鼠李糖乳桿菌是一種革蘭氏陽性益生菌，其作為一種不利用乳糖的乳酸菌，能夠發酵產生單糖、蛋白質等多種活性物質，具有優異的抗氧化、抗炎活性。近年來，關于鼠李糖乳桿菌的研究較為豐富，但研究熱點主要集中于以胞外多糖為代表的活性物質，對胞外蛋白的研究較為匱乏。本文以鼠李糖乳桿菌胞外蛋白為研究對象，通過對比ECP-Ⅰ和ECP-Ⅱ的分子量特性、對不同自由基的清除能力、抗炎能力以及安全性等，顯示ECP-Ⅰ具有更復雜的分子特性以及更強的抗氧化和抗炎功效，為開發其為化妝品功效原料提供了初步的研究基礎。顯然，對于鼠李糖乳桿菌胞外蛋白的研究不應局限于此，未來還需要做更多的深入研究，例如ECP-Ⅰ的理化性質、功效機理、人體功效等。更進一步的是，本文只對鼠李糖乳桿菌胞外蛋白進行研究，未來還可以對鼠李糖乳桿菌的胞內產物等進行研究，為鼠李糖乳桿菌在化妝品功效原料領域的開發提供更多的研究基礎。