液體活檢技術(shù)推動乳腺癌精準(zhǔn)診療

【摘要】乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年攀升。乳腺癌內(nèi)部復(fù)雜的異質(zhì)性對個體化診斷、治療和監(jiān)測提出了更高的要求。近些年，在疾病診斷中，有創(chuàng)侵入性操作逐漸被無創(chuàng)性操作所取代，其中液體活檢的問世及發(fā)展推動了臨床腫瘤學(xué)領(lǐng)域的精準(zhǔn)診療進(jìn)程。液體活檢通過血液或其他體液樣本來檢測腫瘤標(biāo)志物，包括但不限于通過循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）、循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）和細(xì)胞外囊泡（EV）等體液樣本。液體活檢因其取樣的便捷性、監(jiān)測的連續(xù)性以及對個體診療的精確性而逐漸被廣泛應(yīng)用于臨床。文章就近幾年液體活檢在乳腺癌中的進(jìn)展進(jìn)行介紹，并探討液體活檢相比于傳統(tǒng)組織活檢的優(yōu)劣性。

【關(guān)鍵詞】液體活檢；乳腺癌；循環(huán)腫瘤細(xì)胞；循環(huán)腫瘤DNA；細(xì)胞外囊泡

截至2024年，乳腺癌已成為全球發(fā)病率排名第二的癌癥（11.6%），僅次于肺癌（12.4%），作為女性發(fā)病率最高的癌癥，乳腺癌的早期診斷與治療顯得尤為重要［1］。乳腺癌是一種復(fù)雜的異質(zhì)性疾病，受遺傳、分子、細(xì)胞、組織特異性、環(huán)境、種族和社會經(jīng)濟(jì)因素的調(diào)節(jié)。傳統(tǒng)的診斷方法包括影像學(xué)及病理學(xué)診斷，盡管病理學(xué)檢查在臨床中被視為“金標(biāo)準(zhǔn)”，但仍不能評估腫瘤分子異質(zhì)性，無法揭示腫瘤克隆多樣性及其動態(tài)演變規(guī)律，亦無法提供精準(zhǔn)治療策略［2］。乳腺癌的常規(guī)治療手段包括外科切除、放射治療、化學(xué)治療、內(nèi)分泌治療、靶向治療及免疫治療［3］。盡管乳腺癌診斷與治療的基本原則已經(jīng)達(dá)成了共識，但隨著精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展，個體化治療顯得尤為重要，在這種背景下，基于患者體液而非癌灶組織的液體活檢為患者帶來了福音。液體活檢在過去幾年中迅速發(fā)展，相較以往的技術(shù)手段揭示了更多關(guān)于腫瘤特征的細(xì)節(jié)，如腫瘤進(jìn)展、腫瘤分期、異質(zhì)性、基因突變和克隆進(jìn)化等。本文旨在總結(jié)液體活檢在乳腺癌中的應(yīng)用進(jìn)展及對比傳統(tǒng)組織活檢的優(yōu)劣。

1液體活檢的定義

液體活檢在21世紀(jì)初逐漸進(jìn)入大眾視野，是指從各種生物液體（通常是血液）中分析腫瘤特異性生物學(xué)標(biāo)記物（循環(huán)腫瘤細(xì)胞、循環(huán)腫瘤DNA等）進(jìn)而獲取腫瘤信息的一項新技術(shù)，不同于傳統(tǒng)組織活檢檢測腫瘤組織中蛋白質(zhì)的免疫組織化學(xué)及細(xì)胞形態(tài)學(xué)［4-5］。腫瘤患者的血液中含有多種腫瘤細(xì)胞釋放的生物物質(zhì)，包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulatingtumorcell，CTC）、循環(huán)腫瘤DNA（circulatingtumorDNA，ctDNA）、腫瘤來源的細(xì)胞外囊泡（extracellularvesicle，EV）、血小板及外泌體等［6］，這些由腫瘤釋放并沉積到血液中的物質(zhì)是特異性的，可以準(zhǔn)確區(qū)分正常人與腫瘤患者。液體活檢最先被用于發(fā)病率最高的肺癌，幫助醫(yī)師早期發(fā)現(xiàn)肺癌，且在腫瘤篩查和病情監(jiān)測方面發(fā)揮著重要作用［7-8］。液體活檢因其無創(chuàng)性及監(jiān)測連續(xù)性被廣泛應(yīng)用于臨床，加速了精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展［9］。

2液體活檢的檢測靶點

液體活檢的主要靶點有CTC、ctDNA與EV，不同靶點具有不同的特點（表1）。

2.1循環(huán)腫瘤細(xì)胞

CTC是指從原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移灶脫落，進(jìn)入外周血液循環(huán)系統(tǒng)的完整腫瘤細(xì)胞［10］，通常在循環(huán)中只持續(xù)存在1～2.5h，然后被免疫系統(tǒng)破壞，但仍有一小部分可以存活并播種于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移部位［11］。乳腺癌可以通過血液傳播轉(zhuǎn)移，癌細(xì)胞會隨循環(huán)系統(tǒng)播散到全身［12］。CTC最初在患者外周血中發(fā)現(xiàn)，此后，學(xué)者們在異質(zhì)血細(xì)胞群中提取CTC方面取得了巨大進(jìn)展［13］。CTC的數(shù)量非常少，在每100萬個白細(xì)胞中大約僅有1個［14］，其形態(tài)多變，隨腫瘤分期而變化［15］，可黏附在成纖維細(xì)胞、血小板等細(xì)胞上形成聚集體。相比于未黏附的CTC，黏附的CTC在體內(nèi)可擴(kuò)散到更遠(yuǎn)的地方，后續(xù)研究證實其原因是這樣的聚集體可以阻止氧化應(yīng)激和周圍的免疫系統(tǒng)對CTC的破壞［16-17］。現(xiàn)有的研究顯示，在肺癌、胃癌、結(jié)直腸癌等多種實體腫瘤患者的血液中均可檢測到CTC［18-20］。超過一半的乳腺癌患者體內(nèi)能檢測到CTC，這為監(jiān)測乳腺癌提供了極大便利［21］。隨著液體活檢技術(shù)的不斷發(fā)展，對CTC的檢測從單純的細(xì)胞計數(shù)發(fā)展到單細(xì)胞測序，可以通過研究CTC的基因組和轉(zhuǎn)錄組進(jìn)一步了解乳腺癌的發(fā)生發(fā)展［22］。免疫磁珠陽性富集法的代表性技術(shù)CellSearch系統(tǒng)是目前唯一獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局（FoodandDrugAdministration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)用于臨床的CTC檢測技術(shù)［23］。Bidard等［24］應(yīng)用該技術(shù)對1944例轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其中911例患者治療前CTC數(shù)量≥5個/7.5mL，與CTC數(shù)量lt;5個/7.5mL的患者相比，這部分高CTC計數(shù)患者的總生存期（overallsurvival，OS）和無進(jìn)展生存期（progression-freesurvival，PFS）均明顯縮短。

2.2循環(huán)腫瘤DNA

細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死時會將DNA釋放進(jìn)入血液，稱為游離DNA（cellfreeDNA，cfDNA），血液中的DNA酶可以快速降解cfDNA，因此cfDNA的半衰期很短，約為1～2h［25］。cfDNA通常是長度為160～180個堿基對的短片段［26］。研究表明癌癥患者的cfDNA水平遠(yuǎn)高于正常人，所以cfDNA最初被用于評估癌癥患者的總體腫瘤負(fù)擔(dān)，但最終因總cfDNA水平對于跟蹤患者的總體腫瘤負(fù)荷和對治療的反應(yīng)不夠敏感及特異性低等缺點而無法被廣泛應(yīng)用［27］。對于腫瘤細(xì)胞而言，其釋放到循環(huán)中的DNA被稱為ctDNA，屬于cfDNA的一種［28］。目前對于ctDNA的研究限于堿基對長度以及形態(tài)學(xué)修飾，其中雜合性缺失（lackofheterozygosity，LOH）、DNA甲基化、DNA完整性是當(dāng)前研究熱點［29-30］。對ctDNA定性、定量與追蹤可提供腫瘤遺傳變異信息，在全程管理腫瘤患者中的應(yīng)用價值已在多個臨床診療指南中被描述［31-32］。目前ctDNA檢測技術(shù)可以概括為2種：①基于PCR的檢測技術(shù)，主要包括擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)PCR（amplificationrefractorymutationsystemPCR，ARMS-PCR）、微滴式數(shù)字PCR（dropletdigitalPCR，ddPCR）和基于小珠（Bead）、乳濁液（Emulsion）、擴(kuò)增（Amplification）、磁性（Magnetic）的BEAMing技術(shù)；②基于高通量測序的檢測技術(shù)，包括靶向測序、全外顯子測序和全基因組測序等。Nik-Zainal等［33］通過對560例乳腺癌患者進(jìn)行全基因組測序分析，鑒定出93個與乳腺癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的蛋白編碼癌基因，這些基因共包含1628個潛在的驅(qū)動突變位點。在乳腺癌檢測中，ctDNA憑借高靈敏度、全面基因組覆蓋、無創(chuàng)動態(tài)監(jiān)測和成熟的臨床轉(zhuǎn)化，已成為液體活檢動態(tài)監(jiān)測的首選技術(shù)，尤其適用于早期復(fù)發(fā)預(yù)警、耐藥機(jī)制解析和精準(zhǔn)治療指導(dǎo)［34］。

2.3細(xì)胞外囊泡

EV是由細(xì)胞分泌的一種異質(zhì)性結(jié)構(gòu)膜群，會穿越細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境，存在于血漿、尿液、腦脊液、唾液等多種體液中［35-36］。EV由雙層脂質(zhì)所包裹，直徑約30～2000nm［35］，內(nèi)含各種生物信息分子，例如蛋白質(zhì)和核酸等，EV形態(tài)和大小是目前判斷分泌細(xì)胞狀態(tài)和功能的標(biāo)準(zhǔn)［37］。根據(jù)大小EV被分為外泌體（exosomes）、微囊泡（microvesicles）和凋亡體（apoptoticbodies）。外泌體是一種較小的囊泡，直徑約50～150nm，形成于內(nèi)泛素中，內(nèi)泛素是一種細(xì)胞器，負(fù)責(zé)內(nèi)吞和分解細(xì)胞內(nèi)部的物質(zhì)［38-39］；微囊泡是一種較大的囊泡，直徑約50～500nm，是通過細(xì)胞膜的脫落形成的，可以通過細(xì)胞膜上的突起成熟而分離出來［40］；凋亡體是在細(xì)胞凋亡過程中形成的較大囊泡，直徑大于1000nm，當(dāng)細(xì)胞凋亡時會釋放凋亡體進(jìn)入循環(huán)［41］。EV被細(xì)胞分泌后可隨血液抵達(dá)身體的不同部位，且因其雙層脂質(zhì)結(jié)構(gòu)而穩(wěn)定存在于血液中，因此對于乳腺癌的早期監(jiān)測和診斷均具有重要意義。

EV是極具潛力的“分子信使”，攜帶乳腺癌特異性核酸、蛋白和脂質(zhì)，可無創(chuàng)反映腫瘤異質(zhì)性和微環(huán)境交互，其優(yōu)勢在于高穩(wěn)定性與豐富信息量，但面臨分離技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化和信號解析復(fù)雜性的挑戰(zhàn)，是未來早期篩查和動態(tài)監(jiān)測的重要突破口［40-41］。

3液體活檢在乳腺癌中的臨床應(yīng)用現(xiàn)狀

液體活檢已被應(yīng)用于乳腺癌的早期診斷、復(fù)發(fā)監(jiān)測及預(yù)后評估，同時對治療用藥也有指導(dǎo)作用［42］。

3.1早期診斷

目前，早期乳腺癌被認(rèn)為是可以治愈的［43］，但由于乳腺癌早期癥狀不典型，大部分患者進(jìn)展到晚期才被確診，不僅失去了完全治愈的機(jī)會，治療方式的選擇也受限。大量證據(jù)表明液體活檢有助于早期診斷乳腺癌，例如ctDNA在乳腺癌臨床癥狀未出現(xiàn)前即可在外周血液中被檢測到［44］，外周血ctDNA/cfDNA水平的變化可提示癌癥初發(fā)，目前的檢測方法能夠檢測到低至1/100000或1/100000拷貝的突變等位基因頻率［45］。還有研究表明，乳腺癌患者血漿中檢測到的ctDNA可用于無創(chuàng)腫瘤基因檢測和量化腫瘤負(fù)擔(dān)，能進(jìn)一步反映腫瘤異質(zhì)性和轉(zhuǎn)移特異性，在癌癥早期即可明確診斷［46］。此外，EV也憑借其高靈敏度及特異度，為乳腺癌的早期診斷提供了新路徑。

3.2復(fù)發(fā)監(jiān)測及預(yù)后評估

盡管當(dāng)前乳腺癌的治療取得了巨大進(jìn)展，但其仍然是一種危及生命的疾病，乳腺癌治療在早期階段效果較佳，但大一部分患者仍會經(jīng)歷疾病復(fù)發(fā)［47］。研究顯示，ctDNA水平的降低與更長的OS）［48］。在卵巢癌［49］、肺癌［50］和結(jié)直腸癌［51］等幾種癌癥中，ctDNA對疾病進(jìn)展、治療反應(yīng)、預(yù)后的意義已被揭示，ctDNA與相對較差的臨床結(jié)局和腫瘤復(fù)發(fā)相關(guān)。除了評估預(yù)后之外，檢測乳腺癌患者的ctDNA譜還可以監(jiān)測治療后殘留病灶與復(fù)發(fā)風(fēng)險，從而有助于修改治療方案并避免過度治療［52］。

3.3輔助治療

液體活檢對乳腺腫瘤的治療也有重要輔助作用。ctDNA有助于識別乳腺癌的特定突變進(jìn)而輔助治療，Cohen等［53］使用CancerSEEK（一種用于識別包括乳腺癌在內(nèi)的8種癌癥的泛癌血液檢測方法）來評估16種ctDNA基因的突變，研究結(jié)果顯示，檢測乳腺癌的靈敏度為33%，特異度為99%［53］。Beaver等［54］評估了乳腺癌患者血漿中的PIK3CA突變情況，PIK3CA是一種高頻率突變的致癌基因，30%的乳腺癌體內(nèi)存在PIK3CA，PIK3CA檢測早期乳腺癌的靈敏度為93.3%，特異度為100%［54］。因此Beaver等認(rèn)為通過檢測ctDNA能開發(fā)出更具特異性的乳腺癌治療藥物，協(xié)助臨床醫(yī)師在腫瘤進(jìn)展過程中進(jìn)行個體化治療。

3.4在乳腺癌不同亞型中的應(yīng)用

3.4.1Luminal型乳腺癌

不同分子分型乳腺癌的生物學(xué)行為和治療策略差異顯著，液體活檢的應(yīng)用也各有側(cè)重［55］。Luminal型乳腺癌對內(nèi)分泌治療（如他莫昔芬、CDK4/6抑制劑等）的耐藥機(jī)制復(fù)雜（如ESR1突變、PIK3CA突變相關(guān)機(jī)制），通過ctDNA檢測ESR1突變（如Y537S、D538G）可早期發(fā)現(xiàn)耐藥，進(jìn)一步動態(tài)調(diào)整CDK4/6抑制劑聯(lián)合方案，CTC則更適合評估腫瘤細(xì)胞活性、表型轉(zhuǎn)換和轉(zhuǎn)移潛能，聯(lián)合應(yīng)用ctDNA和CTC可全面捕捉腫瘤異質(zhì)性和動態(tài)演變過程，為內(nèi)分泌治療的精準(zhǔn)管理提供雙重保障［56］。

3.4.2人類表皮生長因子受體2陽性型乳腺癌

在人類表皮生長因子受體2（humanepidermalgrowthfactorreceptor2，HER2）陽性型乳腺癌中，ctDNA有助于預(yù)測抗HER2（如曲妥珠單抗、T-DXd）的治療響應(yīng)［57］，且ctDNA檢測中的HER2信號消失與病理完全緩解（pathologicalcompleteresponse，PCR）相關(guān)［58］。CTC可被CellSearch或微流控技術(shù)分離，從而直接檢測HER2蛋白表達(dá)（如IHC3+或FISH+），克服腫瘤異質(zhì)性帶來的影響［59］。換句話說，在HER2陽性型乳腺癌中，ctDNA是基因水平動態(tài)監(jiān)測的金標(biāo)準(zhǔn)，尤其適合靶向治療耐藥突變檢測和早期復(fù)發(fā)預(yù)警；而CTC則提供細(xì)胞表型與功能信息，直接驗證HER2靶點表達(dá)并解析異質(zhì)性。ctDNA與CTC兩者相輔相成，從分子到細(xì)胞層面實現(xiàn)“雙保險”監(jiān)測。

3.4.3三陰性乳腺癌

三陰性乳腺癌是惡性程度最高的乳腺癌，通過檢測ctDNA中腫瘤突變負(fù)荷（tumormutationalburden，TMB）或特定突變（如BRCA1/2）可預(yù)測PD-1抑制劑對三陰性乳腺癌的療效，CTC則可反映存活細(xì)胞中PD-L1上調(diào)等細(xì)胞表型的變化，兩者均有助于精準(zhǔn)治療與耐藥判斷［60］。

綜上，在不同分子分型乳腺癌中，CTC與ctDNA的動態(tài)變化對精準(zhǔn)診療具有不同的指導(dǎo)意義，在臨床中可以根據(jù)分子分型選擇合適的液體活檢檢測靶點。

4液體活檢與傳統(tǒng)組織活檢的比較

傳統(tǒng)的組織活檢是通過穿刺、內(nèi)鏡或手術(shù)切除獲取病變組織進(jìn)行病理檢查的“金標(biāo)準(zhǔn)”方法［2］。其主要技術(shù)包括細(xì)針穿刺（fine-needleaspiration，F(xiàn)NA）、空心針活檢（coreneedlebiopsy，CNB）和手術(shù)切除活檢，通過HE染色、免疫組織化學(xué)（如HER2、PD-L1）和分子檢測（如EGFR、KRAS）明確診斷，其優(yōu)勢在于可以直接觀察組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)，但具有侵入性且可能遺漏腫瘤異質(zhì)性等缺點［61］。與傳統(tǒng)組織活檢相比，液體活檢具有創(chuàng)傷小、費(fèi)時短、保存條件要求不高等優(yōu)點，同時又可以持續(xù)并實時監(jiān)測患者對治療藥物的不良反應(yīng)，重要的是有助于揭示腫瘤的時空異質(zhì)性，這些都是傳統(tǒng)組織活檢無法實現(xiàn)的［62-63］。但液體活檢相比于組織活檢來說，其檢測的靈敏度不夠高，且無法在組織學(xué)層面上進(jìn)行評估，因此目前只能作為傳統(tǒng)組織活檢的輔助技術(shù)［64］。在臨床實踐中，應(yīng)將傳統(tǒng)組織活檢與液體活檢聯(lián)合應(yīng)用，才能發(fā)揮各自的長處。

5液體活檢的局限性

液體活檢需要從體液中獲取樣本，不僅個體間存在差異，與體液中的其他成分相比，CTC、ctDNA、ctRNA的含量相對較少，且會受微環(huán)境的影響，分離血漿所需的技術(shù)較高，此外，由于來源多樣性、亞群復(fù)雜性以及易與非囊泡結(jié)構(gòu)結(jié)合而缺乏有效的富集技術(shù)和分析方法，使得液體活檢面臨多種挑戰(zhàn)［65-66］。一般情況下，對富集的CTC進(jìn)行分析，可以在蛋白質(zhì)或mRNA水平上鑒定出特定的腫瘤相關(guān)生物學(xué)標(biāo)志物，但一些特殊腫瘤可能會影響檢測結(jié)果。例如在上皮性腫瘤患者中，上皮性生物學(xué)標(biāo)志物會在上皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialtomesenchymaltransition，EMT）的過程中下調(diào)，這可能會導(dǎo)致假陰性結(jié)果［67］。此外，進(jìn)行液體活檢時還需要進(jìn)行初步組織學(xué)檢查，以避免對診斷結(jié)果的過分解讀。毫無疑問，液體活檢是一種高效的非侵入性診斷方法，可以提供全面的腫瘤分子譜和治療腫瘤靶點的實時信息，但是需要開發(fā)新的技術(shù)和標(biāo)準(zhǔn)化的方法來克服阻礙液體活檢在轉(zhuǎn)化和臨床實踐中的限制。

6結(jié)語與展望

近年來，隨著分子技術(shù)的進(jìn)步，體液的檢測和分析已成為許多研究的主題，不僅為輔助診斷提供了幫助，還有助于乳腺腫瘤的個體化治療。液體活檢作為一種早期診斷技術(shù)被應(yīng)用到臨床中，盡管仍存在許多需克服的挑戰(zhàn)，但其已為乳腺癌的精確診療提供了更多可能。液體活檢中的微流控技術(shù)對EV的分離具有革命性作用，通過微型化、自動化和高精度操控，顯著提升了EV的分離效率、純度和下游分析可靠性［68］。單細(xì)胞測序技術(shù)的出現(xiàn)則解決了腫瘤異質(zhì)性問題，提高稀有靶標(biāo)檢測的靈敏度，還可克服樣本量限制的問題［69］。

液體活檢作為一種無創(chuàng)診斷技術(shù)，在乳腺癌精準(zhǔn)診療中的未來發(fā)展前景廣闊。首先，在技術(shù)層面，多組學(xué)聯(lián)合檢測將大幅提高早期腫瘤的檢出率，甲基化、片段組學(xué)等新標(biāo)志物的應(yīng)用有望實現(xiàn)超早期預(yù)警［70］。其次，液體活檢的臨床應(yīng)用將從輔助診斷向全程管理擴(kuò)展，動態(tài)監(jiān)測腫瘤演變、預(yù)測治療反應(yīng)和耐藥突變，為精準(zhǔn)診療提供實時依據(jù)［71］。此外，隨著檢測成本下降和標(biāo)準(zhǔn)化流程建立，液體活檢有望成為常規(guī)體檢項目，實現(xiàn)腫瘤的早篩早診［72］。盡管仍面臨靈敏度提升和生物學(xué)標(biāo)志物待優(yōu)化等挑戰(zhàn)，但液體活檢技術(shù)的持續(xù)突破將為乳腺癌的防治帶來新希望，推動腫瘤診療進(jìn)入無創(chuàng)、動態(tài)、精準(zhǔn)的新時代，在為患者提供個體化治療和評估預(yù)后中都有重要意義。

利益沖突聲明：本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助，不存在潛在利益沖突。

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（責(zé)任編輯：洪悅民）