基于深度學(xué)習(xí)“DNA的片段擴(kuò)增及電泳鑒定”實(shí)驗(yàn)研究

中圖分類號：G632 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

《普通高中生物學(xué)課程標(biāo)準(zhǔn)（2017年版2020年修訂）》在教學(xué)與評價(jià)中建議：加強(qiáng)和完善生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)，應(yīng)鼓勵(lì)學(xué)生參與設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，讓學(xué)生在實(shí)驗(yàn)活動(dòng)中了解事物的本質(zhì).書中還指出，為幫助學(xué)生理解選擇性必修課程概念5的內(nèi)容，促進(jìn)學(xué)生生物學(xué)學(xué)科核心素養(yǎng)的提升，應(yīng)開展下列教學(xué)活動(dòng)：利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增DNA片段并完成電泳鑒定，或運(yùn)用軟件進(jìn)行虛擬PCR實(shí)驗(yàn).PCR和電泳兩個(gè)技術(shù)是生物科研中基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，應(yīng)用廣泛，

1深度學(xué)習(xí)的內(nèi)涵

深度學(xué)習(xí)是指在教師引領(lǐng)下，學(xué)生圍繞具有挑戰(zhàn)性的學(xué)習(xí)主題，全身心積極參與，體驗(yàn)成功、獲得發(fā)展的有意義的學(xué)習(xí)過程.深度學(xué)習(xí)，不是把知識平移、傳輸給學(xué)生，而是在“活動(dòng)與體驗(yàn)”中進(jìn)行的1.只有深度學(xué)習(xí)PCR和電泳，才能深刻理解科研文獻(xiàn)以及高三生物習(xí)題中的電泳圖和PCR相關(guān)內(nèi)容.

2 實(shí)驗(yàn)操作過程

2.1 前期準(zhǔn)備工作

參與本實(shí)驗(yàn)的是選修生物信息技術(shù)課的20名學(xué)生，實(shí)驗(yàn)前將學(xué)生分為4個(gè)學(xué)習(xí)小組.各小組自主討論確定擴(kuò)增的基因，自主設(shè)計(jì)引物，自主學(xué)習(xí)高壓蒸汽滅菌鍋、PCR儀、電泳儀等設(shè)備的操作，再進(jìn)行基因片段的擴(kuò)增及電泳鑒定.各組根據(jù)文獻(xiàn)以及教師的建議，最后選用自己的口腔上皮細(xì)胞，快速且簡便地提取DNA進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn).4組學(xué)生通過利用NCBI網(wǎng)站下的PickPrimers小工具，在線設(shè)計(jì)引物，見表1.除了SRY基因沒有內(nèi)含子，擴(kuò)增的是全長基因；其余3個(gè)基因比較大，只是擴(kuò)增基因的部分片段。

表1各小組擬擴(kuò)增的基因和設(shè)計(jì)的相應(yīng)引物

表1 （續(xù)表）

2.2 提取口腔上皮細(xì)胞DNA

參照徐小金《“DNA的簡易提取及片段的擴(kuò)增\"實(shí)驗(yàn)教學(xué)設(shè)計(jì)》中的方法提取口腔上皮細(xì)胞的DNA[2].（1）漱口，用咽拭子在口腔黏膜上刮10次，將咽拭子放在含有 500μL 生理鹽水的離心管中多次攪動(dòng)，使口腔上皮細(xì)胞盡可能多地落入生理鹽水中.（2） 12 000rpm 離心 3min ，棄上清，瀝干.（3）加入 5×TBE 溶液 50μL 混勻后 60^°C 水浴，處理 30min 后，取出備用

2.3 進(jìn)行PCR

為減少試劑的浪費(fèi)，減少學(xué)生的加樣次數(shù)，本實(shí)驗(yàn)中對教材中的PCR反應(yīng)體系進(jìn)行整合，見表2.

表2PCR反應(yīng)體系

擴(kuò)增INS、EGFR、ACTB基因片段的PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?98°C 預(yù)變性， 5min;95°C 變性， ：55^°C 復(fù)性， 30sec ： 72^°C 延伸， ;最后延伸72°C，5min ；循環(huán)次數(shù)設(shè)定為30.擴(kuò)增SRY基因的延伸時(shí)間改為50秒，其余參數(shù)不變.

2.4 瓊脂糖凝膠電泳與成像

稱取 1g 瓊脂糖，加到 50mL 的 1×TAE 緩沖液中，加熱至充分溶解，冷卻至 60^°C 左右后，加入核酸熒光染料，混勻后制膠.凝固后輕拔梳子，取出凝膠置于盛有 1×TAE 電泳緩沖液的電泳槽內(nèi)，（提示學(xué)生上樣孔靠近哪一極），并使電泳緩沖液沒過凝膠 0.5mm 左右.取 PCR 擴(kuò)增后產(chǎn)物 10μL 與 2μL 的 6× Loading-Buffer上樣緩沖液吹打混勻，上樣.恒壓 8V/cm 條件下電泳 20min .電泳結(jié)束后，用凝膠成像儀拍照，觀察并分析電泳條帶，并在小組內(nèi)和小組間進(jìn)行交流討論

2.5 分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果

第一次擴(kuò)增的電泳結(jié)果如圖1所示，其中SRY基因片段和EGFR基因片段沒有擴(kuò)增成功，第2組擴(kuò)增的胰島素基因片段條帶不夠亮，第4組擴(kuò)增出來的條帶大小與預(yù)期不符，是非特異性條帶.

圖1第一次PCR的電泳結(jié)果

經(jīng)過組內(nèi)學(xué)生交流與老師的建議，調(diào)整PCR反應(yīng)程序，再次擴(kuò)增.其中第1、3組將復(fù)性溫度降低至53^°C ，第2組將復(fù)性溫度調(diào)整為 54^°C ，第4組將復(fù)性溫度提高至 57% .結(jié)果如圖2所示.

在第二次PCR中，第1、2、4小組擴(kuò)增出目的基因片段，只是條帶較弱.第3小組第二次PCR仍未擴(kuò)增到EGFR基因片段，所以和教師一起反思分析.我們利用Bioedit軟件將上游引物EGFRF和下游引物EGFRR序列分別與EGFR基因全長序列及其mRNA序列比對，結(jié)果如圖3、圖4所示，從中可看出未擴(kuò)增出EGFR基因片段的原因是：該小組所用引物是以mRNA序列進(jìn)行設(shè)計(jì)的（兩引物間大小正是 354bp ），而實(shí)際PCR的模板是人口腔上皮細(xì)胞的基因組DNA，兩引物間長度有 8572bp ，所以擴(kuò)增不出來。

第4小組也對第一次PCR出現(xiàn)非特異性條帶進(jìn)行序列比對的分析，比對結(jié)果如圖5所示.通過比對發(fā)現(xiàn)上游引物ACTBF設(shè)計(jì)在ACTB基因的內(nèi)含子位置.而內(nèi)含子保守性相對較低，第一次擴(kuò)增時(shí)，復(fù)性溫度可能偏低，上游引物結(jié)合到非模板位置，因此出現(xiàn)了非特異性條帶.而再次擴(kuò)增時(shí)，提高了復(fù)性溫度，上游引物結(jié)合到設(shè)計(jì)的模板鏈的位置，擴(kuò)增出了目的基因片段.

3 教學(xué)小結(jié)

3.1 成功經(jīng)驗(yàn)

本次實(shí)驗(yàn)由學(xué)生自主確定目的基因并設(shè)計(jì)引物，這能讓學(xué)生深度掌握PCR的核心內(nèi)容，而不是加一下試劑走過場而已.學(xué)生通過全流程參與各個(gè)環(huán)節(jié)，深度理解DNA熱變性、引物的本質(zhì)與方向、瓊脂糖凝膠的配制、核酸染料與指示劑的區(qū)別與作用、載樣緩沖液的作用與使用、DNA成像的原理和DNA在凝膠中遷移等微觀層面的知識等.本實(shí)驗(yàn)的深度學(xué)習(xí)，還可以讓學(xué)生感受PCR與成像的神奇之處.在平時(shí)關(guān)于PCR的習(xí)題中，也能更得心應(yīng)手.高考中關(guān)于PCR與電泳的習(xí)題，痛點(diǎn)大多集中于引物方面與電泳圖分析方面.所以學(xué)生通過體驗(yàn)引物的設(shè)計(jì)和電泳結(jié)果的分析，可深度掌握PCR的內(nèi)容.

為強(qiáng)化教學(xué)引導(dǎo)效果，在將凝膠放人電泳槽的過程中，教師可讓學(xué)生來操作.未接觸過瓊脂糖凝膠電泳的學(xué)生會(huì)不知所措，隨意放置凝膠.此時(shí)教師及時(shí)引導(dǎo)學(xué)生要注意電泳槽的“ + ”極和“-”極，并提問：在電泳液中DNA帶什么電？學(xué)生馬上恍然大悟：DNA帶負(fù)電，上樣孔應(yīng)朝向“-”極一側(cè)

通過PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳的實(shí)際操作，學(xué)生可以感受分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的嚴(yán)謹(jǐn)，規(guī)范掌握微量移液器、電泳等操作.多數(shù)小組成功擴(kuò)增出目的DNA片段，通過電泳與成像觀察到預(yù)期條帶，直觀理解實(shí)驗(yàn)應(yīng)用.對于一開始未達(dá)到的實(shí)驗(yàn)預(yù)期進(jìn)行分析并進(jìn)一步改進(jìn)，可以促進(jìn)學(xué)生科學(xué)思維、科學(xué)探究等核心素養(yǎng)的發(fā)展，培養(yǎng)學(xué)生質(zhì)疑的精神.分組學(xué)習(xí)模式也可以提高學(xué)生的配合與責(zé)任意識.雖然第3組最終沒有擴(kuò)增出目的基因片段，但通過分析找到了原因，這使他們對引物設(shè)計(jì)等的學(xué)習(xí)可能會(huì)更加深刻.

3.2 反思與不足

在操作層面上最大的問題是微量移液器的使用，教師應(yīng)在課前讓學(xué)生充分練習(xí)微量移液器.可以課前先模擬PCR反應(yīng)體系的添加，特別是1微升左右試劑的添加，再或者可以把引物進(jìn)行稀釋，這樣引物的添加就容易操作些.在上樣環(huán)節(jié)，也要提前模擬練習(xí)，以提高實(shí)驗(yàn)教學(xué)的效率.還有一點(diǎn)遺憾的是，為了確保結(jié)果分析的嚴(yán)謹(jǐn)性，應(yīng)將電泳條帶送去測序，以判斷擴(kuò)增的序列是否為目的片段，以確定第4組出現(xiàn)的非特異性條帶是否符合預(yù)期推測

參考文獻(xiàn)：

［1］郭華.深度學(xué)習(xí)及其意義［J].課程·教材·教法，2016（11） ：59.

［2］徐小金．“DNA的簡易提取及片段的擴(kuò)增”實(shí)驗(yàn)教學(xué)設(shè)計(jì)[J].生物學(xué)教學(xué)，2023，48（6）：56-57.

[責(zé)任編輯：孫美齊]