基于深度學習“DNA的片段擴增及電泳鑒定”實驗研究

中圖分類號：G632 文獻標識碼：A

《普通高中生物學課程標準（2017年版2020年修訂）》在教學與評價中建議：加強和完善生物學實驗教學，應鼓勵學生參與設計實驗，讓學生在實驗活動中了解事物的本質.書中還指出，為幫助學生理解選擇性必修課程概念5的內容，促進學生生物學學科核心素養的提升，應開展下列教學活動：利用聚合酶鏈式反應（PCR）擴增DNA片段并完成電泳鑒定，或運用軟件進行虛擬PCR實驗.PCR和電泳兩個技術是生物科研中基礎實驗技術，應用廣泛，

1深度學習的內涵

深度學習是指在教師引領下，學生圍繞具有挑戰性的學習主題，全身心積極參與，體驗成功、獲得發展的有意義的學習過程.深度學習，不是把知識平移、傳輸給學生，而是在“活動與體驗”中進行的1.只有深度學習PCR和電泳，才能深刻理解科研文獻以及高三生物習題中的電泳圖和PCR相關內容.

2 實驗操作過程

2.1 前期準備工作

參與本實驗的是選修生物信息技術課的20名學生，實驗前將學生分為4個學習小組.各小組自主討論確定擴增的基因，自主設計引物，自主學習高壓蒸汽滅菌鍋、PCR儀、電泳儀等設備的操作，再進行基因片段的擴增及電泳鑒定.各組根據文獻以及教師的建議，最后選用自己的口腔上皮細胞，快速且簡便地提取DNA進行PCR實驗.4組學生通過利用NCBI網站下的PickPrimers小工具，在線設計引物，見表1.除了SRY基因沒有內含子，擴增的是全長基因；其余3個基因比較大，只是擴增基因的部分片段。

表1各小組擬擴增的基因和設計的相應引物

表1 （續表）

2.2 提取口腔上皮細胞DNA

參照徐小金《“DNA的簡易提取及片段的擴增\"實驗教學設計》中的方法提取口腔上皮細胞的DNA[2].（1）漱口，用咽拭子在口腔黏膜上刮10次，將咽拭子放在含有 500μL 生理鹽水的離心管中多次攪動，使口腔上皮細胞盡可能多地落入生理鹽水中.（2） 12 000rpm 離心 3min ，棄上清，瀝干.（3）加入 5×TBE 溶液 50μL 混勻后 60^°C 水浴，處理 30min 后，取出備用

2.3 進行PCR

為減少試劑的浪費，減少學生的加樣次數，本實驗中對教材中的PCR反應體系進行整合，見表2.

表2PCR反應體系

擴增INS、EGFR、ACTB基因片段的PCR反應程序為： 98°C 預變性， 5min;95°C 變性， ：55^°C 復性， 30sec ： 72^°C 延伸， ;最后延伸72°C，5min ；循環次數設定為30.擴增SRY基因的延伸時間改為50秒，其余參數不變.

2.4 瓊脂糖凝膠電泳與成像

稱取 1g 瓊脂糖，加到 50mL 的 1×TAE 緩沖液中，加熱至充分溶解，冷卻至 60^°C 左右后，加入核酸熒光染料，混勻后制膠.凝固后輕拔梳子，取出凝膠置于盛有 1×TAE 電泳緩沖液的電泳槽內，（提示學生上樣孔靠近哪一極），并使電泳緩沖液沒過凝膠 0.5mm 左右.取 PCR 擴增后產物 10μL 與 2μL 的 6× Loading-Buffer上樣緩沖液吹打混勻，上樣.恒壓 8V/cm 條件下電泳 20min .電泳結束后，用凝膠成像儀拍照，觀察并分析電泳條帶，并在小組內和小組間進行交流討論

2.5 分析實驗結果

第一次擴增的電泳結果如圖1所示，其中SRY基因片段和EGFR基因片段沒有擴增成功，第2組擴增的胰島素基因片段條帶不夠亮，第4組擴增出來的條帶大小與預期不符，是非特異性條帶.

圖1第一次PCR的電泳結果

經過組內學生交流與老師的建議，調整PCR反應程序，再次擴增.其中第1、3組將復性溫度降低至53^°C ，第2組將復性溫度調整為 54^°C ，第4組將復性溫度提高至 57% .結果如圖2所示.

在第二次PCR中，第1、2、4小組擴增出目的基因片段，只是條帶較弱.第3小組第二次PCR仍未擴增到EGFR基因片段，所以和教師一起反思分析.我們利用Bioedit軟件將上游引物EGFRF和下游引物EGFRR序列分別與EGFR基因全長序列及其mRNA序列比對，結果如圖3、圖4所示，從中可看出未擴增出EGFR基因片段的原因是：該小組所用引物是以mRNA序列進行設計的（兩引物間大小正是 354bp ），而實際PCR的模板是人口腔上皮細胞的基因組DNA，兩引物間長度有 8572bp ，所以擴增不出來。

第4小組也對第一次PCR出現非特異性條帶進行序列比對的分析，比對結果如圖5所示.通過比對發現上游引物ACTBF設計在ACTB基因的內含子位置.而內含子保守性相對較低，第一次擴增時，復性溫度可能偏低，上游引物結合到非模板位置，因此出現了非特異性條帶.而再次擴增時，提高了復性溫度，上游引物結合到設計的模板鏈的位置，擴增出了目的基因片段.

3 教學小結

3.1 成功經驗

本次實驗由學生自主確定目的基因并設計引物，這能讓學生深度掌握PCR的核心內容，而不是加一下試劑走過場而已.學生通過全流程參與各個環節，深度理解DNA熱變性、引物的本質與方向、瓊脂糖凝膠的配制、核酸染料與指示劑的區別與作用、載樣緩沖液的作用與使用、DNA成像的原理和DNA在凝膠中遷移等微觀層面的知識等.本實驗的深度學習，還可以讓學生感受PCR與成像的神奇之處.在平時關于PCR的習題中，也能更得心應手.高考中關于PCR與電泳的習題，痛點大多集中于引物方面與電泳圖分析方面.所以學生通過體驗引物的設計和電泳結果的分析，可深度掌握PCR的內容.

為強化教學引導效果，在將凝膠放人電泳槽的過程中，教師可讓學生來操作.未接觸過瓊脂糖凝膠電泳的學生會不知所措，隨意放置凝膠.此時教師及時引導學生要注意電泳槽的“ + ”極和“-”極，并提問：在電泳液中DNA帶什么電？學生馬上恍然大悟：DNA帶負電，上樣孔應朝向“-”極一側

通過PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳的實際操作，學生可以感受分子生物學實驗的嚴謹，規范掌握微量移液器、電泳等操作.多數小組成功擴增出目的DNA片段，通過電泳與成像觀察到預期條帶，直觀理解實驗應用.對于一開始未達到的實驗預期進行分析并進一步改進，可以促進學生科學思維、科學探究等核心素養的發展，培養學生質疑的精神.分組學習模式也可以提高學生的配合與責任意識.雖然第3組最終沒有擴增出目的基因片段，但通過分析找到了原因，這使他們對引物設計等的學習可能會更加深刻.

3.2 反思與不足

在操作層面上最大的問題是微量移液器的使用，教師應在課前讓學生充分練習微量移液器.可以課前先模擬PCR反應體系的添加，特別是1微升左右試劑的添加，再或者可以把引物進行稀釋，這樣引物的添加就容易操作些.在上樣環節，也要提前模擬練習，以提高實驗教學的效率.還有一點遺憾的是，為了確保結果分析的嚴謹性，應將電泳條帶送去測序，以判斷擴增的序列是否為目的片段，以確定第4組出現的非特異性條帶是否符合預期推測

參考文獻：

［1］郭華.深度學習及其意義［J].課程·教材·教法，2016（11） ：59.

［2］徐小金．“DNA的簡易提取及片段的擴增”實驗教學設計[J].生物學教學，2023，48（6）：56-57.

[責任編輯：孫美齊]