Circ-USP14調控miR-1307影響胃癌進展的研究

[中圖分類號]R735.2 [文獻標志碼]A [DOI] 10.19767/j.cnki.32-1412.2025.03.001

[Abstract]Objective：To explore theexpresionof circ-USP14 ingastriccancer，andits impactonthedevelopment of gastriccancer.Methods：One hundred gastric cancertissues and their adjacent para-carcinoma tisses were selected. The expresson levelof circ-USP14 ingastriccancer tisses wasassessed byPCR method.Kaplan-Meier survival curve was used toanalyze the survival time of patients in the high-expression group and low-expression group of circ-USP14， andtherelationshipbetween the expresionof circ-USP14and the clinicopathological characteristics of gastriccancer was analyzed.ThegastriccancercellineAGSwascultivated，andthecirc-USP14overexpresionplasmid wasconstructed. Thecells weresetas theVector control groupandthe circ-USP14overexpresion group.Then，the proliferationabilityof gastric cancercellswasdetected bytheEDUassay，andthe migrationabilityofgastriccancercellswasdetectedbyhe Transwellassay.UsetheCircInteractome database topredict miRNAs that mayinteract with circ-USP14.ThepGL3reporter vectors of wild-type （circ-USP14-wt）and mutant （circ-USP14-mut）wereconstructed and co-transfected with miRNC and miR-13O7 intothecels，then thedual luciferase detection system wasusedtodeterminethe interactionbetween circ-USP14 and miR-13O7.Pearsoncorelation analysis wasusedto investigate therelationship between circ-USP14 and miR-1307.Results： The expresion levelof circ-USP14 in gastriccancer tissues was significantly lower than thatin paracarcinoma tissues.The expression level of circ-USPl4 was closely related to tumor diameter （ P =0.003），TNM grade（ P= 0.014），and lymph node metastasis （ P =0.002）.Compared with the Vector group，the proliferationability of gastric cancer cellsinthecirc-USP14overexpression groupsignificantlydecreased，andthemigrationabilitywassignificantlyweakened. The dual luciferase reporterassaydemonstrated that circ-USP14interacted with miR-1307.Pearson corelationanalysis revealedasignificant negativecorrelation between miR-1307and circ-USP14 expression in gastriccancer tisues.EDU experimentindicated thattransfectionofmiR-13O7mimicspromotedcell proliferation，whileoverexpresionofcic-USP14 inhibitedtheeffectof miR-1307mimics.TranswellassayshowedthatmiR-1307mimicspromotedthemigrationof gastric cancer cells，but overexpresson of circ-USP14 inhibited the promoting effct of miR-1307 mimics.Conclusion： The expressionofcirc-USP14ingastriccancerislow，whichisassociated with the malignant biological behaviorof gastriccacer and poorprognosisofpatients.Circ-USP14 inhibits theproliferationand migrationabilitiesof gastriccancercelsbyregulating miR-1307.

[KeyWords] circularRNA;circ-USP14;miR-13O7; gastric cancer

胃癌已成為全球癌癥相關死亡的第三大常見惡性疾病[1-2]，由于早期癥狀不明顯，患者往往在晚期才被確診，其5年生存率低于 20%^[3-4] 。對于局部晚期胃癌手術仍是主要的治療手段，但許多晚期患者并不符合手術條件5。以5-氟尿嘧啶（5-FU）為基礎的化療方案是治療晚期胃癌的首選方法，然而由于胃癌的異質性及耐藥性，化療后復發率較高。因此，探索新的基因表達模式和分子靶點具有重要意義。環狀RNA（circRNA）呈現獨特的閉環分子構型，其 5^′ 端缺乏帽結構， 3^′ 端不存在多聚腺苷酸尾[8-9]，具備抵抗RNA核酸外切酶降解的特性。circRNA通過充當microRNA的“分子海綿”抑制下游信號通路，或通過與RNA結合蛋白（RBPs）相互作用調控蛋白質功能[Io-]。盡管circRNA被歸類為非編碼RNA，但最新研究表明其可能參與蛋白質翻譯過程。circRNA中高度保守的開放閱讀框（ORFs）通過內部核糖體進入位點（IRES）滾環擴增（RCA）或m6A修飾等機制參與細胞增殖、凋亡和炎癥反應等過程[12-13]

本研究收集2014年1月一2015年12月在我科行根治性胃癌切除術的100例患者的胃癌標本，探討胃癌組織中circ-USP14表達的臨床意義及其對胃癌進展的影響，為探求胃癌治療的新策略提供理論依據。

1資料與方法

1.1樣本資料本研究收集100例胃癌組織及其鄰近的癌旁組織標本，獲得醫院倫理委員會批準。

1.2實驗方法

1.2.1實時熒光定量PCR（qRT-PCR）：TRIzol試劑提取樣本總RNA，利用微量核酸蛋白檢測系統測定RNA濃度。經濃度標準化處理后，應用逆轉錄試劑與熒光定量試劑（TaKaRa公司）將RNA模板轉化為cDNA，進行PCR擴增，以 β-actin 為內參，采用2^-ΔΔα 法進行相對定量。

1.2.2細胞培養：胃癌細胞株AGS[中國生命科學院（上海）采用含 10% 胎牛血清（FBS，Procell，武漢）及1% 青霉素/鏈霉素的RPMI1640培養基培養，置于37°C.5%CO₂ 的濕潤條件下培養。

1.2.3質粒構建與轉染：采用circ-USP14過表達載體（pLVX-puro，Genelily 生物技術公司，上海），Lipo-fectamine30oo（Invitrogen）質粒轉染試劑，在室溫下按試劑盒說明書進行操作。轉染 ^48h 后，使用嘌呤霉素篩選穩定轉染的細胞，培養30天。

1.2.4細胞增殖實驗：AGS細胞經消化處理后，各孔注入 100μL 含 50μM 5-乙炔基-2'-脫氧尿苷（5-ethynyl- ?2^? -deoxyuridine，EDU）的培養液，孵育 ^2h 。移除培養液，PBS溶液清洗2次。各孔加入 50μL 細胞固定液，孵育 30min ，再每孔補充 50μL2mg/mL 甘氨酸溶液，置于脫色搖床反應 5min 。移除甘氨酸溶液，加入 100μL PBS 溶液，在搖床上洗滌 5min 。去除PBS，各孔注入 100μL 滲透劑，搖床上孵育1min 。向每孔加入 100μL1×Apollo 染色液，室溫下避光孵育 30min 。各孔補充 100μL 含 0.5% TritonX-100的PBS溶液，在搖床上進行2次洗滌，棄去滲透劑。各孔加入 100μL 甲醇溶液，洗滌2次，每

次 5min 。使用去離子水按100：1比例稀釋試劑F，各孔加入 100μL ，搖床上孵育 30min 。移除染色液，100μL PBS 清洗3次。最終各孔保留 100μL PBS溶液用于后續實驗。染色完成后，進行圖像采集與數據分析。

1.2.5Transwell實驗：實驗體系由24孔板構成，上下培養室通過 8μm 孔徑的聚對苯二甲酸酯膜（康寧公司）實現物理分隔。實驗組將 1×10⁴ 個AGS細胞接種于上室，采用無血清RPMI1640培養基培養，下室填充含 10% 胎牛血清的RPMI1640培養基，置于 37^°C 恒溫 ，5%CO₂ 的濕潤環境下持續培養24h 培養結束后，首先棉簽擦拭濾膜上表面以移除未遷移細胞，隨后采用 4% 甲醛溶液浸泡 10min 固定處理，最后使用 0.1% 結晶紫溶液對遷移至下室的細胞染色 5min ，顯微鏡下觀察與圖像采集。

1.2.6雙熒光素酶報告實驗：為驗證circ-USP14的調控作用，構建野生型與突變型pGL3報告載體，分別命名為pGL3-circ-USP14-wt和pGL3-circ-USP14-mut。將上述載體分別與miR-NC和miR-1307共轉染至細胞中，經 ^48h 培養后，采用雙熒光素酶檢測系統進行活性測定。其中報告基因活性以螢火蟲熒光素酶與?？麩晒馑孛傅陌l光強度比值作為定量指標。

1.3統計學處理應用 SPSS27.0 和GraphPadPrism9.5統計學軟件對數據進行分析處理。計量資料以 表示，組間比較采用獨立樣本 χ_t 檢驗；計數資料以頻數或百分率表示，組間比較采用 χ² 檢驗。運用Kaplan-Meier生存曲線分析生存時間。 Plt;0.05 為差異有統計學意義。

2結果

2.1circ-USP14在胃癌組織中的表達及其臨床意義PCR檢測結果表明，胃癌組織中circ-USP14表達水平低于鄰近的癌旁組織，差異有統計學意義（ Plt; 0.05），見圖1A。根據100例胃癌組織circ-USP14的PCR檢測結果中位數，分為高表達組50例和低表達組50例。Kaplan-Meier生存曲線分析提示，circ-USP14高表達組患者總生存率高于低表達組，差異有統計學意義（ P=0.003 ，見圖1B。

2.2胃癌組織中circ-USP14表達水平與臨床病理特征的關系Circ-USP14表達水平與腫瘤直徑（ P=

0.003）、TNM分級（ scriptstyle（P=0.014 、淋巴結轉移 P=0.002 ）有關，而與患者性別、年齡、腫瘤位置、脈管癌栓無關C Pgt;0.05 ）。見表1。

A：胃癌及癌旁組織中circ-USP14表達；B：Kaplan-Meier生存曲線。

圖1circ-USP14在胃癌組織中的表達及臨床意義

表1胃癌組織中circ-USP14表達水平與患者臨床病理特征的關系

2.3circ-USP14抑制胃癌細胞增殖與遷移 EDU細胞增殖實驗顯示，與Vector組比較，circ-USP14過表達明顯抑制胃癌細胞的增殖活力 （Plt;0.01 ，見圖2A、B。Transwell實驗顯示，與Vector組比較，過表達circ-USP14明顯減弱AGS細胞的遷移能力（ Plt; 0.01），見圖2C、D。

2.4circ-USP14通過調控miR-1307發揮作用已有研究證實，circRNA通過結合miRNA影響腫瘤的進展過程，調控相關靶基因的表達水平?；贑ircInteractome數據庫分析，我們推測circ-USP14可能與miR-1307存在結合位點（圖3A）。為驗證這一假設，我們分別在胃癌細胞中同時轉染miR-1307模擬物及circ-USP14野生型（wt）或突變型（ Ω_mut 載體。雙熒光素酶報告實驗顯示，當miR-1307表達量增加時，circ-USP14-wt熒光素酶活性顯著下降，而circ-USP14-mut熒光素酶活性未發生明顯改變（圖3B、C）;qRT-PCR實驗顯示，胃癌細胞中miR-1307表達水平明顯上調（圖3D）；Pearson相關性分析顯示，胃癌組織中miR-1307與circ-USP14表達量呈顯著負相關（圖3E）。

圖2Circ-USP14抑制胃癌細胞增殖與遷移

A：CircInteractome數據庫預測circ-USP14與 miR-1307 之間存在潛在的相互作用位點；B-C：雙熒光素酶報告實驗檢測各組熒光素酶活性;D：qRT-PCR檢測 miR-1307 在胃癌組織中的表達水平;E：胃癌組織中circ-USP14與 miR-1307 的相關性（ ^**Plt;0.01 ）圖3Circ-USP14通過調控miR-1307發揮作用

2.5circ-USP14通過調控miR-1307抑制胃癌細胞增殖和遷移為驗證circ-USP14調節miR-1307的作用，將Vector+miR-NC、Vector + miR-1307mimics和 circ-USP14+miR-1307 mimics轉染AGS細胞。EDU細胞增殖實驗顯示，轉染 miR-1307mimics 促進細胞增殖，而circ-USP14過表達抑制miR-1307mimics的作用（圖4A、B）。Transwell實驗顯示，miR-1307mimics 促進胃癌細胞遷移，而circ-USP14過表達抑制miR-1307mimics的促進作用（圖4C、D），提示circ-USP14可能通過調控miR-1307抑制胃癌細胞增殖和遷移。

A-B：EDU細胞增殖實驗檢測各組轉染細胞的增殖活力;C-D：Transwell實驗檢測各組轉染細胞的遷移能力（ ^*Plt;0.05 ^*Plt;0.01 ）。

圖4Circ-USP14通過調控miR-1307影響胃癌細胞增殖和遷移

3討論

近年來環狀RNA（circRNA）作為一種新型內源性非編碼RNA受到廣泛關注，其主要通過microRNA（miRNA）等分子介導的轉錄及轉錄后調控機制而調控基因表達[4。circRNA因結構穩定性和進化保守性，在疾病診斷標志物和治療靶點開發領域展現出巨大潛力[15]。然而circ-USP14在胃癌發生中的作用及其潛在機制尚未明確。

本研究結果顯示，胃癌組織中circ-USP14表達較癌旁組織明顯降低，Kaplan-Meier生存曲線及胃癌臨床病理特征與circ-USP14表達相關性分析表明，circ-USP14低表達患者的預后差，總生存期較短，提示circ-USP14表達降低與胃癌患者的預后不良相關。Circ-USP14表達與腫瘤直徑、TNM分級、淋巴結轉移相關（均 Plt;0.05 ），而與患者性別、年齡、腫瘤位置、脈管癌栓情況無關（均 Pgt;0.05 ），表明circ-USP14可能與胃癌的惡性生物學行為相關，其異常表達可能是胃癌發生和進展的重要原因。EDU和

Transwell實驗結果顯示，circ-USP14顯著抑制胃癌細胞的增殖和遷移能力，生物信息學方法預測及雙熒光素酶報告實驗發現circ-USP14與miR-1307存在相互作用位點，circ-USP14通過調控miR-1307而抑制胃癌細胞的增殖和遷移。

綜上所述，胃癌組織中circ-USP14低表達，與胃癌的惡性生物學行為及患者預后不良有關，circ-USP14通過調控miR-1307表達而抑制胃癌細胞的增殖、遷移，為胃癌治療和診斷提供了新思路。

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[收稿日期]2025-04-20（本文編輯趙喜）