不同濃度細葉地榆乙醇提取物抗氧化活性分析

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Analysis of Antioxidant Activity of Ethanol Extract of Sanguisorba tenuifolia at Different Concentrations WANG Yue¹ ，WANG Hui-ying2，JIANG Yan³ et al（1.Colege of Agronomy，Yanbian University，Yanji， Jilin 0O;2.Longjing AgriculturalBioresouesaduralEneryaageentStation，Longing，lin334;3.ComprehsiveerviceCenterofaoagan Town，Yanji，Jilin 00）

AbstractObjectieTxploretantioxidantactivityofetaoletractsofSangusobteufoliaatdierentoncentratiosdeter minetheptiallceatifotactiofefoletdEaltactsoffadsigi centrations of ethanol（ 20% 50% 75% 90% ）.The antioxidant activities， including DPPH and ABTS free radical scavenging rates ，as well as reducingpower，eremeasuredditioalythontentsoftotallyholsadfavodsineetractsedteind.sulte 75% ethanolxtractofS.tenufoliahdgodantioxidantproperties，nludingDPPHandBfreradicalsavengingratesasellasducingpowerAttei，eotalolyolandavoodontetoftextractalshowdaighlevel，sigifcantlyeraotr concentrations of ethanol extracts.[Conclusion 175% ethanol is the optimal extraction concentration of S.tenuifolia.

KeywordsSanguisorba tenuifolia;Ethanol extract;Antioxidant activity;Total polyphenol;Flavonoid

隨著社會發展，人們面臨著越來越多的氧化應激源，如輻射、重金屬等，這些會導致體內自由基的過度產生。研究表明，部分中藥材提取物具有抗氧化活性，其含有的抗氧化活性物質通過清除自由基，起到保護細胞和維持健康的作用[1-2]。總多酚和類黃酮的含量是評判植物抗氧化能力的重要指標。總多酚是一類具有多個羥基苯環的化合物，類黃酮是以C6-C3-C6為基本碳架的一系列化合物，常見于植物中，具有抑菌[3]、抗炎[4]、抗氧化[5]、抗癌[和抗病毒[]等生理作用。

地榆（SanguisorbaofficinalisL.）是薔薇科地榆屬多年生草本植物，其根部作為中藥材被廣泛應用，其藥性微寒，味苦、酸、澀，歸肝、胃、大腸經，具有涼血止血、解毒斂瘡的功效[8]。地榆常被用來治療燒傷、燙傷、直腸炎、潰瘍性結腸炎、腎炎等炎癥性疾病[9]。研究顯示，地榆提取物中含有多種抗氧化活性物質，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗過敏、抗衰老、止血、抗氧化、抗急性腎損傷、抗腫瘤等藥理作用[o-]但隨著過度挖掘，野生地榆數量急劇減少。細葉地榆（San-guisorbatenuifolia）作為地榆的同屬植物，主要分布在黑龍江、吉林、遼寧、內蒙古等地[2]，目前對其抗氧化活性方面的研究并不完善。該研究擬采用不同濃度乙醇對細葉地榆進行提取，研究不同濃度乙醇對提取物中總多酚、類黃酮含量的影響，以及不同濃度乙醇提取物抗氧化活性的差異，為進一步研究細葉地榆提取物抗氧化活性提供理論基礎。

1材料與方法

1.1材料與試劑細葉地榆采集于吉林省延邊朝鮮族自治州山區內。蒸餾水；磷酸緩沖液（PBS），上海麥克林生化科技股份有限公司；無水乙醇（AR），天津市科密歐化學試劑有限公司；甲醇（AR），天津市科密歐化學試劑有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），福州飛凈生物科技有限公司；二甲亞砜DMSO（AR），天津市科密歐化學試劑有限公司；福林酚（AR），上海源葉生物科技有限公司；沒食子酸標準品，上海源葉生物科技有限公司；碳酸鈉（AR），天津市科密歐化學試劑有限公司： ^2，2′ -聯氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS），福州飛凈生物科技有限公司；過硫酸鉀（AR），天津市科密歐化學試劑有限公司；蘆丁標準品，上海源葉生物科技有限公司;Diethylene glycol二甘醇，上海源葉生物科技有限公司；氫氧化鈉（AR），福晨天津化學試劑有限公司；磷酸鈉（AR），天津市科密歐化學試劑有限公司；鐵氰化鉀（AR），福晨天津化學試劑有限公司；三氯乙酸（AR），天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.2儀器與設備800A密封型多功能粉碎機，永康市紅太陽機電有限公司；08-2G型恒溫磁力攪拌器，上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；華鷗 1000mL 抽濾瓶，江蘇華歐玻璃有限公司；4IK30RA型旋轉蒸發儀，鄭州華特儀器設備有限公司；HH-WO-2L型升降水浴鍋，鄭州華特儀器設備有限公司；SHZ-D（II）循環水式多用真空泵，鄭州華特儀器設備有限公司；FD-1A-50型冷凍干燥機，上海比朗儀器制造有限公司；SH-MIX2500型迷你漩渦混合儀，杭州申花科技有限公司；FA2104型電子天平稱，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；Eppendorf移液槍，德國艾本德股份公司;DPH-9052型電熱恒溫培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；MultiskanFC型酶標儀，賽默飛世爾上海儀器有限公司。

1.3不同溶劑細葉地榆提取物的制備將細葉地榆干燥樣品用粉碎機粉碎后，過60目篩，分別稱取曬后樣品粉末 100g 于 20%.50%.75% 和 90% 乙醇中進行提取加熱回流，真空抽濾瓶過濾，用旋轉蒸發儀濃縮，濃縮液用冷凍干燥機制備成干燥粉末[13-16]，得到細葉地榆在 20%.50%.75%.90% 乙醇4種不同濃度下的提取物，從而進行抗氧化活性分析。

1.4抗氧化活性測定

1.4.1DPPH自由基清除率測定。DPPH自由基清除能力參考文獻[17-18]測定，并作出了適當修改。精密稱取 0.004gDP 1PH加入 50mL 甲醇溶解，定容至 100mL ，得到 0.1mmol/L DPPH溶液，棕色瓶子避光保存，現用現配。分別取4種乙醇濃度提取下的細葉地榆樣品溶液 1mL ，添加 1mL 0.1mmol/LDPPH溶液，培養箱避光 37^°C 反應 30min 后，在波長 517nm 處測定吸光度，采用蒸餾水替代樣品溶液作為空白對照，而維生素C作為清除率為 100% 的陽性對照。每項試驗均需進行3次重復，最終結果取平均值。細葉地榆提取物對DPPH自由基的清除率計算公式如下：

式中 ：A₀ 為空白對照的吸光度；A為各個樣品溶液的吸光度。1.4.2ABTS自由基清除率測定。ABTS自由基清除能力參考文獻[19-21]測定，并作出了適當修改。準確稱取 3.7845g 過硫酸鉀固體并溶解于去離子水中，定容至 100mL ，制備出濃度為 140mmol/L 的過硫酸鉀溶液。另準確稱取 0.3841g ABTS標準品并溶解于去離子水中，定容至 100mL ，得到濃度為 7mmol 的ABTS溶液。將 25mL ABTS溶液與 440μL 過硫酸鉀溶液混合，在避光條件下靜置 16h ，制備出ABTS儲備液。通過無水乙醇稀釋儲備液，確保稀釋后的工作液吸光度維持在 0.70±0.02 ，最終獲得ABTS工作液，該溶液現用現配，密封避光保存。取細葉地榆樣品溶液 100μL ，并加入900μL 的ABTS工作液，暗狀態下反應 5min ，采用蒸餾水替代樣品溶液作為空白對照，而維生素C作為清除率為 100% 的陽性對照。每項試驗均需進行3次重復，最終結果取平均值，結果代入公式（1）計算ABTS自由基清除率。

1.4.3還原力測定。還原力參考文獻[22]測定，并作出了適當修改。將 1mL 不同濃度的樣品溶液加入 2.5mLpH 為6.6的磷酸緩沖溶液中，然后加入 2.5mL4% 的鐵氰化鉀；隨后，在 50^qC 恒溫水浴中加熱混合物 20min ，并進行急速冷卻，接著加入 1mL10% 的三氯乙酸，混勻后取上層清液 5mL ，加入1mL0.1% 的 FeCl₃ ，再加人 5mL 蒸餾水混合。靜置 10min 后，在波長 700nm 下測得吸光度（A）。以 1mmol?L 蘆丁標準試劑作為還原力為 100% 的對照，在波長 700nm 下測得吸光度 （A^′） 。每項試驗均需進行3次重復，最終結果取平均值，結果代人公式（2）計算還原力。

還原力

1.4.4總多酚含量測定。總多酚含量參考文獻[23]測定，并作出了適當修改。采用福林酚法，加入無水乙醇，沒食子酸、樣品各 25μL （樣品濃度為 1mg/mL ），加人 10% Folin－酚500μL ，黑暗狀態下反應 5min ，再加入 7.5% 的碳酸鈉500μL ，充分混合均勻后，用錫箔紙包住，放在培養箱內 37^°C 反應 。在波長 765nm 下測得混合物吸光度（A），每項試驗均需進行3次重復，最終結果取平均值。

以沒食子酸質量濃度（ mg/mL ）為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程為 y=0.0016x+0.0437（R²= 0.9961）。代入試驗所得吸光度，得出總多酚含量。1.4.5類黃酮含量測定。類黃酮含量參考文獻[24-25]測定，并作出了適當修改。配制濃度為 0.12.5，25.0，50.0μg/mL 的蘆丁溶液，DMSO為溶劑。分別取蘆丁和細葉地榆樣品（ 1mg/mL 各 300μL ，并加入 600μL Diethylene glycol，室溫下反應 5min ，加入 10μL 濃度為 1mol/L 的 ΔNaOH 溶液，培養箱 37^°C 暗狀態下反應 1h ，在波長 510nm 下測定混合物的吸光度（A），每項試驗均需進行3次重復，最終結果取平均值。

以蘆丁質量濃度（ mg/mL ）為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程為 y=0.0021x+0.0357（R²= 0.9954）。代入試驗所得吸光度，得出類黃酮含量。

1.5統計學分析采用 Excel2010 和SPSS20.0軟件對試驗數據進行相關性分析以及繪圖，每個試驗組進行3次重復，結果以平均值 ± 標準差表示。

2 結果與分析

2.1DPPH自由基的清除率從圖1可以看出，細葉地榆提取物對DPPH自由基均有清除作用，且清除率呈濃度依賴性。 20% 、 50% .75% 和 90% 乙醇細葉地榆提取物的 IC₅₀ 分別為 29.81，20.14，17.48 和 18.11μg/mL 0 75% 乙醇細葉地榆提取物的 IC₅₀ 最低，這表明 75% 乙醇細葉地榆提取物的DPPH自由基清除率最高，抗氧化活性最好。

2.2ABTS自由基的清除率從圖2可以看出，細葉地榆提取物對ABTS自由基均有清除作用，且清除率呈濃度依賴性。 20% 50% ， 75% 和 90% 乙醇細葉地榆提取物的 IC₅₀ 分別為 67.09，50.00，36.89，44.47μg/mL， 75% 乙醇細葉地榆提取物的 IC₅₀ 明顯低于其他3種濃度乙醇的細葉地榆提取物，這表明 75% 乙醇細葉地榆提取物的ABTS自由基清除率最高，其抗氧化活性最好。

2.3還原力從圖3可以看出， 20%.50%.75% 和 90% 乙醇的細葉地榆提取物均具有還原力，且呈濃度依賴性。在濃度為800μg/mL 時4種乙醇濃度的細葉地榆提取物還原力均達到了50% ，但 75% 乙醇細葉地榆提取物在濃度為 400μg/mL 時，還原力已經達到了 50% ，這表明 75% 乙醇細葉地榆提取物的還原力明顯高于其他3種濃度乙醇的細葉地榆提取物，抗氧化活性最好。

2.4總多酚與類黃酮含量 由圖4可知， 75% 乙醇細葉地榆提取物的總多酚、類黃酮含量均為最高，說明 75% 乙醇是提取細葉地榆的較好溶劑。

2.5總多酚、類黃酮與抗氧化能力的相關性分析由表1可知，總多酚含量與類黃酮含量之間存在著極顯著正相關關系（ Plt;0.01） ，而與DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、還原力之間均呈現極顯著負相關關系（ Plt;0.01 ）。類黃酮含量與DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、還原力之間也存在著極顯著負相關關系（ ?Plt;0.01 。DPPH自由基清除率與ABTS自由基清除率、還原力之間存在著極顯著正相關關系（ Plt;0.01 ），而ABTS自由基清除率與還原力之間也呈現極顯著正相關關系（ Plt;0.01 ）。

3討論

DPPH自由基是一種穩定的自由基，在有機溶劑中存在，其分子中含有多個吸電子的— ?NO₂ 基團，使其醇溶液呈紫色。DPPH需要在低溫避光條件下儲存，它具有單一電子結構，因此能夠接受電子或氫離子。另外，ABTS自由基清除率也可用于評估提取物的抗氧化作用。在適當氧化劑的作用下，ABTS氧化成綠色的 ABTS⁺ ·，但在存在抗氧化物的情況下， ABTS⁺ ·的產生將被抑制[26]。因此，DPPH和ABTS自由基的清除率可以用來評估提取物的抗氧化能力，清除率越高則代表抗氧化作用越強。一般來說，清除率在 50%～80% 被認為是理想的范圍。 IC₅₀ 是指在自由基清除率達到 50% 時所需要提取物的質量濃度，用于比較不同提取物之間抗氧化作用的效果優劣。在該研究中， 75% 乙醇細葉地榆提取物對DPPH和ABTS自由基清除率的 IC₅₀ 最小，分別為17.48、36.89μg/mL ，表明 75% 乙醇細葉地榆提取物對DPPH和ABTS自由基清除率最高，抗氧化活性最好。

具有強還原力的提取物在抗氧化作用中發揮著重要作用，這些提取物能夠不僅提供電子和氧，從而中斷自由基鏈式反應，還能與過氧化物發生反應形成穩定的化合物。在酸性條件下，抗氧化物質可以將 Fe³⁺ 還原為 Fe²⁺ ，通過吸光度測定反映細葉地榆提取物的抗氧化能力[27]。在該研究中，75% 乙醇的細葉地榆提取物在濃度為 400μg/mL 時還原力已經達到了 50% ，遠低于其他3種濃度乙醇細葉地榆提取物， 75% 乙醇細葉地榆提取物抗氧化活性最好。

多酚是一種非營養性生物劑，包括花青昔、黃酮昔和單寧等成分，被廣泛認為是強力的抗氧化劑，它在保護人體免受氧化損傷的作用中起著關鍵的作用，可以直接影響蛋白質、脂質、碳水化合物和DNA。類黃酮是植物的重要次級代謝產物，以結合態（黃酮苷）或自由態（黃酮苷元）的形式存在于許多食物中，如水果、蔬菜、豆類和茶葉[3]。總多酚、類黃酮的含量直接影響抗氧化活性，該研究發現 75% 乙醇細葉地榆提取物總多酚、類黃酮含量最高，進一步表明 75% 乙醇細葉地榆提取物抗氧化活性最好。

75% 乙醇提取效果最好的原因可能是 75% 乙醇具有較為理想的溶解性能和萃取能力。 75% 乙醇可以溶解大多數的抗氧化類化合物，使其能夠從細葉地榆中充分溶解出來。其次，乙醇也有一定的極性，可以與化合物之間發生相互作用，有助于提高萃取效果。為了提高地榆黃酮的提取純化工藝，韓康等[28]選擇研究乙醇濃度、提取時間、溶劑用量和提取次數等因素，最終確認 70% 乙醇為最佳濃度。趙楊等[29]通過研究料液比、提取溫度、提取時間等因素，優化了地榆總黃酮的提取工藝，最終得出使用 60% 乙醇作為提取溶劑是最有效的。在該研究中， 75% 乙醇可以在不引起明顯安全隱患的情況下提取細葉地榆抗氧化活性物質，且相對純度較高，適用于抗氧化活性物質的萃取和提純。

4結論

該研究對 20%.50%.75% 和 90% 乙醇的細葉地榆提取物進行了DPPH和ABTS自由基清除能力、還原力測定以及總多酚、類黃酮含量測定的抗氧化活性試驗，結果表明， 75% 乙醇細葉地榆提取物的DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、還原力、總多酚和類黃酮的含量均優于其他3個濃度乙醇的細葉地榆提取物，這表明 75% 乙醇是提取細葉地榆抗氧化活性物質的最佳濃度，同時，也可以一定程度上減少細葉地榆藥用資源的浪費。綜上， 75% 乙醇可以作為細葉地榆提取物的最佳濃度溶劑，為今后細葉地榆提取物抗氧化活性的進一步研究提供理論基礎。

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