秀麗四照花組培快繁體系建立

中圖分類號：S688.9Q945.52 文獻標識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006—6500.2025.06.002

Establishment of Rapid Multiplication System for Tissue Culture of Cornus hongkongensis subsp.elegans RUAN Shuming，LAI Shigan， ZHOU Xianzhen

（FujianForestryVocationalamp;TechnicalCollege，Nanping，Fujian353OOO，China）

Abstract：InordertoestablisharapidpropagationsystemforCornusflorida，tisseculturemethodswereused.Thestudyinvolved screenigsterilizationmethdsforstemsegmentexplantsofCorusflordandinvestigatingtheefectsofdiferentconcentratinsof hormonesNAAandBAoallsiuction，uddfrentiatio，oungleafproliferationdotigTeresultsidiatedtste ilization with 0.1% HgCl2 for 12 minuteswas optimal.Callus induction was most effectivewith M IS+1.0mg?L^-16-BA+0.2mg?L^-1 NAA， reaching a 90% induction rate after 40 days.Bud differentiation from callus was best promoted by MS+2.O mg·L ^-1 6-BA+0.2 mg·L^-1 NAA. Shoot proliferation from sterile young leaves was highest with MS+1.O mg·L^-1 NAA+0.5 mg·L-16-BA.Root induction was best in MS+0.5 mg·L^-1 IBA，however，the induced roots were prone to browning，necessitating timely subculture onto a rejuvenationmediumIncondusion，thisstudyprovidesatechnicalfoundtionforthelarge-scalepropagatinofthisspecies，whichisof great significance for its resource development and industrial application.

Keywords：Cornus hongkongensis subsp.elegans; tissue culture; stem segment; callus

山茱萸科（Cornaceae）四照花屬（Dendrobenthamia）植物，其頭狀花序近似球形，擁有4片大型白色花瓣狀苞片，成熟時果實肉質呈紅色，使其成為備受推崇的觀花觀果樹種，是具有較好經濟效益的鄉土樹種，同時在森林生態系統中也發揮著重要的生態效益[2-3]，在園林綠化、果用和藥用等方面都有良好的發展前景4。

目前，對四照花的育苗研究主要集中于種子與扦插7-，植物組織培養在苗木生產與林木遺傳改良等領域發揮著重要作用]。姚俠南等[發現， MS+ 0.5mg?L^-16-BA+1.5mg?L^-1（ GA培養基最適合武夷四照花（Cornuselliptica）的莖尖培養。楊尋l研究發現，WPM培養基適宜東京四照花（Cornushongkongensissubsp.tonkinensis莖段誘導。陳夢倩[13]研究認為，1/2MS能降低香港四照花（Cormushongkongensis）愈傷組織的褐化率，但未能提高其分化率。路承香等[4在峨眉四照花（Cornuscapitata）莖尖組培中發現，愈傷組織易產生，但不易分化出不定芽。唐佳佳等[5發現，狹葉四照花（Cornuselliptica）外植體最佳消毒處理為吐溫-80與NaClO的組合，IBA和NAA對狹葉四照花不定根的誘導效果明顯。秀麗四照花（Cornus hongkongensis subsp.elegans）是福建省、江西省、浙江省等主要鄉土樹種，筆者于前文研究介紹了秀麗四照花種子萌發特性，發現種皮是影響秀麗四照花種子萌發的重要因素，變溫有利于其萌發；而未見有關秀麗四照花的其他育苗技術報道。本研究對秀麗四照花進行快速繁殖體系研究，旨在建立高效且穩定的植物組織培養系統，以期為以后的工廠化育苗提供理論基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗樹為福建省三明市沙縣區夏茂鎮（ 26^°20^′ N， 117^°32^′～118^°06^′E 的秀麗四照花成齡樹。夏茂鎮屬中亞熱帶季風性氣候，平均氣溫 19.2^°C ，年平均降雨量 1700mm 于2021年6月抽生新梢后，選擇新梢上無病蟲害的嫩梢作為外植體進行組織培養。

1.2試驗方法

1.2.1外植體消毒方法的篩選將嫩梢剪去葉片，切成 5.0～6.0cm 長的莖段（帶芽和不帶芽），用洗滌劑洗去外植體表面污漬，用流水沖洗 ^2h 后，在超凈臺上用 75% 酒精浸泡15s，再用無菌水清洗3～4遍，瀝干水后轉入無菌培養皿中。分別用 0.1% 升汞（ HgCl₂ ）溶液消毒 （9，12，15min ）和 2% 次氯酸鈉（NaClO）溶液消毒 （5，10，15min ，期間不斷搖動或攪拌；消毒后，用無菌水清洗3～4遍，再用無菌濾紙吸干水分。切除傷口部位后，帶芽莖段切成 1.0～ 2.0cm 長，接種于MS培養基上。每個處理接種10個培養瓶，為避免交叉感染，每瓶接1個外植體，重復3次，每日觀察統計污染率和存活率。

1.2.2愈傷組織誘導的培養基篩選將消毒的秀麗四照花莖段接種到添加不同濃度 6-BA（0，1.0，1.5， 2.0mg?L^-1） 和 NAA（0，0.2，1.0mg?L^-1） 的MS啟動培養基上（培養基中加入 1.0g?L^-1VC 抗褐化劑，下同），研究不同濃度6-BA和NAA對其愈傷組織誘導的影響。每個處理每瓶接種1～3個成功脫毒外植體，共接種30個外植體，重復3次。接種后，每日觀察并記錄愈傷出現與生長狀況， 40d 左右統計數據。1.2.3愈傷組織芽分化的培養基篩選將誘導成功的秀麗四照花愈傷組織，轉接種到愈傷組織誘導的MS培養基上，研究不同濃度6-BA和NAA對其愈傷組織芽分化的影響。每個處理每瓶接種2～3個愈傷組織，共接種30個愈傷組織，重復3次。接種后，每天觀察并記錄愈傷組織芽分化情況， 左右統計數據。

1.2.4幼葉誘導芽增殖的培養基篩選取出從帶芽莖段萌芽長出的無菌幼葉，轉接到添加不同濃度6-BA（0，0.5，1.0mg?L^-1） 和NAA（ 0.0.2，1.0mg^-1， 0的MS培養基上，研究不同濃度6-BA和NAA對幼葉誘導芽增殖的影響。每個處理每瓶接種1～2片幼葉，共接種30片幼葉，重復3次。接種后，每天觀察并記錄芽增殖情況，30d左右統計數據。

1.2.5生根培養基篩選將增殖培養獲得的 1.5～ 2.0cm 以上健壯苗分割成單株進行生根誘導，以MS為基本培養基，附加不同濃度IBA或NAA。每個處理每瓶接種2～3個苗，共接種30個苗，重復3次。40d 后觀察每個處理的生根情況，統計生根率。

1.2.6移栽當組培苗根長到 2cm 以上時，打開玻璃瓶蓋在組培室里煉苗一周，每天定時噴水1次。移栽前，洗凈組培苗基部的培養基，移栽到疏松基質中。定時澆水，常規管理，觀察移栽效果。

1.3數據處理

采用Excel2007軟件進行數據處理、SPSS19.0軟件進行數據方差分析。

污染率 （%）₌ 出現污染的外植體數 ×100 （20號接種外植體數

存活率 （%）₌ 未污染并存活的外植體數 ×100 （204號接種外植體數

死亡率 （% ）=死亡的外植體數 ×100 （20接種外植體數

誘導率（%）= 誘導數 ×100接種外植體數[13]

增殖系數 ?=. 1 新生苗數接種幼苗數[13]

2 結果與分析

2.1不同消毒處理對秀麗四照花的消毒效果比較

試驗使用 0.1%HgCl₂ 消毒處理時，隨著消毒時間的延長，莖段的死亡率上升、污染率逐漸下降，但成活率明顯上升后下降（表1）。處理 2（0.1%HgCl₂ 消毒 12min ）的莖段表現最好，具有最高成活率0 76.67% ）和較低污染率（ 16.67% ）。試驗使用 2% NaClO消毒處理時，莖段在處理時間延長后，污染率略有下降，但成活率沒有明顯提高，差異不顯著。由表1可知， 0.1%HgCl₂ 消毒處理在絕大多數情況下都比 2%NaClO 消毒處理更有效，特別是在處理時間為 12min 時成活率達到顯著區別，表現最佳。因此，本試驗選擇 0.1%HgCl₂12min 為四照花外植體的消毒方式。

表1不同消毒處理對外植體成活率影響

注：不同字母表示差異顯著 Plt;0.05 。下同。

本試驗中采用 2%NaClO 溶液消毒時，雖然死亡率低，但污染率高，因而成活率極低。采用 0.1% HgCl₂ 溶液消毒效果優于 2%NaClO ，這與姚俠南[0]楊尋[12陳夢倩[3、路承香等4試驗結果一致。但升汞有一定毒性，容易引起外植體褐化，在消毒過程應嚴格控制時間，注意無菌水反復沖洗以減少對外植體的傷害，并添加VC作為抗褐化劑。但唐佳佳等認為， 3%NaClO 與吐溫-80相結合為狹葉四照花（Cornuselliptica）最佳滅菌效果，這與其采用的外植體為播種實生幼苗嫩枝條有關。

2.2不同濃度NAA和6-BA對莖段愈傷組織誘導的影響

將雙因素對莖段愈傷組織誘導的試驗結果進行方差分析（表2），不同濃度NAA對愈傷組織誘導沒有顯著影響，但不同濃度6-BA以及6-BA與NAA的組合使用會對愈傷組織誘導的影響極顯著（ Plt; 0.01）。比較 F 值可知，6-BA對愈傷組織誘導的影響大于6-BA與NAA的交互作用，但兩者相差不大。

表2雙因素對愈傷組織誘導的方差分析

在MS培養基中添加各種配比的NAA和6-BA均可產生愈傷組織（與對照差異顯著），以 MS+ 1.0mg^?L^-16-BA+0.2mg^?L^-1NAA 中愈傷組織誘導率最高（表3）。試驗過程中發現（圖1），接種19d，肉眼可以觀察到愈傷組織的啟蒙，27d后，該組合培養基中的莖段觀察到明顯的黃白色愈傷組織，其形成過程：初期在莖段傷口處先開始膨大并逐漸形成愈傷組織，隨后愈傷組織變大，慢慢長成一整塊黃綠色愈傷組織，結構緊實。試驗過程中還發現，帶芽莖段外植體基部傷口處膨大，長出愈傷組織，且不影響莖段新芽的生長，與陳夢倩3試驗觀察相同。

試驗過程中觀察到莖段愈傷組織增殖迅速，如果愈傷組織未能及時轉接繼代或誘導出苗，由于營養消耗顏色變淺愈傷組織玻璃化，愈傷組織結構松散，質量下降，可能會導致后續的細胞分裂、生長和分化受到影響，進而影響整個植物再生過程，應根據愈傷組織的狀態及培養基的干濕程度決定是否需要繼代培養。

表3不同濃度NAA和6-BA對愈傷組織誘導的影響

Tab.3The effect of different concentrationsofNAAand6-BA on callusinduction.

圖1莖段外植體愈傷組織誘導與增殖

2.3不同濃度NAA和6-BA對愈傷組織芽分化的影響

將雙因素對莖段愈傷組織芽分化誘導的試驗結果進行方差分析（表4），不同濃度NAA對莖段愈傷組織芽分化沒有顯著影響，但不同濃度6-BA以及6-BA與NAA的組合使用會對愈傷組織芽分化誘導的影響極顯著 Plt;0.01 ）。比較 F 值可知，6-BA對愈傷組織芽分化誘導的影響遠大于6-BA與NAA的交互作用。

Tab.4Variance analysis ofcallusbuddifferentiation inductionbydouble factors

在 0.2mg^?L^-1NAA+1.0mg^?L^-16-BA（1.5mg^?L^-16- BA）中愈傷組織芽分化誘導率（約 67.78% ）表現良好（表5）。當6-BA濃度升至 2.0mg?L^-1 時，誘導率顯著提高。當NAA濃度升至 1.0mg?L^-1 時，愈傷組織芽分化萌發顯著下降，誘導率明顯下降，試驗最優的芽分化誘導培養基方案是使用MS培養基配合2.0mg?L^-16-BA 和 0.2mg?L^-1NAA ，可以實現較高的分化誘導率（ 77.78% ）。試驗過程中發現（圖2），在愈傷組織轉接2～3次后，能觀察到分化芽的出現，在繼代培養后出現快速出芽與增殖現象。

表5不同濃度NAA和6-BA對愈傷組織芽分化誘導的影響

Tab.5Theeffect of different concentrationsof NAA and 6-BAoncallus buddifferentiation induction

圖2莖段愈傷組織芽分化誘導

Fig.2 Induction of bud differentiation from stem segment callus

A.愈傷組織轉接;B.愈傷組織芽分化（培養65d）;C.繼代培養的誘導芽（培養90d）;D.增殖培養的誘導芽（培養100d）。

2.4不同濃度NAA和6-BA對幼葉誘導芽增殖的影響將雙因素對幼葉誘導生根培養的試驗結果進行方差分析（表6），不同濃度NAA和6-BA，以及NAA與6-BA的組合使用，對幼葉誘導芽增殖具有顯著影響 （Plt;0.05） 。比較 F 值可知，NAA對幼葉誘導芽增殖的影響明顯大于6-BA。當這兩種激素組合使用時，它們對芽增殖的影響與單獨使用NAA相比，并未表現出提升。

表6雙因素對幼葉誘導芽增殖的方差分析

在較低濃度NAA水平下 （0.2mg?L^-1） ，由幼葉誘導芽增殖的系數差異不顯著（表7）。但當NAA濃度升至 1.0mg?L^-1 ，與低濃度 6-BA（0.5mg?L^-1） 組合時，增殖系數與其他組合差異顯著，同時試驗過程中發現（圖3），幼葉誘導率接近 100% ，大部分幼葉在接種16d后從葉柄基部切口處開始出現愈傷組織，25d 后就能觀察到愈傷組織部位分化出芽，繼續培養5d后小芽呈暴發性增殖，從接種到50d左右，小苗達到 1.0cm 時即可進入壯苗生根培育。故本試驗經篩選幼葉誘導芽增殖的培養基為 MS+1.0mg^?L^-1NAA+ 0.5mg?L^-16-BA 。部分幼葉在培養基中不經過愈傷組織階段，能直接從葉柄基部切口處分化出不定芽，這與王磊等在懸鈴木葉片再生體系建立、王國英等在懸鉤子離體葉片培養過程觀察一致，但分化芽數量不及愈傷組織。而陳夢倩[3認為，嫩葉啟動較慢，出愈率低于莖段，褐化率較高，分析這種不同是因為本試驗使用的葉片為帶芽莖段萌芽出的無菌嫩葉，分化程度低，同時減少了外植體消毒劑對幼葉的毒害。

表7不同濃度NAA和6-BA對幼葉誘導芽增殖的影響

圖3幼葉誘導的芽增殖

Fig.3Bud proliferationinduced by juvenile leaves

2.5不同濃度NAA或IBA對生根培養的影響將雙因素對誘導生根培養的試驗結果進行方差分析（表8）不同濃度IBA對生根有顯著影響（ Plt; 0.05），但不同濃度NAA對于生根沒有顯著影響。

表8雙因素對誘導生根培養的方差分析

在沒有添加生長素的MS培養基中，秀麗四照花誘導生根為0，這表明生長素對于生根過程至關重要（表9）。不同生長素（IBA和NAA）對生根產生不同的影響，從處理6～9可見不同濃度NAA以及NAA與IBA的組合使用，四照花生根率較低，差異不顯著；而在不同濃度單獨IBA下，生根率存在顯著差異， 0.5mg?L^-1IBA 的效果最佳，生根率為53.33% ，生長速度較快，與紫薇屬植物8生根相同。IBA提高濃度后（升至 1.0mg?L^-1 ，生根率降低，愈傷組織逐漸形成。試驗過程中也發現，添加NAA，根生長緩慢，這種根不適合后續移栽試驗。試驗過程中還發現，四照花植物的根系極易發生褐化（圖4），影響了下一步生根苗的復壯。但正常根系的組培苗煉苗后育苗常規管理下秀麗四照花移栽率達到 85% 。

表9不同濃度IBA和NAA對誘導生根培養的影響 Tab.9The effectof differentconcentrations of IBA and NAA oninductionrooting culture

3討論與結論

3.1 討論

3.1.1外植體的種類與污染的控制外植體的種類是影響組織培養的主要因素。研究表明，子葉、莖段、根、葉片、葉柄等都可以作為木本植物組織培養外植體材料[19]，但木本植物的最佳外植體為幼年期材料[2，本試驗主要研究了莖段與帶芽莖段做為啟動秀麗四照花組織培養的外植體，并取出帶芽莖段萌芽產生的幼葉為外植體誘導不定芽，在最佳培養基幼葉接種16d出現愈傷組織，30d就能出現不定芽苗增殖（增殖系數3.18），比莖段愈傷組織芽苗分化培養時間（90d）縮短近2/3時間，且不褐化，因此秀麗四照花萌芽無菌嫩葉做為外植體分化時間優于莖段。葉齡、葉片大小、生長位置等都對不定芽分化率有影響，下一步應優化試驗提高嫩葉外植體的誘導效果。

外植體消毒成功是組織培養啟動的關鍵，消毒后能減少表面微生物從而降低組織培養污染率，是建立無菌體系的基本前提，大量試驗證明 0.1%HgCl₂ 是木本植物最理想的消毒劑[，本試驗過程中也發現 0.1%HgCl₂ 溶液消毒效果優于 2%NaClO 。但由于植物莖葉表面微生物的菌絲體容易侵入表皮引起內生菌的污染2，表面消毒方法難以徹底清除，從而組培中污染頑固難以根除，在今后的培養中，可以在培養基中添加適當的抑菌劑如丙酸鈉、磷酸鈉、頭孢霉素、百菌清、代森錳鋅、1，2-苯并異噻唑啉-3-酮、烯酰·錳鋅、異噻唑啉酮等21-23]以達到抑菌效果。

3.1.2植物激素的種類與濃度的篩選植物激素的不同種類與濃度是影響外植體誘導和分化的關鍵因素[20]。試驗過程中發現，6-BA對于莖段愈傷組織誘導和芽分化誘導有較好效果，在相同濃度6-BA組合里，NAA濃度越低，愈傷組織誘導率越高，這與陳夢倩[13觀察相同，在木蘭科植物中也有相同結果[24，同時6-BA的誘導效果均優于6-BA與NAA的組合，故6-BA是影響秀麗四照花莖段誘導的主因。

而在嫩葉誘導中，愈傷組織誘導對NAA敏感性大于6-BA。陸楊輝25在樹莓葉愈傷組織誘導中也發現，6-BA對愈傷形成有抑制作用。李玲玲2發現，中 1.5mg?L^-1）NAA 與（ 0.5mg?L^-1）6-BA 的MS培養基濃度下，全愈率較高，NAA更有利于誘導銀杏嫩葉愈傷組織。白心遠等研究認為，桷樹葉片誘導愈傷組織的最佳培養基為 MS+1.5mg?L^-1NAA+0.5 mg?L^-16-BA ，這與本試驗結果相近。與此不同的是，陳夢倩認為，6-BA對香港四照花嫩葉愈傷組織的誘導遠大于NAA，這與試驗研究過程中植物品種、所選培養基、植物激素濃度范圍等不同有關。

3.1.3生根誘導培養的因素本試驗中生長素促進秀麗四照花試管生根，IBA誘導效果比NAA顯著，此結果與唐佳佳等相同，在油松組培芽不定根誘導中也有同樣效果28，但培養過程中發現長根較難，可能與IBA在誘導生根的后期并非必要有關2，部分根系容易褐化、葉片玻璃化，這部分幼苗復壯效果不佳，影響試管苗移栽成功。因此，提高秀麗四照花組培根系誘導率以及最適宜的轉接復壯時間篩選，是下一步試驗突破方向。

3.2 結論

秀麗四照花莖段外植體消毒時，以 0.1%HgCl₂ 處理 12min 的效果較好。在莖段誘導培養基選擇中， MS+1.0mg?L^-16-BA+0.2mg?L^-1NAA 中愈傷組織誘導率最高，在培養基 MS+2.0mg?L^-16-BA+ 0.2mg?L^-1NAA 中愈傷組織芽分化的誘導率最高，通過無菌幼葉誘導的芽增殖培養基為 MS+1.0mg?L^-1 NAA+0.5mg?L^-16-BA 最佳。秀麗四照花誘導生根較難， MS+0.5mg?L^-1IBA 的誘導效果最佳，但根部易發生褐化，需要及時轉接培養基促進復壯。在后續試驗中，根據生長素與細胞分裂素間的拮抗作用原理[30，要繼續研究植物激素種類及濃度，提高愈傷組織分化效果，克服培養過程中的褐化問題，并進一步試驗研究不定芽生根率的提高和移栽條件。

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