中國(guó)特有植物吳興鐵線蓮組織培養(yǎng)再生體系的建立

中圖分類號(hào)：S567.23 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006—6500.2025.06.005

Establishment of Tissue CultureandRegenerationSystemof Clematis huchouensis Tamura，an Endemic Plantin China

SHI Jianl，QIU Guoqiang'，WU Yanfen'，WANG Huifeng2，LI Jian2，ZHANG Feng3

（1.DeqngCountyEcologicalForsetryComprehensiveCenter，Huzhou，Zejiang332o，China;2.HangzhouHongsenForstyurey PlaningandDesign CompanyLimited，Hangzhou，Zhejang310o，China;3.ZhejiangForestResourcesMonitoring，Hangzou， Zhejiang 310000， China）

Abstract：Inordertorealizeindustrialproductionandaceleratetheopularizationandapplicationprocess，itisthebstwayto establish the plant tissue culture system of Clematis huchouensis.In this study，two-year old stem segments of clematis from Xing Wu with buds wereusedas explants fortissue cultureandrapid propagation.Theresults showed thatthe mixedtreatmentof 70% （20號(hào) alcohol sterilization for 1O sand 10% sodium hypochlorite sterilization for1O min was the best，with a germination rate of 70.67% and a pollution rate of 17.33% .1/2MS medium is more suitable for start-up culture，and the sprouts grow well，not only robust，but also without yellowing and browning.In the multiplication culture， MS+2mg?L^-16-BA+0.3mg?L^-1 IBA +2 ， L^-1 hydrolyzed casein was the best，and the multiplication coeffcient was 4.73.The best roting culture medium was 1/2 ms+0.5 mg·L ^-1 IBA+0.01 mg·L-1 NAA，and the rooting rate was 79.67% .This study established a complete tissue culture technology system for Clematis huchouensis， breaking itsgegapicalitatios.Itprovidesathoreticalbasisforitspromotionandommecialdvelopent，ndlsoerse tain support for its interdisciplinary cooperation in the later stage.

KeyWords：Clematis huchouensis Tamura; sterilization; tissue culture;culture medium

鐵線蓮屬（ClematisL.）屬于毛茛科（Ranunculaceae）植物，具有較高的觀賞和藥用價(jià)值-2。我國(guó)鐵線蓮屬種質(zhì)資源較豐富，但應(yīng)用于市場(chǎng)的鄉(xiāng)土種類極為少見。國(guó)內(nèi)有關(guān)鐵線蓮屬野生種的研究主要集中在分類和遺傳方面，繁育方面相對(duì)較少[4-8]

吳興鐵線蓮（ClematishuchouensisTamura）主要分布于浙江東北部平原地區(qū)，是中國(guó)特有植物，尚處于野生狀態(tài)。目前，我國(guó)對(duì)吳興鐵線蓮的研究主要集中在分子和藥用方面，尚未見栽培繁育方面的研究[10-12]。其作為區(qū)域特有品種，在鐵線蓮屬的系統(tǒng)進(jìn)化研究中具有一定價(jià)值，潛在新化合物的發(fā)現(xiàn)也可能讓其成為新型藥物或化妝品的原材料。吳興鐵線蓮優(yōu)雅的藤蔓形態(tài)及精致花朵，在江浙地區(qū)可偶見用于庭院綠化、垂直墻面或花架裝飾，說(shuō)明其具有較強(qiáng)的觀賞特性，可作為一種潛在的園林植物進(jìn)行培育。本試驗(yàn)通過(guò)以帶芽莖段吳興鐵線蓮為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，研究不同激素及添加劑對(duì)莖段誘導(dǎo)不定芽及生根的影響，旨在選擇吳興鐵線蓮組培各階段的最佳培養(yǎng)基，建立完整的組培技術(shù)體系，打破其地域限制，為其推廣應(yīng)用及商業(yè)化開發(fā)提供理論基礎(chǔ)，也為其后期的跨學(xué)科合作提供了一定技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料及培養(yǎng)條件

2024年4月，試驗(yàn)選取兩年生吳興鐵線蓮頂端20cm 以內(nèi)部分，截取帶頂芽或腋芽的 1.0～1.5cm 莖段作為試驗(yàn)材料。培養(yǎng)基中蔗糖含量為 2% ，瓊脂含量為 0.55% ，pH值為5.6～5.8。試驗(yàn)培養(yǎng)溫度為 （25±1）^°C 光照強(qiáng)度為 1500～2500lx ，光周期為 12h?d^-1 ，相對(duì)濕度為 60%～80% 。

1.2天菌處理

試驗(yàn)將截取的試驗(yàn)材料用 2% 洗潔精溶液浸泡30min 后振蕩并清洗，用流水沖洗 60～90min ，置于超凈工作臺(tái)；隨后將其移入滅菌瓶中，加入 75% 濃度乙醇溶液振蕩漂洗10～15s，再用無(wú)菌水沖洗3次，用 0.1% 濃度升汞溶液消毒浸泡并定時(shí)振蕩漂洗，設(shè)置時(shí)間梯度，用無(wú)菌水沖洗5～6次，接種到基本培養(yǎng)基。植物材料接種 30d 后，根據(jù)其污染和誘導(dǎo)情況確認(rèn)最適合的滅菌方式。每個(gè)處理接種30個(gè)莖段，各重復(fù)3次。

1.3啟動(dòng)培養(yǎng)

采用MS、1/2MS、B5為基本培養(yǎng)基，添加NAA0.05mg?L^-1?6-BA0.5mg?L^-1 、蔗糖 20g?L^-1 和瓊脂 5.5g?L^-1 ，觀察并統(tǒng)計(jì)42d后的誘導(dǎo)率及芽苗生長(zhǎng)情況，并確定最佳啟動(dòng)培養(yǎng)基。每個(gè)處理接種30個(gè)莖段，各重復(fù)3次。

1.4莖芽增殖培養(yǎng)

本研究采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以MS為基本培養(yǎng)基，添加6-BA、IBA和水解酪蛋白并設(shè)置梯度濃度。誘導(dǎo)處理45d后，統(tǒng)計(jì)腋芽誘導(dǎo)率和芽苗生長(zhǎng)情況，并綜合確定最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每個(gè)處理接種30個(gè)莖段，各重復(fù)5次。

1.5生根培養(yǎng)

試驗(yàn)將不定芽吳興鐵線蓮分別接種到IBA和NAA不同濃度組合的1/2MS培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基接種30個(gè)，每瓶3個(gè)，各重復(fù)3次，并以不加IBA和NAA的空白1/2MS培養(yǎng)基作為對(duì)照（CK），35d時(shí)觀察不定根產(chǎn)生情況，記錄根數(shù)、生根率等數(shù)據(jù)。

1.6煉苗

待 80% 芽苗根系生長(zhǎng)符合要求后，將其從培養(yǎng)室移出，置于常規(guī)室內(nèi)，并將培養(yǎng)瓶口打開一條縫，使其適應(yīng)外部環(huán)境。3d后將苗取出洗凈，種植于已消毒的基質(zhì)中，并進(jìn)行遮陰、保濕處理，2～3周后待新根長(zhǎng)出，即可進(jìn)行容器化栽植。

1.7數(shù)據(jù)處理方法

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，利用SPSS軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1不同濃度酒精和次氯酸鈉組合處理時(shí)間對(duì)吳興鐵線蓮消毒的影響

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， 70% 濃度酒精和 10% 濃度次氯酸鈉不同組合滅菌對(duì)于吳興鐵線蓮的污染率和出芽率均有較大影響。其中，2號(hào)處理的出芽率最高，達(dá)到70.67% ，污染率較低，為 17.33% ，且出芽率極顯著區(qū)別于其他處理。6號(hào)處理的出芽率最低，僅為23.33% ，但其污染率控制得最好，僅為 7.33% 。6個(gè)不同混合處理中， 70% 濃度酒精滅菌時(shí)間較低，出芽率普遍較高， 10% 濃度次氯酸鈉滅菌時(shí)間越久，污染率越低。綜上可知， 70% 濃度酒精滅菌10s和 10% 濃度次氯酸鈉滅菌 10min 混合處理方式最適合吳興鐵線蓮的滅菌。

表1不同組合處理對(duì)吳興鐵線蓮?fù)庵搀w滅菌的影響Tab.1Effects of different combinations of treatmentsonsterilizationofClematishuchouensisexplants

注：同列不同小寫字母表示處理之間差異顯著 （Plt;0.05） 不同大寫字母表示差異極顯著 Plt;0.01 。下同。

2.2不同培養(yǎng)基對(duì)吳興鐵線蓮出芽的影響

采用MS、1/2MS、B5為基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)42d后發(fā)現(xiàn)3種培養(yǎng)基中1/2MS培養(yǎng)基顯著區(qū)別于MS培養(yǎng)基和B5培養(yǎng)基。1/2MS培養(yǎng)基莖段上的芽苗生長(zhǎng)情況良好，不僅健壯，且未出現(xiàn)黃化和褐化的現(xiàn)象，出芽率達(dá)到 57.33% ，部分還生出根系，可考慮作為后期生根培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基。MS培養(yǎng)基上的莖段前期生長(zhǎng)良好，但是后期生長(zhǎng)緩慢且隨著時(shí)間的延續(xù)，部分植株出現(xiàn)生長(zhǎng)停滯現(xiàn)象，出芽率僅為32.67% ，但部分植株愈傷生長(zhǎng)情況良好，可考慮作為后期增殖培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。B5培養(yǎng)基上的莖段出芽率更低，僅為 26.67% ，且大部分生長(zhǎng)緩慢，最后枯黃至死。綜上可知，3種培養(yǎng)基中1/2MS培養(yǎng)基最適合吳興鐵線蓮的啟動(dòng)培養(yǎng)。

表2不同培養(yǎng)基對(duì)吳興鐵線蓮出芽情況的影響

2.36-BA、IBA、水解酪蛋白濃度對(duì)吳興鐵線蓮增殖效果的影響

由表3可知，6-BA及IBA在試驗(yàn)中產(chǎn)生的作用達(dá)到了極顯著水平（ Plt;0.01 ），水解酪蛋白在試驗(yàn)中僅達(dá)到顯著水平（ Plt;0.05 。這說(shuō)明6-BA、IBA、水解酪蛋白3種添加物在試驗(yàn)中產(chǎn)生的作用對(duì)吳興鐵線蓮不定芽增殖過(guò)程均具有重要影響。

表3吳興鐵線蓮增殖系數(shù)方差分析

注：a. R²=0.895 （調(diào)整后 R²=0.863 ）。

如表4所示，不同組合處理對(duì)吳興鐵線蓮不定芽增殖效果均有較大影響。試驗(yàn)結(jié)果顯示，2號(hào)處理的增殖系數(shù)達(dá)到最高，平均為4.73，且生長(zhǎng)情況最佳，增殖芽大小均勻，莖稈粗壯，葉片厚度適中，濃綠色，平展無(wú)皺縮，且與其他處理均存在極顯著差異。1號(hào)處理的增殖率最低，僅為1.93。由此可見，2號(hào)處理最適合吳興鐵線蓮的增殖培養(yǎng)。

表4吳興鐵線蓮增殖情況 Tab.4Proliferation statusofClematishuchouensis

2.4不同濃度NAA、IBA對(duì)吳興鐵線蓮生根情況的影響由表5可知，IBA在試驗(yàn)中產(chǎn)生的作用達(dá)到了極顯著水平（ Plt;0.01 ），NAA在試驗(yàn)中未達(dá)到顯著水平（ 1lt;0.05. 。這說(shuō)明IBA在試驗(yàn)中產(chǎn)生的作用對(duì)吳興鐵線蓮的根系生長(zhǎng)具有重要影響。

表5吳興鐵線蓮生根情況方差分析

注：a. R²=0.903 （調(diào)整后 R²=0.883 ）；b. R²=0.864 （調(diào)整后 R²=0.836 ）

如表6所示，以1/2MS為基本培養(yǎng)基，試驗(yàn)分別添加不同配比的IBA和NAA混合生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，比較不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)吳興鐵線蓮生根的影響。根據(jù)生根率、生根數(shù)、植株生長(zhǎng)狀況進(jìn)行綜合考慮，篩選植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及最優(yōu)配比。由表6可見，添加生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑能有效促進(jìn)吳興鐵線蓮根系生長(zhǎng)的影響，所有各處理的生根情況都明顯優(yōu)于CK。其中，以4號(hào)處理的根系生長(zhǎng)情況最佳，生根率達(dá)到 79.67% ，且根系粗壯，長(zhǎng)短合適，分枝較多，整個(gè)植株生長(zhǎng)健壯，葉片厚而綠，無(wú)發(fā)黃現(xiàn)象，生根率和平均根條數(shù)均極顯著優(yōu)于其他各處理。當(dāng)IBA添加濃度過(guò)高或過(guò)低時(shí)，根系生長(zhǎng)均受到一定影響。濃度過(guò)低時(shí)，根系過(guò)于瘦弱；濃度過(guò)高時(shí)，根系過(guò)于短粗。而NAA有可能對(duì)根系的分枝具有一定影響。當(dāng)添加的NAA濃度為 0.1mg?L^-1 時(shí)，根系的分枝較多，當(dāng)濃度降低時(shí)，則分枝逐漸減少。綜上可知，4號(hào)處理最適合吳興鐵線蓮的生根培養(yǎng)。

表6不同技術(shù)對(duì)吳興鐵線蓮根系生長(zhǎng)的影響

Tab.6Effects ofdifferent technologiesonthe root growth of Clematishuchouensis

2.5煉苗

煉苗的損失通常集中在清洗及栽植過(guò)程中，瓶苗的根系比較脆弱，在清洗過(guò)程中容易造成根系損傷，栽植過(guò)程中，由于人工操作問(wèn)題，容易造成2次損傷。故煉苗的成功率一般保持在 85%～90% ，煉苗成活的幼苗上盆率超過(guò) 95% 。

3討論與結(jié)論

3.1 討論

3.1.1酒精和次氯酸鈉的組合處理時(shí)間是吳興鐵線蓮消毒成功的關(guān)鍵部分鐵線蓮屬植物體表絨毛容易攜帶病菌，增加消毒難度，吳興鐵線蓮也是如此[13]。進(jìn)行外植體消毒時(shí)，宜采用合適的消毒劑及組合，且消毒時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，長(zhǎng)時(shí)間消毒雖可以降低污染率，但會(huì)破壞外植體細(xì)胞，導(dǎo)致枯死率升高[14-1q。本研究采用 70% 濃度酒精和 10% 濃度次氯酸鈉不同處理時(shí)間的組合，研究發(fā)現(xiàn) 70% 濃度酒精滅菌10s和 10% 濃度次氯酸鈉滅菌 10min 混合處理的出芽率最高，達(dá)到 70.67% ，污染率較低，為 17.33% ，由此可見，后期研究中可以對(duì)其組合進(jìn)行微調(diào)，以確保在提高出芽率的同時(shí)降低污染率。

3.1.2基本培養(yǎng)基的選擇是組培成功的基礎(chǔ)本研究選擇MS、1/2MS、B5作為吳興鐵線蓮的基本培養(yǎng)基，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1/2MS培養(yǎng)基不僅使芽苗生長(zhǎng)健壯，部分還生長(zhǎng)出細(xì)根，說(shuō)明其比較適合后期生根處理，這與多數(shù)研究結(jié)果一致[17-9]。MS培養(yǎng)基芽苗長(zhǎng)勢(shì)雖不如1/2MS培養(yǎng)基，但其能提早促進(jìn)腋芽萌發(fā)及愈傷生長(zhǎng)，比較適合后期增殖處理，這與劉衛(wèi)東等2研究結(jié)果一致。

3.1.36-BA、IBA和水解酪蛋白有利于不定芽誘導(dǎo)及增殖對(duì)鐵線蓮屬植物不定芽增殖誘導(dǎo)的研究顯示，6-BA和IBA的不同組合對(duì)不定芽誘導(dǎo)有協(xié)同作用，而水解酪蛋白能有效促進(jìn)不定芽增殖2。在吳興鐵線蓮增殖培養(yǎng)中，以MS為基本培養(yǎng)基，添加2mg^?L^-16-BA，0.3mg^?L^-1IBA 和 2g?L^-1 水解酪蛋白的組合配方誘導(dǎo)的不定芽長(zhǎng)勢(shì)健壯，葉色濃綠，莖稈粗壯，芽體均勻，誘導(dǎo)效果最優(yōu)。

3.1.4IBA主導(dǎo)生根對(duì)比部分鐵線蓮屬植物，單一應(yīng)用IBA就能有效誘導(dǎo)生根22]。NAA能促進(jìn)細(xì)胞分裂與擴(kuò)大，從而誘導(dǎo)不定根[23]。在吳興鐵線蓮的生根培養(yǎng)中，本研究發(fā)現(xiàn)，IBA能有效誘導(dǎo)生根，而NAA對(duì)其生根的影響并不顯著，說(shuō)明在吳興鐵線蓮的生根誘導(dǎo)過(guò)程中，IBA起著主導(dǎo)性作用，NAA的添加僅起促進(jìn)作用。

吳興鐵線蓮作為區(qū)域特有物種，主要分布于我國(guó)浙江省湖州市及周邊地區(qū)，具有其獨(dú)特的價(jià)值及地位。在科研領(lǐng)域，其在鐵線蓮屬的系統(tǒng)進(jìn)化研究中具有一定價(jià)值，在一定程度上揭示出鐵線蓮屬的適應(yīng)性演化機(jī)制，或者成為新藥物或化妝品的原材料。在中醫(yī)藥用領(lǐng)域中，因其地域性未被廣泛使用，但隨著藥理學(xué)研究的深入，可能會(huì)逐步實(shí)現(xiàn)商業(yè)化。在觀賞價(jià)值及應(yīng)用領(lǐng)域，吳興鐵線蓮可作為一種潛在的園林植物，目前其野生種群數(shù)量少，栽培技術(shù)尚未掌握，品種及適應(yīng)性研究不足，暫時(shí)限制了其規(guī)模化生產(chǎn)，若后期能攻克栽培技術(shù)難題，其在園林中的應(yīng)用必將有一席之地。任何研究都需立足于材料本身，而材料本身需依賴于繁殖技術(shù)，故本試驗(yàn)建立的組培技術(shù)體系是吳興鐵線蓮后期研究的基礎(chǔ)。

3.2 結(jié)論

本研究中，吳興鐵線蓮滅菌處理以 70% 濃度酒精滅菌10s和 10% 濃度次氯酸鈉滅菌 10min 混合處理效果最佳，出芽率達(dá)到 70.67% ，污染率為17.33% ;啟動(dòng)培養(yǎng)以1/2MS培養(yǎng)基較適合，芽苗生長(zhǎng)情況良好，不僅健壯且未出現(xiàn)黃化和褐化現(xiàn)象；增殖培養(yǎng)以 MS+2mg^?L^-16-BA+0.3mg^?L^-1IBA+2g^?L^-1 水解酪蛋白最佳，增殖系數(shù)達(dá)到4.73；生根培養(yǎng)以1/2MS+0.5mg?L^-1IBA+0.01mg?L^-1NAA 最佳，生根率達(dá)到 79.67% 。通過(guò)該技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)吳興鐵線蓮的快速繁殖目的，為后期的研究提供材料基礎(chǔ)。

吳興鐵線蓮是中國(guó)特有植物之一，雖具有極高的藥用價(jià)值和觀賞價(jià)值，但其野生種群數(shù)量較少，獲取難度大，且栽培技術(shù)尚未成熟，缺乏市場(chǎng)認(rèn)知，制約了其產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展。本試驗(yàn)通過(guò)建立吳興鐵線蓮?fù)暾慕M培技術(shù)體系，能有效打破其地域限制，在一定程度上完善栽培繁育技術(shù)體系，為其推廣應(yīng)用及商業(yè)化開發(fā)提供理論基礎(chǔ)，也為其后期跨學(xué)科合作，如植物學(xué)、藥學(xué)、園藝學(xué)領(lǐng)域的可持續(xù)合作提供一定支撐。

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