解淀粉芽孢桿菌Y6-7的篩選鑒定及對草莓角斑病的生防效果

關鍵詞：解淀粉芽孢桿菌；草莓細菌性角斑?。环佬В簧锓乐?；穩定性中圖分類號： S436.68⁺4 ;S182 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2025）13-0171-09

草莓角斑?。╝ngularleafspotofstrawberry，簡稱ALS）是由草莓黃單胞菌（Xanthomonasfragariae）引起的細菌性病害，該病害可導致果實產量的嚴重降低以及移植苗圃生產中的植物損失。該病原體首次在1962年美國明尼蘇達州被報道，后來又在美國各州以及歐洲、南美洲、非洲的草莓種植區，澳大利亞和新西蘭幾個地方發生，被歐洲和地中海植物保護組織（EPPO）列為歐洲種植種群的A2國際檢疫病原體[1]。病原體直接導致葉片背面產生角狀水浸狀的病變，在葉片邊緣產生棕黑色的斑點。發病嚴重時從葉子蔓延到莖冠，并導致離散的水漬病斑，從而導致草莓植株活力下降、倒伏和整株死亡[2]，在草莓農業生產中日益成為一個難題。近年來，草莓角斑病在我國不同地區草莓種植基地發生，于2021年在云南省首次發現，并在曲靖市會澤縣四季草莓基地暴發成災，給當地草莓種植者造成重大經濟損失。目前控制細菌性病害主要依賴于預防性應用含銅化合物或抗生素。銅化合物和抗生素硫酸鏈霉素和土霉素可以降低疾病的嚴重性，但并不是所有國家都登記使用銅化合物和抗生素來治療，而且銅化合物的藥效有限，重復使用可能會引起植物毒性。因此，更多的防治策略，特別是控制 X. ，fragariae的無毒手段將是可取的[2-3]。因此，篩選出對 X ：fragariae有拮抗效果的菌株，對開發無毒微生物菌劑有一定的價值。

當前已經報道的防治草莓細菌性角斑病的生防菌株較少，如Miller等首次從自然感染黃單胞菌的\"Festival”草莓植株上分離到黃單胞菌噬菌體RiverRider，能感染7種不同的 X. fragariae菌株，從而殺死 X ：fragariae以達到防治的目的4；Daranas等通過溫室與大田試驗驗證篩選出幾株有廣譜抗菌活性并對 X. ：fragariae有較好拮抗作用的乳桿菌（PM411和TC92）[5]。但目前芽孢桿菌屬細菌防治X.fragariae幾乎未見報道，因此本研究中，筆者所在課題組對采集的健康草莓根際土壤樣品進行細菌分離，通過平板對峙室內篩選對 X. fragariae有顯著拮抗效果的生防細菌菌株，經生理生化和16SrDNA序列分析等鑒定該菌為解淀粉芽孢桿菌，并探究該菌株的溫室防效和防病機制，為開發防治 X. fragariae的微生物菌劑提供依據。

1材料與方法

1.1 供試材料

供試病原菌有草莓角斑病菌（X.fragariae）YM2、柑橘潰瘍病菌（X.citrisubsp.citri）、水稻條斑病菌（ X. oryzaepv.oryzicola）、油菜黑腐病菌（ X. （20campestrispv.campestris）、水稻白葉枯病菌（ X. oryzaepv.oryzae）、大豆細菌性斑疹病菌（ X. （204campestrispv.glycines）、水稻紋枯病菌（Rhizoctoniasolani）草莓炭疽病菌（Colletotrichumsiamense）、藍莓枝枯病菌（Lasiodiplodiapseudotheobromae）、煙草根腐病菌（Fusariumoxysporum）、煙草疫霉病菌（Phytophthoranicotianae）、藍莓灰霉病菌（Botrytiscinerea）。以上菌株均來源于云南農業大學植物保護學院實驗室。

供試培養基有WBN培養基、NA培養基、LB培養基、PDA培養基，用于細菌分離純化以及抑菌譜的篩選;蛋白酶培養基、淀粉酶培養基和纖維素酶培養基用于菌株酶活性測定。

試驗地點：云南省農業大學農業生物多樣性應用技術國家工程研究中心，云南農業大學植物保護學院試驗大棚。

1.2拮抗細菌的分離與篩選

參照起登鳳等的方法[6。采集云南省曲靖市會澤縣草莓基地不同地塊健康草莓根際土壤10份，各稱取 1g 土樣加入 9mL 無菌水的三角瓶中，置于搖床振蕩 20min ，靜置形成懸液后，吸取 100μL 上層液加入到 900μL 無菌水中充分振蕩后即為 10^-2 土壤懸浮液，依次梯度稀釋得到 10^-4，10^-5，10^-6 稀釋懸液，涂布于LB、NA、WBN板， 28^°C 恒溫培養箱培養 ^72h 。挑取顏色、形態及表型不同的單菌落保存于NA凍存管中，放置于 -20^°C 冰箱備用。

平板對崎法[7]：挑取病原菌YM2接入WBN液體培養基培養 ^48h 后，將YM2 菌懸液稀釋到 D_600nm= 0.5后吸取 200μL 于新的WBN培養基中涂布均勻。將上述保存備用的細菌點接在平板上，進行初步篩選。將初篩有作用的細菌接于NB培養基中，培養 24h ，牛津杯放置于涂布有YM2菌懸液的WBN板上，取 200μL 細菌菌懸液加入到牛津杯中，無菌水為對照，重復3次。置于 28^°C 培養箱中培養，觀察記錄抑菌圈直徑，挑選抑菌活性最好的菌株進行后續試驗。

1.3 菌株Y6-7的鑒定

1.3.1菌株Y6-7形態觀察和生理生化測定將菌株于NA培養基上純化后，觀察菌落的形態特征，挑取單菌落進行革蘭氏染色后在光學顯微鏡下觀察。依據常見細菌鑒定手冊中描述的生理生化測試方法，評價Y6-7菌株的耐鹽性、檸檬酸鹽利用、吲哚試驗、氧化酶試驗、接觸酶試驗、甲基紅試驗、V-P測定等生理生化特征。

1.3.2菌株Y6-7分子序列分析使用TIANamp細菌DNA分離試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司]提取分離菌株Y6-7的DNA用于種屬確認。用細菌通用引物對27F和1492R對分離菌株的16SrDNA基因進行PCR擴增。 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物條帶大小，并將產物送往北京擎科生物科技股份有限公司昆明分公司測序。測序后將基因序列進行BLAST比對分析，并利用 Mega 11.0 軟件采取鄰接法構建系統發育樹。

1.4菌株Y6-7生物學測定

1.4.1菌株Y6-7生長特性與環境適應性將篩選得到的Y6-7菌株接種于LB液體培養基培養至D_600nm=1.0 ，以 1% 接種量接種至不同設置條件新的LB液體培養基，保持單因素變量的條件，分別在不同 pH 值、不同溫度條件下 30‰ 進行培養，每隔 ^2h 測定其在 600nm 下的吸光度。以空白LB培養基作為對照，各處理重復3次，觀察菌株生長特性[8]

1.4.2菌株Y6-7抑菌譜測定測定菌株Y6-7對5種黃單胞菌屬植物病原細菌的抑菌直徑，各處理重復3次。用平板對峙法檢測細菌對病原真菌的抑制效果。將直徑為 5mm 的菌餅點接在平板中央， 28^°C 培養1d后，在距菌餅 2.5cm 處的兩側點接Y6-7拮抗菌株，以不接拮抗菌株為對照， 28^°C 培養 5d 。每個處理重復3次。

真菌抑菌率 Σ=Σ （對照菌落直徑－處理菌落直徑）/對照菌落直徑 ×100% 。

1.4.3Y6-7菌株定殖情況檢測菌株Y6-7抗生素篩選：將 100μL 培養至對數生長期的拮抗菌株Y6-7分別均勻涂布在含有頭孢噻吩（cephalothin）、四環素（tetracycline）、卡那霉素（kanamycin）、利福平（rifampicin）、慶大霉素（gentamicin）、氨芐西林霉素（ampicillin）、萬古霉素（vancomycin）的NA抗生素板上，以上抗生素濃度選擇 培養箱培養 ^48h ，觀察菌株Y6-7對抗生素的抗性情況

菌株Y6-7定殖檢測：采用抗生素抗性法檢測拮抗菌株Y6-7在草莓葉片上的定殖能力。在草莓盆栽植株葉片上噴灑拮抗菌株 Y6-7（10⁸CFU/mL） ）懸浮液，以噴灑無菌水為對照，用塑料袋覆蓋。Y6-7菌株種群水平監測如Braun和Hildebrand所述[9]。分別于接種后 0.7、14、21、28d 取樣，每個重復取3張葉片。表面消毒后研磨稀釋涂布于含有氨芐西林霉素 （ 25μg/mL ）的NA平板上，待菌落長出。Y6-7的群體水平以 表示。

1.4.4產酶類型檢測蛋白酶檢測：挑取NA培養基上的單菌落Y6-7點接在蛋白酶鑒定培養基上，30% 恒溫培養 ^48h ，每個處理重復3次，檢查透明圈的有無。

纖維素酶檢測：生防菌Y6-7單菌落點接到纖維素酶鑒定培養基上， 30^qC 恒溫培養 ^48h ，使用碘液染色 3min ，水洗3次，每個處理重復3次，查看是否產生水解圈。

淀粉酶檢測：挑取活化后的生防菌Y6-7單菌落到淀粉酶檢測培養基上，每個處理重復3次，30% 恒溫培養 ^48h ，檢查透明圈的有無。

1.4.5Y6-7無菌發酵液穩定性測定Y6-7菌株接種于NB 液體培養基， 30‰ 過夜培養，以 1% 接種量接種至每瓶 500mL 的NB培養基，30‰ 培養 48h 用于活性物質分析試驗。

熱穩定性檢測：取發酵液于 4‰ 條件下冷凍離心 15min ，收集上清液，經 0.22μm 微孔濾膜過濾。取無菌發酵液 10mL 于試管中熱處理 30min ，溫度條件設置為 40，6080100120% ，以未處理發酵液為對照，處理后的無菌上清液采用平板對峙法測定對病原菌YM2的抑菌活性。

酸堿穩定性測定：Y6-7無菌發酵液初始pH值為5.5，取等體積的無菌發酵液調節溶液 pH 值，pH 值設置為 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 、10.0，靜置處理 ^2h 后，采用平板對崎法測定不同酸堿度處理的上清液對YM2的抑菌活性。

紫外線穩定性測定：將無菌發酵液 10mL 置于紫外燈相距 30cm 處，經 10，20，30，40，50，60min 照射處理，以未處理發酵液為對照，采用平板對崎法測定紫外線照射不同時間后上清液對YM2的抑菌活性。

蛋白酶敏感性測定：取等體積無菌發酵液分別加入蛋白酶K、溶菌酶、酸性蛋白酶，酶最終質量濃度為 10mg/mL，37^°C 溫浴1h，以YM2為指示菌，以未處理發酵液為對照，采用平板對峙法測定不同處理的上清液對YM2的抑菌活性，測定抑菌圈直徑，各處理重復3次[0]

1.5菌株Y6-7無菌發酵液活性物質分離與活性檢測

參照\"1.4.5”節的方法制備Y6-7菌株發酵液，低溫離心后每瓶收集 500mL 上清液備用。

酸沉淀法： 500mL 上清液加入6mol/LHCl，調節 pH 值至2.0，振蕩混勻并于 4°C 靜置過夜， 4% 、12000r/min 離心 10min 收集沉淀，自然風干，加入適量分析純甲醇抽提沉淀，總抽提液用濾紙過濾雜質，加入 2mol/LNaOH 調節pH值至7.0，蒸發濃縮后加入甲醇溶解，冷凍干燥得到脂肽類粗提物。溶于磷酸緩沖液，微生物膜過濾后進行抑菌試驗（磷酸緩沖液作為對照）。

硫酸銨沉淀法：上清液加人分析純硫酸銨達30% 的溶解度， 4‰ 靜置沉淀，低溫下 12 000r/min 離心 10min ，收集沉淀后風干，分析純甲醇充分溶解沉淀，濾紙過濾后旋蒸，濃縮后甲醇溶解，得到抑菌蛋白類粗提物（甲醇溶液作為對照）。

乙酸乙酯萃取法： 500mL 的上清液與分析純乙酸乙酯等體積裝入分液漏斗，振蕩混勻后靜置分層，收集上層有機相，將水相用等體積的乙酸乙酯萃取至無色，合并有機相萃取液后加入約 20g 無水硫酸鈉，過濾后得到去除水分的有機相，旋轉蒸發儀旋蒸濃縮得到粗提物。粗提物加入甲醇溶解后使用 0.22μm 無菌濾膜過濾后進行抑菌試驗（甲醇溶液作為對照）。

大孔樹脂吸附法： 500mL 上清液中加入大孔樹脂顆粒 20g ，恒溫振蕩吸附 24h 后，用 ddH₂0 清洗樹脂顆粒2遍，過4層紗布并自然風干樹脂顆粒，然后加入 50mL 甲醇，于恒溫振蕩器中解吸附 濾出甲醇，再次用 50mL 甲醇重復解吸附2次，合并解吸附后的甲醇溶液進行旋蒸濃縮，甲醇溶解后使用0.22μm 無菌濾膜過濾后進行抑菌試驗（甲醇溶液作為對照）。

1.6生防菌Y6-7產脂肽類和聚酮類化合物基因 檢測

以菌株Y6-7DNA為模板，對fenA、bmyA、bacA、dhbA、srfAA、beaS、dfnA、ituC8脂肽類和聚酮類合成相關基因進行PCR擴增，檢測菌株Y6-7產生脂肽類抗生素和聚酮類抗生素的能力，PCR檢測程序和體系參照桑建偉等文獻所述[1]

1.7菌株Y6-7室內盆栽防治效果

2022年9月，于云南農業大學植保學院試驗大棚進行溫室試驗。將純化后的拮抗菌株Y6-7和靶標菌YM2單菌落轉接到液體培養基中，將菌懸液濃度調至 10⁸ CFU/mL備用。使用手動噴霧器將拮抗細菌菌懸液噴灑至徑流，噴灑3次，將盆栽草莓放置于溫室塑料大棚以達到高溫高濕條件。接種完拮抗細菌 24h 后，病原細菌的水懸浮液均勻噴灑在草莓嫩葉背面直到徑流，屏蔽其他植物組織。每個處理接種5株，重復3次，以 70% 丙森鋅可濕性粉劑（WP）為藥劑對照，清水對照只接病原細菌不接拮抗細菌。清水對照充分發病后計算病情指數與防治效果。草莓細菌性角斑?。喊唇前卟“咚既~片面積進行分級（表1）。

病情指數 τ=100×Σ （各級病葉數 × 各級代表值）/（調查總葉數 × 最高級代表值）；防效效果 Σ=Σ （對照病情指數-處理病情指數）/對照病情指數 × 100% 。

表1草莓細菌性角斑病分類標準

1.8 數據分析

采用IBMSPSSStatistics27對試驗數據進行分析，利用Prism1進行繪圖。

2 結果與分析

2.1草莓角斑病菌拮抗細菌篩選

采用稀釋涂布平板法從種植草莓的根際土壤中進行細菌分離，獲得96株細菌。采用平板對峙和牛津杯法經初篩、復篩，獲得4株對草莓角斑病菌YM2有較強拮抗作用的菌株（圖1），其中生防菌株Y6-7抑菌圈為（ 30.40±0.30 ） mm ，抑菌效果最好，用于后續試驗。

圖1生防菌對草莓角斑病菌YM2的拮抗作用

2.2 菌株Y6-7的鑒定

2.2.1菌株的形態學鑒定拮抗菌株Y6-7在NA培養基上 37^°C 培養 ^48h 后菌落形態生長良好，單菌落呈乳白色、邊緣不規則且有褶皺，不透明，菌落黏稠（圖2-a）；在光學顯微鏡下觀察菌株呈桿狀，革蘭氏染色為陽性（圖2-b）。

圖2菌株Y6-7在NA培養基上的菌形態（a）和顯微鏡形態（b）

2.2.2生理生化指標檢測根據《伯杰氏細菌鑒定手冊》芽孢桿菌屬細菌生理生化特性，進一步測定菌株Y6-7生理生化指標，測定結果如表2所示。革蘭氏染色為陽性，接觸酶試驗為陽性，V-P試驗陽性，硝酸鹽還原試驗為陽性；在NaCl濃度為1%～7% 均可生長。Y6-7菌株的各項生理生化指標與芽孢桿菌屬的生化代謝特征部分一致。但甲基紅試驗呈陽性，說明葡萄糖分解成了丙酮酸并進一步產生某種有機酸。

2.2.3菌株Y6-7的分子生物學鑒定提取菌株Y6-7基因組總DNA后，以此為模板對16SrDNA片段進行擴增，并將該菌株的基因序列進行BLAST分析比對。分析結果如圖3所示，菌株Y6-7的16SrDNA基因片段全長為 1012bp ，提交到GenBank數據庫，獲得登錄號0Q672530，發現與Y6-7同源性較高的菌株均屬于芽孢桿菌屬，菌株Y6-7的16SrDNA序列與解淀粉芽孢桿菌BacillusamyloliquefaciensFJWHG14聚在同一個分支，與其相似性達到 99.90% 。結合形態學觀察、生理生化測定、分子生物學鑒定結果，最終將Y6-7鑒定為解淀粉芽孢桿菌。

表2菌株Y6-7的生理生化特性

注： + 表示陽性；-表示陰性。

2.3菌株Y6-7的生物學測定

2.3.1菌株Y6-7生長特性和環境適應性鹽濃度生長曲線結果顯示，菌株Y6-7的生長與鹽濃度生長成負相關，菌株適合生長鹽濃度為 1% ，鹽濃度達 10% 時菌株不耐受。由適生 pH 值生長曲線可知，菌株在 pH 值為 5.0～8.0 條件下能正常生長，且最適生長 ΔpH 值為6.0，強堿性環境 pH 值為10.0條件下菌株生長受到抑制，總體適合生長的環境偏酸性。溫度對生防菌影響的生長曲線顯示，菌株在20% 時生長緩慢，菌株在 2h 之后進入對數增長期，^12h 進入穩定增長期，且 30^qC 菌株生長量最高，表明 30% 是其最適生長溫度（圖4）。

2.3.2菌株Y6-7的抑菌譜測定抑菌譜測定結果表明，菌株Y6-7對黃單胞菌屬的5種常見的細菌性病害和6種真菌性病害具有不同程度的抑制作用。其中Y6-7菌株抑制水稻條斑病菌的作用最強，抑菌圈直徑為 22.75mm ，對其他4種細菌病原也有良好的抑制能力，抑菌圈范圍為 10.73～14.75mm （表3）。Y6-7菌株對真菌性病害也具有良好的抑制效果，對6種真菌性病害其抑菌率范圍在52.33%～72.87% ，其中對立枯絲核菌和煙草疫霉菌的抑菌率可達 70% 以上，對灰葡萄孢的抑制作用最弱，抑菌率為 52.33% （表4）。

表3菌株Y6-7對病原細菌的拮抗作用測定

注：表中數據為平均數 ± 標準差，同列數據后不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著，下表同。

表4菌株Y6-7對病原真菌的拮抗作用測定

2.3.3 菌株Y6-7在草莓葉片上的定殖檢測通過抗生素篩選結果可知，Y6-7菌株只在有氨芐西林霉素的平板上生長。采用噴霧法噴灑Y6-7（ 10⁸CFU/mL ）懸浮液于葉片上，選用終濃度為25μg/mL 的氨芐西林霉素測定菌株Y6-7在草莓葉片上的定殖能力。監測溫室條件下菌株Y6-7在草莓葉片上的存活率。結果顯示，接種后的 7～ 14d，種群水平下降了約100倍，接種后28d菌株的存活率穩定在 10⁵CFU/g （圖5）。

圖5解淀粉芽孢桿菌Y6-7在草莓葉片上的定殖情況

2.3.4菌株Y6-7水解酶活性檢測由圖6可知，菌株Y6-7在蛋白酶培養基、淀粉酶培養基、纖維素酶培養基上都能產生清晰的降解圈，表示菌株Y6-7能產生蛋白酶、淀粉酶及纖維素酶。

a一蛋白酶檢測；b—淀粉酶檢測；c—纖維素酶檢測

圖6菌株Y6-7產酶種類鑒定

2.3.5Y6-7無菌發酵液穩定性測定菌株Y6-7發酵液最初 pH 值為5.5，調節無菌發酵液 pH 值，測定Y6-7無菌發酵液對YM2的抑菌活性。由圖7-A可知， pH 值調為5.0時，抑菌活性最強，抑菌直徑高達 22.55mm ，但pH值為10.0時其抑菌成分開始失活；菌株在 pH 值為2.0時仍有 11.25mm 的抑菌直徑，說明菌株抑菌活性成分耐酸不耐強堿。由圖7-B可知，菌株Y6-7無菌發酵液在不同溫度梯度處理下對草莓角斑病菌仍具有較強的拮抗作用，抑菌活性隨著溫度的升高而下降，經過 120^°C 處理 30min 仍具有 20.00mm 的抑菌直徑，說明發酵液中的抑菌物質具有較好的熱穩定性。由圖7-C可知，紫外線照射不同時間后，菌株的發酵液抑菌活性與未處理對照相比其分泌的拮抗成分基本穩定。照射 10min 后抑菌直徑有所下降，但無顯著差異，表明菌株Y6-7具有較好的紫外線照射穩定性。由圖7-D可知，無菌發酵液中加入不同的蛋白酶處理 1～2h 后，加入溶菌酶和蛋白酶K與對照相比抑菌圈直徑顯著減小，溶菌酶和蛋白酶K對菌株Y6-7發酵液有顯著的分解作用，酸性蛋白酶對拮抗菌株無菌發酵液抑菌活性影響較小，由酶影響結果來看，Y6-7所產抑菌物質為肽類物質和蛋白類的細菌素物質。

圖7菌株Y6-7無菌發酵液穩定性測定

2.4Y6-7菌株產脂肽類和聚酮類活性化合物相關基因及其抑菌測定

基因檢測：以生防細菌Y6-7基因組DNA為模板，獲得8條單一條帶（圖8），分子量相符，可以擴增到fengycin、bacillomycinD、iturin、surfactin、bacilysin、bacillaene、difficidin、bacillibactin對應的合成基因，表明菌株Y6-7具有合成上述8種脂肽類抗生素和聚酮類抗生素的基因片段。說明菌株Y6-7發酵液中可能含有相關物質。

圖8菌株Y6-7抗生素合成基因PCR擴增檢測結果

4種方法提取粗提物的抑菌活性及產率：4種方法提取的Y6-7粗提物對草莓黃單胞菌YM2均有較好的抑制效果，且對照組對草莓黃單胞菌沒有作用（表5）。大孔樹脂吸附法得到的粗提物抑菌圈直徑和產量最高，與其他方法具有顯著差異，抑菌圈直徑為（ （36.57±0.47 ） mm ，而乙酸乙酯萃取得到的粗提物抑菌活性最低，酸沉淀法得到的粗提物產量最低。

表54種方法粗提物的抑菌活性及產率

2.5溫室盆栽評價菌株Y6-7對草莓角斑病的防治效果

使用蒙特瑞草莓品種評價解淀粉芽孢桿菌Y6-7對草莓角斑病YM2的抑制作用，接種7d后對照組草莓葉片出現明顯水漬狀病斑，通過病斑面積計算病情指數。調查結果（表6）顯示，對照發病率為 100% ，病情指數為 40.00，70% 丙森鋅800倍稀釋液處理組病情指數為16.67，解淀粉芽孢桿菌Y6-7處理組的病情指數為7.94，比對照組和 70% 丙森鋅800倍稀釋液處理組病情指數低。菌株Y6-7和 70% 丙森鋅800倍稀釋液對草莓角斑病的防效達 80.16% 和 67.06% ，表明菌株Y6-7對草莓角斑病具有較好的防治效果。

表6菌株Y6-7對草莓角斑病的防治效果

3討論與結論

由草莓黃單胞菌引起的草莓角斑病是嚴重影響草莓果實產量和品質的重要病害之一，控制該病主要依賴于預防性應用含銅化合物或抗生素的殺菌劑。然而，植物毒性和抗性病原體是這種做法的主要缺點[12]。目前生物防治是植物病害防治的發展趨勢，繼續尋求與靶病原體共享相同生境的細菌或真菌生物防治劑（BCAs）菌株愈發重要[13]。在草莓上，屬于細菌種的BCAs，如枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌，已經在葉面施用中測試了對草莓病原體的拮抗作用，包括B.cinerea和Sphaerothecamacularis[14-15]。Mishra 等研究記載了BCAs 對草莓以外作物上的葉面病原體（黃單胞菌屬）的功效[16-18]。到目前為止并不知道有任何研究評估了與草莓角斑病有關的BCAs或BCAs衍生產品。在本次試驗中，筆者所在課題組報告了從草莓健康根際土中分離出具有拮抗活性的細菌分離物（解淀粉芽孢桿菌）對角斑病可能具有BCAs潛力。

芽孢桿菌代謝物中重要的抑菌活性物質是抑菌蛋白和抑菌多肽，桑建偉等研究表明，解淀粉芽孢桿菌BEB17能產生脂肽類物質和聚酮類物質的抑菌成分[1]。Chen 等研究表明，解淀粉芽孢桿菌抗菌成分結構主要由iturin、fengycin和surfactin脂肽組成[19]。主要的環狀脂肽是由芽孢桿菌菌株通過非核糖體肽合成酶產生的，破壞生物膜的完整性等拮抗病原菌，脂肽對植物具有延緩萎蔫癥狀發展、減輕萎蔫嚴重程度的作用，能干擾微生物生態群落的建立和存活，因此可作為植物病害的有效生物防治劑[20-21]。本研究檢測到菌株Y6-7有聚酮類和脂肽類合成基因，具有合成8種脂肽類抗生素和聚酮類抗生素的基因片段。且解淀粉芽孢桿菌Y6-7無菌發酵液的抑菌活性物質具有良好的熱穩定性和紫外線穩定性，耐酸堿、對溶菌酶和蛋白酶K敏感。由于細菌素的氨基酸組成特征不同，造成細菌素對蛋白酶的敏感性不同。4種方法提取的粗提物對草莓黃單胞菌YM2均有較好的抑制效果，其中大孔樹脂粗提物拮抗效果和產量最高，通過上述研究結果和對相關基因檢測得出菌株Y6-7發酵液的抑菌成分可能存在蛋白類物質、聚酮類物質和脂肽類物質。要明確解淀粉芽孢桿菌Y6-7對草莓角斑病菌主要的抑菌活性物質還需進一步通過薄層層析和高效液相色譜等方法研究探索。

開發高效的微生物接種劑是當前研究的重要鄰域，但一旦應用于該領域，這些接種劑通常缺乏一致性。其中一個主要原因是引入的微生物無法有效地在植物器官中定殖，也無法與天然菌群協作，而植物原生菌群組成相對穩定，受環境因素影響較小，植物菌群也影響果實品質和香氣[22]。因此，可以從寄主植物土著菌群中選擇促生微生物進行單接種或混合接種，以克服促生微生物的不可靠性，提高在植物上的定殖力和持久性[23」。楊洪鳳等利用抗生素平板，檢測解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）CCo9在小麥根部的定殖情況，發現在小麥根內、根表和根際菌株CC09均能定殖，對麥苗赤霉室內防效高達 90.7%^[24] ;黎起秦等將內生解淀粉芽孢桿菌B47通過針刺和灌根法接種到番茄植株中，B47不僅可以在植株的根中定殖而且可以從根部傳導到莖中，且表現為先增加后下降的趨勢，2種接種方法都能防治番茄青枯病[25]；劉爽等從小粒野生稻根部分離1株解淀粉芽孢桿菌OMR1-7在擬石蓮屬多肉植物的根和莖部可大量定殖，有效阻正從根部侵入的土傳性黑腐病菌F.oxysporum，阻斷病菌向維管束蔓延[26]。本研究中分離自健康草莓根際土中的解淀粉芽孢桿菌Y6-7通過抗生素標記法于葉片噴施，可在草莓葉片內定殖，定殖數量呈現先增加后下降的趨勢，說明菌株Y6-7可通過定殖作用進人草莓組織內部，可能誘導草莓植株對細菌性角斑病產生系統抗性，從而達到防治病害的作用。

本研究以草莓角斑病YM2為靶標菌從健康草莓根際土壤中分離出1株解淀粉芽孢桿菌Y6-7，其菌體和發酵液均可有效抑制草莓角斑病的生長，菌株抑菌譜廣，其最適生長溫度為 30^°C ，具有高的鹽耐受性和耐酸堿性；抑菌活性物質具有良好的熱穩定性和紫外線穩定性，耐酸堿，對溶菌酶和蛋白酶K敏感；4種粗提物活性物質對草莓角斑病YM2具有顯著抑制作用。在溫室試驗中其相對防效達到 80.16% ，上述研究證明菌株Y6-7在植物病害防治中有一定的應用潛力。接下來，深入探索菌株Y6-7的穩定性和抑菌機制，為生防菌劑的產品開發和利用奠定基礎。

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