番茄SIWRKY25基因克隆及表達特性分析

中圖分類號：S641.201 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2025）13-0040-07

番茄（Solanumlycopersium）為茄科茄屬一年生或多年生草本植物[]。它因酸甜適中的口感、豐富的營養成分以及顯著的經濟價值，贏得了廣大消費者的一致好評，被種植戶的廣泛栽培。番茄生產過程中，低溫、干旱、鹽堿等逆境因子對其產生影響，已成為制約我國番茄優質高產的重要因素。植物為應對逆境，在其生長發育中形成了一套應對逆境的應答機制，即將轉錄因子與環境信號、基因調控整合，形成相應的蛋白質及代謝物來應對逆境，增強植株的抗逆性[2]

WRKY轉錄因子廣泛存在于植物中，1994年首次在甜薯中被發現[3]，目前已在其他物種中也已鑒定到多個，例如，擬南芥74個、水稻103個、馬鈴薯79 個、大豆182個[4-7]。WRKY 結構域由 60 個高度保守的氨基酸組成，在N末端含有高度保守的WRKYGQK七肽序列，在C末端包含 C₂H₂ 或 C₂HC 鋅指基序[8-9]。然而，研究表明在某些WRKY蛋白中WRRY、WSKY、WKRY、WVKY或WKKY基序可替代高度保守的WRKY序列[10]。WRKY蛋白可依據結構域數量和鋅指結構特征劃分為3類：第I類是含有1個鋅指結構為 CX_4-5CX_22-23HX，H 的WRKY結構域;第Ⅱ類含有2個WRKY結構域，鋅指結構在第I類的基礎上又可根據氨基酸序列進一步分為5個亞類 （II-a，II-b，II-c，II-d， Ⅱ-e）;第Ⅲ類是含有1個鋅指結構為 CX₇CX₂₃ HX，C 的 WRKY 結構域[1]

轉錄因子通過與下游靶基因啟動子結合調控靶基因的表達，進而參與植物對不良環境的應答[12]。研究發現，AtWRKYI會影響擬南芥對氮（N）的吸收和同化[13]；過表達VqWRKY56可顯著提高葡萄對白粉病的抗性[14]；AtWRKY23參與生長素誘導的愈傷組織根系的形成[15]；GmWRKY16可增強擬南芥對干旱和鹽脅迫的耐受性[16]。由此可見，WRKY轉錄因子在植物生長、發育、代謝和脅迫響應中發揮了重要作用。Huang等發現，番茄WRKY基因家族有81個成員[17]。近幾年，相繼從番茄中克隆得到多個SIWRKY基因，包括SIWRKY8、SIWRKY23、SIWRKY50和SIWRKY75等[18-21]。這些研究均證明WRKY轉錄因子在番茄應對低溫、干旱、鹽脅迫以及病害等生物和非生物脅迫中至關重要。但是，目前關于番茄SWRKY25基因功能的研究尚未見報道。

本研究通過克隆番茄SIWRKY25基因cDNA全長序列，對其進行生物信息學分析，并探明SIWRKY25在低溫、干旱、鹽脅迫及植物激素（ABA和MeJA）處理下的表達模式，旨在闡明SIWRKY25基因在植物應對外界環境變化中的作用，為深入研究番茄WRKY轉錄因子的功能提供理論依據。

1材料與方法

1.1 材料及處理

本試驗于2023年9—12月在河南農業大學園藝學院設施蔬菜栽培實驗室進行，研究材料為番茄品種AilsaCraig。選用顆粒飽滿的番茄種子進行培養，培養箱環境條件設置為：光照度 30 000lx ，光照一黑暗 16h-8h ，晝/夜溫度 28^°C/18^°C ，相對濕度 70% 。待番茄幼苗第3張真葉展開后開始處理。非生物脅迫處理：低溫脅迫 （4‰ ）、干旱脅迫（以15% PEG6000溶液模擬）和鹽脅迫（用100mmol/LNaCl溶液澆灌根部）。植物激素處理：分別用 100μmol/L 脫落酸（ABA） .100μmol/L 茉莉酸甲酯（MeJA）進行葉面噴施。每個處理重復3次。分別于處理0（對照） ，6，12，24h 時取樣，液氮速凍后 -80^°C 保存。

1.2總RNA的提取和cDNA的合成

根據基因登錄號（Solyc10g011910）從茄科基因組數據庫（https：//solgenomics.sgn.cornell.edu/）獲取番茄SlWRKY25基因序列，使用PrimerPremier5.0設計引物 （SlWRKY25-F：5^′ -ATGGAAGAAGATTGGGTCT- 3^′ ;SIWRKY25-R：5'-GTAGTAGAGCAATCAACGACCG- 3^′ ）。采用Trizol法提取葉片總RNA，使用cDNA反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。

1.3番茄SIWRKY25基因的克隆

以番茄cDNA為模板，對SIWRKY25基因進行PCR擴增，通過DNA片段純化試劑盒對PCR產物進行純化。將目的片段的純化產物與pMDTM18-T載體連接，轉入 DH5α 感受態細胞，在 37^°C 培養箱中倒置培養約 12h 。挑取單克隆菌落，通過菌落PCR進行驗證。選擇5個大小符合要求的目的片段單克隆進行測序，保存測序結果正確的菌液。

1.4 生物信息學分析

從茄科基因組數據庫中下載SIWRKY25的氨基酸序列，采用NCBI的Batch CD-search（https：//www.ncbi. nlm. nih. gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）進行蛋白結構域預測。使用在線網站ExpasyProtParam（https：//web.expasy. org/protparam/）對SIWRKY25基因編碼蛋白進行分析，利用ExpasyProtScale（https：//web.expasy. org/protscale/）預測蛋白親疏水性;用NetPhos-3.1（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/）預測磷酸化位點，DNAMAN6.0進行多重序列比對；選用MEGA6.0鄰接法（neighbor-joining，NJ）構建系統進化樹，其中bootstrap 值設置為1O00 次；使用SOPMA（https：//npsa.lyon. inserm. fr/cgi -bin/npsa_automat. pl？ page τ=τ /NPSA/npsa_sopma.html）分析蛋白質二級結構;使用SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）分析蛋白質三級結構;通過TMHMM2.0完成蛋白質的跨膜區預測；使用在線網站 Plant CARE（https：//bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析SlWRKY25基因起始密碼子前 2000bp 區域順勢作用元件。

1.5實時熒光定量PCR檢測

利用PrimerPremier5.0設計SlWRKY25基因的特異性引物（ -SlWRKY25-F：5^′-AGCTGAGCAC AACCATCCAA -3^′ ;Q-SIWRKY25-R：5'-TTGTCACCGGCGAAGATACC-3'。使用CFX96TMReal-TimePCRSystem熒光定量PCR儀，以番茄 β-Actin 為內參基因 （β-Actin-F;5^′ -TTGCTGACCGTATGAGCAAG- 3^′ ;β-Actin-R：5' -GGACAATGGATGGACCAGAC-3^′ ），檢測番茄SIWRKY25基因在低溫、干旱、鹽脅迫及植物激素（ABA、MeJA）處理下的相對表達量。具體參照 qPCR Master Mix試劑盒的說明書。采用 法計算目的基因的相對表達量。

1.6 統計分析

使用Excel2019整理數據并作圖，IBMSPSS25.0軟件對數據進行方差分析，差異顯著性利用Duncan's新復極差法進行檢驗（ α=0.05 ）。

2 結果與分析

2.1 SIWRKY25基因的克隆結果

以番茄葉片cDNA為模板對SIWRKY25基因CDS全長進行PCR擴增，擴增所得條帶長度約 1 000bp （圖1）。測序結果顯示，該片段全長 936bp ，編碼311個氨基酸殘基。保守結構域分析（圖2）發現，該基因編碼的氨基酸序列第 141～197 個氨基酸為WRKY結構域。

M—DL5000DNAmarker；1—SIWRKY25基因PCR擴增產物

圖1S/WRKY25基因的RT-PCR擴增

2.2 SIWRKY25蛋白理化性質及親疏水性預測結果

ProtParam分析結果顯示，SIWRKY25蛋白質分子式為 C₁₄₉₉H₂₃₃₂N₄₃₀O₅₀₁S₁₂ ，由 311個氨基酸組成，相對分子量為 34778.31u， 理論等電點（PI）為5.09、帶負電荷的殘基總和[天冬氨酸（Asp） + 谷氨酸（Glu）]為45、帶正電荷的殘基總和[精氨酸（Arg） + 賴氨酸（Lys）]為34;蛋白質不穩定指數為53.91，屬于不穩定蛋白質；脂肪族指數為57.07，親水指數為-0.85，表明該蛋白質為親水性蛋白質。蛋白質磷酸化位點38個，其中絲氨酸位點23個、蘇氨酸位點13個、酪氨酸位點2個（圖3）。TMHMM預測結果（圖4）顯示，SIWRKY25蛋白質不含跨膜區域。使用ProtScale軟件預測SIWRKY25蛋白質的氨基酸親疏水性（圖5），發現SIWRKY25蛋白質的親水性在整個肽鏈中呈不均勻分布，大多數氨基酸位于0以下的位置，表明SIWRKY25具有很強的親水性，與理化性質預測的結果一致。

圖3SIWRKY25蛋白質磷酸位點預測結果

圖2SIWRKY25蛋白質保守結構域預測

圖4SIWRKY25蛋白質跨膜區預測結果

圖5SIWRKY25蛋白質的疏水性分析結果

2.3SIWRKY25蛋白質二、三級結構預測結果

蛋白質二級結構預測結果顯示，SIWRKY25蛋白質主要包括 α- 螺旋、延伸鏈、β-轉角、無規則卷曲4種結構類型。由圖6可知，無規則卷曲占比最大 （69.13% ），其次為 ∝- 螺旋（ 17.68% ）延伸鏈（ 9% ），β-轉角占比最少 （4.18% ）。SIWRKY25蛋白質三級結構中也以無規卷曲為主，與二級結構的預測結果相符（圖7）。

序列與SIWRKY25的氨基酸序列同源性較高。其中與潘那利番茄相似性最高，說明SIWRKY25與潘那利番茄（XP_015089611.1）在進化上親緣關系最近。利用DNAMAN將番茄SIWRKY25的氨基酸序列與這12個物種的進行多重比對，結果（圖8）表明，這些WRKY在其N末端都含有保守的氨基酸序列WRKYGQK，并在保守域末端含有 C₂H₂ 鋅指結構，屬于第Ⅱ類WRKY家族。使用MEGA構建系統進化樹（圖9），可以看出SIWRKY25與潘那利番茄（XP_015089611.1）在一個分支上，再次證明兩者親緣關系最近。

2.4SIWRKY25多序列比對及系統發育分析

通過NCBI數據庫中的blastp工具查找SIWRKY25的同源氨基酸序列，結果表明，野生種潘那利番茄、馬鈴薯、窄刀薯、多疣茄等物種的氨基酸

2.5SIWRKY25啟動子順式作用元件分析

對SIWRKY25基因起始密碼子前 2 000bp 的序列中順式作用元件進行分析（表1），發現該區域包括主要順式作用元件（如TATA-box、CAAT-box）光響應調控元件（如Box4等）植物激素響應元件[如CGTCA-motif（基序）、TGACG-motif]以及參與生物和非生物脅迫調控相關元件（如厭氧誘導元件ARE等）。由此推測，SIWRKY25基因可能參與調控植物的生長發育過程，以及植物對生物和非生物等脅迫的響應。

表1SIWRKY25順式作用元件預測結果

2.6SLWRKY25基因在非生物脅迫下的表達模式

SIWRKY25在不同處理下的表達模式有所差異（圖10）。SIWRKY25表達量在低溫、ABA和MeJA處理后均有不同程度的上升。在低溫處理下，SIWRKY25表達量在處理6h時達到峰值，為對照的6.19倍。在ABA和MeJA處理下，SIWRKY25表達量均呈先上升后下降的趨勢，其中在ABA處理下，其表達量在處理6h時達到峰值，為對照的1.94倍;在MeJA處理下其表達量在處理 12h 時達到峰值，為對照的2.42倍。SLWRKY25的表達水平在鹽脅迫和干旱脅迫處理下表現為下調。這些結果表明番茄SIWRKY25基因表達受鹽、干旱、低溫脅迫和激素水平的影響，且具有不同的應答模式。

3討論與結論

植物在應對逆境過程中，會通過轉錄因子調控基因的表達，WRKY是植物體內廣泛存在的轉錄因子之一。大量研究表明，WRKY可響應多種環境因子，通過激活或抑制基因轉錄，調節脅迫響應基因和功能蛋白質的表達，提高植株的抗逆性。本研究通過對SIWRKY25的氨基酸序列、蛋白質特性以及非生物脅迫下的表達模式等進行分析，探究SIWRKY25基因在非生物脅迫下番茄幼苗的響應模式。

圖10 S/WRKY25基因在非生物脅迫及外源激素處理下的表達水平

本研究結果表明，SIWRKY25基因片段全長936bp ，編碼含有311個氨基酸的蛋白質。SIWRKY25蛋白質分子式為 C₁₄₉₉H₂₃₃₂N₄₃₀O₅₀₁S₁₂ 相對分子量 34778.31u ，不穩定系數為53.91，PI為5.09，親水指數為-0.85，屬于不穩定親水蛋白質，且無跨膜區。將SIWRKY25與其他物種的WRKY蛋白質進行多重序列比對發現，均含有1個WRKYGQK結構域和1個 CX₅CX₂₃HX₁H（C₂H₂） 型鋅指結構，這表明SIWRKY25屬于 I 型亞家族基因。進化分析發現，SLWRKY25與潘那利番茄（ XP_- 015089611.1）親緣關系最近，表明這2種基因可能具有相似的功能。研究發現，WRKY第Ⅱ類蛋白質是植物在適應逆境脅迫中進化而來的，廣泛參與植物逆境脅迫應答[17，22]。番茄過表達第Ⅱ類蛋白質中的SIWRKY8、SIWRKY23、SIWRKY50等，可顯著提高植株對低溫、干旱和鹽等脅迫的抗性[18-20]。由此推測SIWRKY25可能在抵抗逆境中起重要的調控作用。

基因的轉錄和表達與順式作用元件密切相關。

SIWRKY25基因啟動子中含有大量響應激素和逆境脅迫的順式作用元件，進一步證明其參與激素信號轉導和逆境響應，并受到復雜的調控。RT-PCR分析發現，番茄SIWRKY25在低溫處理 6h 時相對表達量達到高峰，隨后下調，表明該轉錄因子可能正向調控番茄植株對低溫脅迫的耐受性。但本研究中鹽脅迫和干旱脅迫處理下SIWRKY25表達受到抑制，說明其在植物應答鹽脅迫和干旱脅迫中可能起負調控作用。前人研究也發現，不同處理下同一基因的表達模式存在差異，這可能與植物感知及應對外部環境變化的策略不同有關[23-25]。

植物激素可通過激活信號轉導通路調控基因表達，進而參與植物生長發育及應對非生物脅迫等過程[26-28]。本研究中，在 ABA 和 MeJA 處理前期SIWRKY25表達水平上調，表明其能響應ABA和JA信號。此外，植物激素作為逆境脅迫的重要信號物質，脅迫會誘導植物體內激素含量的累積[29]SIWRKY25在低溫和ABA誘導下的相對表達量變化趨勢一致，推測ABA信號途徑可能介導了SIWRKY25響應低溫誘導的過程，但具體機制有待進一步研究。

總之，本研究通過對番茄SIWRKY25進行生物信息學和不同脅迫處理下表達模式的分析，為后期深入探明其生物學功能及響應外界環境的作用機制奠定了基礎。

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