兔輪狀病毒TaqMan探針熒光定量RT-PCR檢測方法的建立和初步應用

中圖分類號：S852.65 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2025）13-0210-05

兔輪狀病毒（Lapinerotavirus，LaRV）主要感染幼齡家兔，引起以嚴重腹瀉為特征的傳染性疫病。兔輪狀病毒病的臨床癥狀包括病兔排出半流質或水樣稀便，肛門周圍及后肢的毛發被糞便污染，迅速脫水和消瘦，多數感染兔在出現下痢癥狀后在3d內死亡[1]。1994 年，中國首次發現并分離出兔輪狀病毒，經形態學、生物學、血清學等多方面鑒定后，確定為A群血清3型輪狀病毒，確立了幼兔輪狀病毒性腹瀉在我國的存在[2]。隨后的調查報告顯示，從2014年至2021年，兔輪狀病毒的感染在全國范圍內普遍存在，不僅在普通兔場常見，在實驗兔場中也常有發生[3-5]。兔輪狀病毒病的廣泛流行對家兔健康造成嚴重威脅，也影響了實驗用兔在生物醫藥領域中的應用。

目前，LaRV實驗室診斷方法主要有電子顯微鏡觀察、病毒分離、逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）和酶聯免疫吸附測定（ELISA）等[6]。其中，電子顯微鏡觀察和病毒分離方法因其高度的可靠性和準確性，被認為是檢出結果最為可信的手段。然而，這2種方法在實際應用中存在一定的局限性。電子顯微鏡觀察需要專門的設備和熟練的操作人員，這不僅增加了成本，而且在大規模樣品檢測中效率較低。此外，樣本中病毒顆粒的結構損傷和數量變化均會對檢測結果產生影響。病毒分離方法，尤其是針對兔輪狀病毒的體外培養，目前主要依賴于CV1（非洲綠猴腎細胞系）和MA-104（恒河猴胚腎細胞系），但病毒的分離成功率通常不超過50% [7]。RT-PCR被廣泛應用于兔輪狀病毒的檢測，但該方法檢測的敏感性較低。ELISA也在兔輪狀病毒的檢測中發揮著重要作用，但是該方法存在耗時長、部分待測樣品具有交叉反應等局限性。

TaqMan熒光定量RT-PCR方法具有特異性強、靈敏度高、重復性和穩定性好等優點，被廣泛用作一種病原檢測技術[8]。LaRV 與其他物種輪狀病毒基因序列同源性較差，這表明其他物種輪狀病毒的分子生物學檢測方法和技術不適用于LaRV，當前尚缺乏快速、準確和靈敏的核酸檢測方法。本研究旨在通過LaRV非結構蛋白5（NSP5）的核酸序列保守區域設計出特異性的引物和探針，建立一種基于熒光定量RT-PCR技術的LaRV檢測方法，以快速、準確地檢測出感染樣本中病毒的存在，為兔輪狀病毒病的流行病學調查提供有利工具和技術。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1 毒株與樣品 兔出血癥病毒1型（rabbithemorrhagic disease virus type1，RHDVI）兔出血癥病毒2型（rabbithemorrhagicdiseasevirustype2，RHDVI）的cDNA及大腸桿菌、兔多殺性巴氏桿菌、肺炎克雷伯桿菌、沙門氏菌DNA由筆者所在實驗室保存。本試驗于2024年5月在江蘇省農業科學院獸醫研究所進行。

1.1.2主要試劑及儀器FastPure @ Cell/TissueTotalRNAlsolationKitV2（RNA提取試劑）AceQqPCRProbeMasterMix（熒光定量所用配套試劑）、SuperMixforqPCR（逆轉錄所用配套試劑）均購自諾唯贊生物有限公司。QuantStudio1實時熒光定量PCR系統（ABI，美國）。

1.1.3引物和探針及標準質粒的構建選擇在LaRV中保守較好的NSP5基因序列，由表1可知，利用軟件PrimerPremier5和PrimerExpress3.0.1對基因序列設計1組特異性熒光定量引物、1組特異性普通PCR引物、探針以及包含完整片段的標準品質粒LaRV-NSP5_pCMV6-entry。本次所使用的引物和TaqMan探針由金斯瑞生物科技股份有限公司合成。引物和探針用DEPC水稀釋至 10μmol/L -20^°C 保存。

表1引物、TaqMan探針

1.2方法

1.2.1標準曲線的建立 20.0μL 反應體系：采用AceQqPCRProbeMasterMix（熒光定量所用配套試劑）， 2×AceQ qPCRProbeMasterMix 10.0μL ，上下游引物（ 10μmol/L 各 0.4μL，ROX0.4μL ，熒光探針 0.2μL ，標準品質粒 2.0μL ，DEPC 水 6.6μL 。優化后的反應條件為 ：95%6min95%10s，60% ^30s，40 個循環。LaRV-NSP5_pCMV6-entry標準品質粒進行10倍倍比稀釋，選取從 1× 10⁷ copies/ μL 至 1×10³ copies/ μL 這5個依次倍比稀釋后的質粒標準品作為模板并對其進行擴增。使用軟件QuantStudioTMDesignamp;Analysis SoftwareBI（ABI，美國）生成標準曲線后進行分析。

1.2.2特異性試驗以兔出血癥病毒1型和兔出血癥病毒2型及大腸桿菌、兔多殺性巴氏桿菌、肺炎克雷伯桿菌、沙門氏菌的核酸為樣本，陰性對照采用DEPC 水，陽性對照采用拷貝數為 1×10⁶ copies/ μL 的LaRV-NSP5_pCMV6-entry，采用上述優化好的體系和反應條件，進行特異性檢測。

1.2.3 敏感性試驗標準品質粒的起始濃度為1×10⁹ copies/ μL ，用DPEC水將其進行10倍倍比稀釋，使用濃度為 至 1× 10^-2 copies/ μL 這11個梯度的質粒作為反應模板分別進行普通PCR擴增和TaqMan探針熒光定量RT-PCR擴增，陰性對照為DPEC水，比較2種擴增方法的靈敏度。

1.2.4重復性試驗采取 1×10⁷，1×10⁶，1×10⁵ 1×10⁴?1×10³ copies/ μL 的質粒為模板進行擴增，每個梯度3個重復，重復3次，分別計算組內及組間CT 平均數以及他們的標準差和變異系數，并將這些數據作為評估其重復性的依據。

1.2.5臨床樣本的檢測將來自四川、河南等地疑似LaRV感染的家兔空腸樣本進行檢測，時間區間為2023年9月至2024年5月，方法為本研究建立的 TaqMan 熒光定量和普通PCR檢測方法，并比較這2種方法的符合率。

2 結果與分析

2.1TaqManqPCR標準曲線的繪制

采用熒光定量配套試劑（AceQqPCRProbe MasterMix），反應體系為 20μL 。將標準品質粒進行擴增，當標準品質粒含量在 1× 10³ ～1×10⁷copies/μL 時，獲取其擴增動力曲線（圖1-A）。其標準曲線斜率為－3.352，截距為15.577， r² 為0.999，擴增效率為 98.781% ，即標準曲線 y=-3.352x+15.577 （圖1-B）。

圖1兔輪狀病毒探針法熒光定量PCR擴增動力學曲線及標準曲線

2.2TaqManqPCR的特異性試驗

以 1×10⁶ copies/ μL 標準質粒作為模板設陽性對照，以DEPC水為陰性對照，對保存的兔出血癥病毒1型、兔出血癥病毒2型逆轉錄后的cDNA，以及兔多殺性巴氏桿菌、肺炎克雷伯桿菌、沙門氏菌、大腸桿菌基因組DNA為模板，對檢測所建立TaqMan熒光定量PCR方法的特異性。由圖2可知，僅標準品LaRV陽性質粒組出現特異性擴增曲線，而其他細菌DNA或病毒cDNA檢測結果均未見擴增。

2.3TaqManqPCR的敏感性試驗

由圖3可知，標準品質粒的起始濃度為1×10⁹ copies/ μL ，用DPEC水將其進行10倍倍比稀釋，使用濃度為 1×10⁸ copies/ μL 至 1×10^-2 copies/ μL 的質粒標準品作為反應模板，以DEPC水作為陰性對照，進行普通PCR擴增和TaqMan探針熒光定量RT-PCR擴增。結果顯示，TaqMan探針熒光定量RT-PCR最低檢測限為 1× 10² copies/ μL ，對應 C_T 值約為32;普通PCR擴增的最低檢測極限為 1×10⁴copies/μL_μ 。該結果表明，所建立的熒光定量檢測方法敏感性較普通PCR高約100倍。

2.4TaqManqPCR的重復性試驗

選取含量為 1×10⁷～1×10³ copies/ μL 5個梯度的質粒為模板進行重復性試驗，每梯度3個重復，重復3次。由表2可知，組內變異系數在 0.15% ～0.56% 之間，組間變異系數在 0.84%～1.41% 之間均 lt;3% ，說明該熒光定量PCR方法重復性良好。

a—LaRV-NSP5_pCMV6-entry 陽性質粒；b—兔出血癥病毒1型；c—兔出血癥病毒2型；d—兔多殺性巴氏桿菌； e—肺炎克雷伯桿菌；f—沙門氏菌；g—大腸桿菌；h—DEPC水

圖2兔輪狀病毒探針法熒光定量特異性試驗

M—marker; 1～11-1×10⁸～1×10^-2 copies/μL；12—陰性對照

圖3TaqMan探針熒光定量RT-PCR和普通PCR敏感性試驗結果

表2兔輪狀病毒探針熒光定量PCR檢測方法的重復性

2.5 臨床樣本的檢測

送檢樣本剖檢后，選取約 _0.1g 小腸組織提取RNA后逆轉錄為cDNA。預處理完畢后用本次試驗設計的檢測方法與常規RT-PCR方法對45份兔小腸樣本進行檢測。由表3可知，本次建立的熒光定量RT-PCR檢測方法檢測出3份陽性樣本，42份陰性樣本，檢出率為 6.7% （3/45），常規RT-PCR方法檢查3份陽性，42份陰性樣本，檢出率為 6.7% （3/45），熒光定量RT-PCR方法與常規RT-PCR檢出率一致。

表3臨床應用

3討論

兔輪狀病毒（LaRV）是一種引起仔兔嚴重腹瀉的腸道病毒，感染途徑為消化道。病兔和隱性感染兔是主要傳染源，家兔通過食人被污染的飼料、飲水或乳汁而感染發病[9]。該病一年四季均可發生，但多發生于冬、春兩季。各品種的家兔均有易感性，且兔群一旦被本病侵入，以后將每年連續發生，很難根除[9]。由于該病具有高發病率和難以根除的特點，對兔養殖業造成嚴重影響[10-11]。近期研究首次發現 G3P^[22] 型RVA毒株在中國家兔中流行。該毒株與我國主要流行的兔輪狀病毒株N5和Rab1404基因含量和基因序列方面有顯著差異。研究結果提示我國兔群中存在多種不同基因型毒株的流行[12]。因此，快速、精準的檢測技術對預防和控制該病毒的傳播至關重要。

分子生物學技術的發展為兔輪狀病毒的檢測提供了多種高效的方法。其中，熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）因其具有高度的敏感度和特異性而成為重要的檢測手段[13]。qRT－PCR 利用熒光探針和熒光信號進行定量，能夠快速、準確地檢測病毒的存在，并提供目標序列的定量信息[14]，能夠用于病毒的早期檢測和疫情監測。除了qRT-PCR外，逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）也被廣泛應用于兔輪狀病毒的檢測，但該方法檢測的敏感性較低[15]。此外，酶聯免疫吸附試驗（ELISA）等免疫學方法也在兔輪狀病毒的檢測中發揮著重要作用，免疫學方法可用于檢測病毒的抗原或抗體，為疫情監測和疫苗研發提供支持[16]。這些技術的應用不僅有助于及時發現和控制兔輪狀病毒病的暴發，還可為疫苗的研發和疾病的治療提供科學依據[17-18]。隨著技術的不斷進步，未來可能會有更多高效、準確的檢測方法被開發出來，進一步提高免輪狀病毒病的防控效率[19]

本研究通過在NCBI數據庫中找到目標NSP5核酸序列，在其保守片段中設計探針和引物以及構建包含完整目標NSP5核酸序列的標準品質粒LaRV-NSP5_pCMV6-entry，建立標準曲線，其線性關系為： y=-3 352x+15.577 ；該方法最低能夠檢出量為 1×10²copies/μL 的模板；僅標準品LaRV陽性質粒組出現特異性擴增曲線，而其他細菌DNA或病毒cDNA檢測結果均未見擴增;組內與組間變異系數均小于 3% 。利用建立的熒光定量PCR檢測樣品中兔輪狀病毒的NSP5表達量，能夠測定低濃度的NSP5，從而判定是否存在兔輪狀病毒感染。

熒光定量PCR相較于普通PCR在靈敏度、特異性、精確性、操作簡便性和高通量檢測能力等方面都具有顯著優勢。這些優勢使得熒光定量PCR在疾病診斷、基因表達分析、病原體載量測定等領域具有廣泛的應用前景。本研究也是基于以上優點建立兔輪狀病毒的檢測方法，為兔輪狀病毒病的診斷和流行病學調查提供了參考。

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