玉木耳線粒體基因組特征及系統發育分析

中圖分類號：S646.603.2 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2025）13-0047-08

木耳屬真菌是世界上廣泛分布的木腐真菌，具有重要的食藥用價值。近年來，隨著習近平總書記“小木耳大產業”的提出，木耳產業發展勢頭迅猛[1]。毛木耳（Auricularia cornea Ehrenb）是木耳屬中分布最廣泛的種，也是世界上種植區域最廣泛的木耳屬食用菌。據中國食用菌協會統計，2022年毛木耳年產量達到223.07萬t，居全國食用菌品種第四[2]。玉木耳是毛木耳的白色變種，新鮮子實體呈白色，口感脆嫩，營養豐富，且具有抗腫瘤等功效，經濟價值較高，極具開發潛質[3-5]。近年來，玉木耳在精準扶貧、鄉村振興等推廣示范中取得顯著成效，在我國國家重大戰略上發揮越來越大的作用。目前關于玉木耳的研究主要集中在栽培、生理活性及成分分析方面，針對其遺傳進化關系的研究還鮮有報道[6-12]

線粒體是真核生物重要的雙膜細胞器之一，包含了許多與細胞功能相關的基因，在信號傳遞、細胞分化凋亡、提供ATP及參與離子平衡等方面發揮著重要作用[13]。相較于核基因組，線粒體擁有獨立的基因組，其優勢在于母體遺傳和快速的進化速率，這使得它在真核生物的研究領域，如物種起源、系統發育、分子進化和群體遺傳等方面，都有著不可或缺的作用[14-15]。真菌線粒體基因組多數為超螺旋共價閉合環狀結構，少數為線狀，包含與電子傳遞和氧化磷酸化過程緊密相關的14個蛋白編碼基因（PCG）：7個NADH脫氫酶基因 （nadI～nad6 、nad4L）、1個細胞色素 b 基因 （cob ）3個細胞色素c氧化酶基因 （coxI～cox3 ）和3個ATP合成酶基因（atp6，atp8，atp9） ;2個核糖體RNA（rRNA）基因以及翻譯過程中不可或缺的轉運RNA（tRNA）基因；某些真菌支系中還存在核糖體蛋白S3基因（rps3）和核糖核酸酶 P 基因 （rnpB）^[16-17] 。目前，已測序并公布的真菌線粒體基因組占所有線粒體基因組的 6.5% 左右，為真菌遺傳和進化研究提供了物質基礎。線粒體基因組通常屬于單親遺傳，基因組內很少發生重組，但基因內內含子的數量和分布是多樣的，且各基因間的排列方式也是可變的[18]。葉麗云等研究發現，肺形側耳內含子和基因區間上的差異序列，可以用于鑒定野生菌株和栽培菌株[9]。因此，闡明真菌線粒體基因組的結構特征及其在屬間的變異，將有助于為真菌的進化、種群遺傳學提供重要的線索。

為了從線粒體基因組水平分析玉木耳的進化關系，本研究通過高通量測序數據，首次組裝獲得玉木耳的完整線粒體基因組，分析玉木耳線粒體基因組的大小、基因組成、重復序列、基因組共線性和系統進化關系，為探明木耳屬真菌的進化和系統發育奠定理論基礎。

1材料與方法

1.1 試驗材料

玉木耳組織于2022年6月收集自吉林省長春市 （43^°49^′9^′′N，125^°25^′11^′′E） ，菌絲組織保存于食藥用菌教育部工程研究中心，標本編號為CCMJ2567（圖1）。

圖1 玉木耳組織

1.2 基因組提取

根據說明書使用HiPure組織和血液DNA試劑盒（Magen）分離總基因組DNA。采用 1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示，電泳條帶清晰單一，無彌散和拖尾現象，說明提取DNA質量較好。其DNA的 D_260nm/D_280nm 為 1.81，D_260nm/D_230nm 為1.26，DNA濃度為 5.14ng/μL ，達到了測序建庫的要求。

1.3線粒體基因拼接組裝和注釋

玉木耳基因組DNA檢測合格后，在南京集思慧遠生物科技有限公司IlluminaNovaSeq6OOO平臺上進行測序，測序讀長為PE150。測序完成后使用fastp（version0.20.0）對原始數據進行質量剪切，獲得cleandata，以FASTQ格式存儲。利用SPAdesv3.10.1 軟件將過濾后的reads進行組裝。使用參考序列黑木耳（Auriculariaheimuer）（NCBI登陸號：NC_059749.1.gbk）進行組裝完成后的質控。使用Mitos2對線粒體序列組裝結果進行基因結構注釋（參數：E-valueExponent =5 ，Maximum Overlap Σ=Σ 100，ncRNA overlap =100 ），將Mitos2注釋結果與近緣物種比較，手動校正后獲取最終的注釋結果。OGDRAW用于構建線粒體基因組圖譜。

1.4序列提交

將玉木耳CCMJ2567線粒體基因組提交到GenBank數據庫，獲得登錄號為OP297929.1。

1.5 線粒體基因組分析

玉木耳線粒體基因組的基因重復序列鑒定使用vmatch v2. 3. 0 軟件，鑒定形式為4種：正向（forward）、回文（palindromic）、反向（reverse）、互補（complement）。使用自行編寫的腳本計算密碼子的偏好性，采用的指標為相對同義密碼子使用度（relative synonymous codon usage，簡稱RSCU）。堿基偏移分析根據 AT-skew=（A-T）/（A+T） 和GC-skew=（G-C）/（G+C） 公式計算。以NCBI數據庫中NC_059749.1（黑木耳Auriculariaheimuer）和NC_O58230.1（歐洲木耳Auriculariaauricula-judae）的線粒體基因組為對照，分析了玉木耳線粒體基因組中蛋白編碼基因的同義突變率 （K_s） 和非同義突變率（ ：K_a ），使用 K_aK_s- Calculator v2.0 軟件計算基因的 K_a/K_s 值。

1.6 系統發育分析

考慮到已測序的木耳屬真菌線粒體基因組序列有限，從NCBIGenBank數據庫中下載24個真菌線粒體基因組序列，包括21個傘菌亞門（多孔菌目3個，牛肝菌目4個，傘菌目11個，木耳目1個，銀耳綱2個）、1個柄銹菌亞門及2個子囊菌門真菌序列，用RAxMLv8.2.10軟件構建最大似然進化樹。

2 結果與分析

2.1玉木耳線粒體基因組基本特征

測序結果（圖2、表1）表明，玉木耳線粒體基因組為典型的環狀DNA結構，全長195026bp，GC含量為 34.65% 。基因注釋結果表明，玉木耳線粒體基因組共包含38個基因，包括14個mRNA、2個核糖體RNA和22個轉運RNA，符合真菌線粒體基因組結構特征。在14個mRNA中，包含3個編碼ATP合成酶復合體FO區的亞基（atp6、atp8和atp9）、2種細胞色素氧化酶（cox1和cox3）、7個電子傳遞鏈復合體I的亞基（nad1-6、nad4L）以及復合體的一個亞基（cob）。此外，2個rRNA基因，即小亞基核糖體RNA（rrnS）和大亞基核糖體RNA（rrnL），大小分別為 1742，791bp 。這些發現為進一步理解玉木耳線粒體基因組的結構和功能奠定了基礎。

圖2 玉木耳線粒體基因組（mitochondrialgenome）結構

表1玉木耳線粒體基因組核酸組成

玉木耳的14個蛋白質編碼基因、核糖體RNA和轉運RNA以及整個線粒體基因組的 ΔA+T 含量為 60.63%～70.93% （表1），均具有較高的 A+T 含量，其中，轉運RNA基因的 ΔA+T 含量最低，為60.63% ，蛋白質編碼基因 A+T 含量最高，為70.93% 。綜上，玉木耳線粒體所有類型基因中，A+T 含量均高于 G+C 含量，與已知真菌線粒體基因組 A+T 含量高的普遍特征相符[20]。此外，AT偏斜（AT-skew）和GC偏斜（GC-skew）范圍在-0.190～0.022 和 0.021～0.148 。玉木耳線粒體基因組38個基因間不存在基因重疊及交聯，基因間隔現象則比較普遍，共存在38處基因間隔區，最長的間隔在nad5和 trnC-GCA 之間。

2.2玉木耳基因組蛋白質編碼基因特征及密碼子使用

玉木耳線粒體基因組14個蛋白編碼基因（PCG）全長 13 932bp ，約占全序列的 7.14% 。在14個PCG中，nad2序列最長，為 2 118bp，atp8 序列最短，僅為 150bp 。這些PCG表現出明顯的 ΔA+T 含量堿基偏向性， ΔA+T 含量為 70.93% 。此外，14個PCG的起始密碼子均遵循ATN模式，與前人研究結果一致。在終止密碼子的選擇上，大多數PCG使用完整的TAA作為終止密碼子，但也有部分基因（如nad3、cox2和nad1）終止密碼子是TAG，cob終止密碼子是TTG。

對玉木耳線粒體全基因組的密碼子使用分析表明（圖3），玉木耳線粒體基因組中共有4644個氨基酸編碼密碼子，RSCU分析得出使用次數最多的密碼子為Leu（TTA）、Met（ATG）、Pro（CCT）、Ser（TCT）、Gly（GGT），這反映了這些氨基酸在玉木耳線粒體中的高使用頻率。此外，可以觀察到A和T在密碼子中的使用頻率非常高（圖3），這是導致玉木耳線粒體基因組 ΔA+T 含量高達 65.35% 的主要原因之一。

圖3各氨基酸在玉木耳線粒體基因組編碼蛋白中使用頻率及密碼子偏好性分析

2.3玉木耳線粒體基因組RNA編碼基因特征及二級結構

玉木耳線粒體基因組包含22個tRNA基因，tRNA基因的總長度為 1646bp ，占線粒體總長的0.84% ， A+T 含量為 60.63% ，tRNA基因長度范圍在 71～87bp 之間，其中 trnY 最長，為 87bp 。大部分tRNA基因集中分布在 rmS 周圍，其余則分布在整個基因組中。利用MITOS工具對玉木耳線粒體基因組的二級結構進行預測（圖4），結果顯示，這22個tRNA均能形成典型的三葉草結構。除正常堿基配對外，發現了39處G-T錯配、1處A-C錯配、2處T-T錯配。這些錯配堿基對分布在tRNA的不同部位，其中1處A-C錯配出現在氨基酸接受臂，1處T-T錯配出現在反密碼子臂，1處T-T錯配出現在額外臂，而39處G-T錯配則在各個臂中均有出現。在功能上，這些tRNA基因編碼20個不同的氨基酸，涵蓋了蛋白質合成所需的基本氨基酸種類，其中亮氨酸和絲氨酸分別由2個具有不同反密碼子的tRNA基因編碼。

2.4線粒體基因重復序列分析

散在重復序列在基因組中呈分散式分布，其在遺傳信息的組織和表達中扮演著特殊的角色。玉木耳線粒體有16117個長重復序列，只包括反向序列和互補序列2種類型（表2）。其中反向序列8813個，互補序列7304個，長度 29bp 以上的散在重復序列中有的只有1種反向重復序列類型。這些結果表明，在玉木耳線粒體的基因組中，長重復序列的存在是相當普遍的。重復序列在真菌線粒體基因組中的積累可能促進重組，因此通常被認為是導致線粒體基因組結構變異的主要因素，包括屬內變異。這些發現為進一步了解玉木耳線粒體的基因組結構、功能以及進化提供了重要的線索。

2.5 K_a/K_s 分析

堿基變異是基因組中常見的現象，它可能導致氨基酸序列的改變，進而影響到蛋白質的功能。非同義突變率（ （K_a） 和同義突變率（ （K_s） 的比值是一個重要的指標，它反映了基因在進化過程中受到的選擇壓力。比值大于1時，說明該基因受到了正選擇效應；而比值小于1時，則說明該基因受到了純化選擇作用。本研究在測定了玉木耳和黑木耳PCG的K_a/K_s 的值后，發現其中1個PCG的 K_a/K_s 值為0，這意味著在這個基因中，沒有發生非同義突變或者同義突變率遠大于非同義突變率，表明這個基因在進化過程中非常保守，幾乎沒有發生有害的變異。除此之外，所有的 K_a/K_s 值都小于1.0，這表明大多數PCG在進化過程中受到了純化選擇作用。

2.6玉木耳線粒體基因組比較分析

通過比較玉木耳和NCBI中公布的2個近緣物種線粒體基因組的共線性關系，發現玉木耳與黑木耳共線性關系更近，發現了8個同源基因簇。同源基因簇的存在表明這2個物種在進化過程中保留了相似的基因結構和組織，這可能是由于它們之間的親緣關系較近，或者它們共享了某些共同的祖先特征。而與Auriculariaauricula-judae共線性基因片段長度和相對位置順序均存在一定差異，發生了基因重排現象（圖5）。在這種情況下，基因重排可能反映了玉木耳和歐洲木耳在進化過程中的不同路徑和適應策略。此外，物種同源區長度與對應物種的線粒體基因組大小呈現正相關關系，同源區長度可能是影響物種線粒體基因組大小差異的主要因素。

表2散在重復序列分析結果統計

圖53個木耳屬真菌線粒體基因組共線性分析

2.7玉木耳線粒體基因組系統進化分析

為研究玉木耳和近緣物種的關系，本研究以21個傘菌亞門（多孔菌目3個，牛肝菌目4個，傘菌目11個，木耳目1個，銀耳綱2個）1個柄銹菌亞門及2個子囊菌門真菌線粒體的24個蛋白質編碼基因核昔酸序列構建了系統發育樹。結果（圖6顯示，玉木耳與黑木耳獨聚為一支，表明二者系統發育關系最近，在進化歷程中，可能具有較近的共同祖先。其次是傘菌目，傘菌目真菌在真菌界中是一個較為龐大的類群，具有廣泛的生態分布和多樣的生活習性，因此與玉木耳的接近關系可能反映了它們在進化上的某種共同特征。綜上所述，通過構建系統發育樹并分析玉木耳與近緣物種的關系，可以得出玉木耳與黑木耳具有較近的親緣關系，這些發現有助于理解玉木耳的進化歷程和生態適應性。

3討論與結論

目前，NCBI數據庫中已公布的木耳屬線粒體基因組數據只有2個物種，即黑木耳（Auriculariaheimuer）和歐洲木耳（Auriculariaauricula-judae）。本研究通過對玉木耳線粒體基因組進行測定與分析，獲得了該物種的完整線粒體基因組，結果已提交到GenBank數據庫，登錄號為OP297929.1，是第3個公開的木耳屬線粒體基因組數據。對其組成特征及系統發育關系進行分析，結果表明，玉木耳線粒體基因組為典型的環狀DNA結構，全長195026bp，GC含量為 34.65% 。基因注釋結果表明，玉木耳線粒體基因組共包含38個基因，其中14個蛋白編碼基因、2個核糖體RNA和22個轉運RNA。基因進化分析結果顯示，大多數PCG的 K_a/K_s 值都小于1.0，這表明玉木耳線粒體基因在進化過程中受到了純化選擇作用。純化選擇有助于消除那些可能導致功能損害的突變，從而保持基因的穩定性和功能的完整性，這與大部分真菌線粒體基因組研究中基因密碼所受到的選擇壓力結果[2I-25]類似。這一發現為理解木耳屬的基因組進化和適應性演化提供了重要的線索。

基因共線性分析結果表明，玉木耳與黑木耳線粒體基因組相似性很高，基因順序也趨于保守，這表明玉木耳與黑木耳具有共同的適應性進化機制。玉木耳與黑木耳之間重排不明顯，只存在基因簇大小方面的差異，說明木耳屬線粒體基因組序列在進化過程中相對保守，線粒體基因組大小差異的主要原因可能由內含子數量、大小及間隔區長度導致。大量研究表明，不同科屬真菌的線粒體基因組在基因含量、基因排列、重復序列和內含子數量上存在較大差異，甚至親緣關系很近的物種之間也有不同[26-27]。玉木耳與歐洲木耳之間分化明顯，變異積累較多，共有特征較少，導致了2個線粒體基因組的共線性較差，基因組差異較大。這可能是由于它們之間的親緣關系較遠，或者它們在不同的環境條件下進化，導致了基因組結構和功能的顯著差異。這種分化可能也反映在它們的生態習性、生長速度和適應性等方面。

總的來說，線粒體基因組比較分析提供了一種有力的工具來探索物種間的進化關系。然而，由于缺乏足夠有代表性的線粒體基因組，需要更多的線粒體基因組測序解析木耳屬真菌的系統發育和進化生物學，本研究為后續進一步對木耳屬物種的分類和系統發育研究提供了數據支撐。

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