草莓根腐病病原鑒定及生防菌篩選

中圖分類號： S436.68⁺4 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2025）13-0163-08

草莓屬于薔薇科（Rosaceae）草莓屬（Fragaria）多年生草本植物，原產自南美洲，是世界上種植最多的小漿果，在全球經濟作物中發揮著非常重要的作用[1]。草莓富含糖類、有機酸（蘋果酸、檸檬酸、水楊酸）、酚類化合物（花青素、黃烷醇或原花青素）和維生素（ C，B₂，B₆，E，P，PP） 等多種營養成分。研究發現食用草莓大有益處，如預防多種疾病，包括癌癥、代謝綜合征、心血管疾病、肥胖、糖尿病以及神經退行性疾病等[2-4]。此外，草莓還具有較強的適應能力，可耐受不同地區的氣候和環境，從地中海到北歐均可種植[5-6] 。

我國從1915年開始引入草莓，到2010年，我國成為世界上最大的草莓生產國，作為全國草莓主產地之一，2020年江蘇省草莓栽培面積達2.04萬 hm^2[7] 。近年來，鎮江市周邊地區草莓種植業發展勢頭強勁，隨著草莓栽培面積的不斷擴大，草莓根腐病也逐年加重，出現死苗爛根現象，嚴重時甚至毀棚。草莓根腐病病原種類繁多、潛伏期長、致病機制復雜、復合侵染多發，因此防治難度大且時間長[8]?，F有技術中草莓根腐病的防治仍以化學藥劑防治為主，隨著國家大力倡導發展綠色生態農業，化學防治因給生態環境帶來極大威脅出現了劣勢，而以生防菌為手段的生物防治優勢顯著[9]

目前關于鎮江地區草莓根腐病病原菌種類及其防治尚未有報道，草莓根腐病生防菌株的篩選研究仍然相對缺乏。因此，本研究在鎮江市京口區草莓大棚采集根腐病病害樣本，通過對病原菌進行分離培養，結合形態學觀察、分子生物學鑒定以及致病性測定，初步明確了該地區引起草莓根腐病的主要病原菌種類，并評估了13株植物內生真菌菌株對病原菌的抑制效果，從而篩選出對草莓根腐病病原菌抑菌作用較好的生防菌株，旨在為進一步研究草莓根腐病的生物防治提供科學依據和優質菌株資源。

1材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1樣本采集于2023 年3月，在江蘇省鎮江市京口區草莓大棚采樣，以隨機取樣法采集草莓根腐病發病植株（品種為紅顏），挖出完整根系放到保鮮袋內，冰袋保存運送至實驗室，盡快進行病原菌分離。

1.1.2供試生防菌株生防真菌菌株是筆者所在實驗室前期分離保存的，來自草莓植株內生真菌，包括B1、B2、B4、B15、B27、B32、B34、B37、B59、B88、T64、T65、T69，共13株。

1.2 病原菌分離純化

利用組織分離法分離草莓根腐病病株潛在的病原菌。首先通過手動搖晃，去除附著在根系上的土壤大顆粒，仍附著在根系表面的細小顆粒則為根際土。收集根際土后，用流水沖洗病株根部，切成5～7cm 的小段，將這些小段在 75% 乙醇中浸泡30s ，然后在 2% 次氯酸鈉溶液中浸泡 2～3min ，隨后用無菌水連續漂洗3次，吸干根部表面水分。分別取根際土小顆粒和表面消毒的根段放在PDA平板上，每個平板放置5塊， 25°C 下培養3～5d。隨時觀察，一旦菌落在土粒和根段上長出，用無菌操作法挑取菌落邊緣菌絲，轉移至新的PDA平板上進行純化培養，并保存備用。

1.3病原菌致病性測定

采用傷口接種法進行病原菌的致病性測定。挑選3株長勢一致、健康的草莓苗（品種為紅顏），流水沖洗根部泥沙， 75% 乙醇表面消毒，用滅菌的接種針在根部輕刺幾下，制造傷口。在培養3～5d的根腐病病原菌菌落邊緣打取菌餅（直徑 5mm ，取3塊菌餅貼在草莓根部傷口處，覆蓋濕脫脂棉，裹上吸水紙，用無菌錫箔紙包緊，放置在事先鋪有2層濕紗布的托盤中，托盤用保鮮膜密封，每組設置3個重復，對照以接種空白PDA培養基（直徑 5mm ）替代病原菌菌餅，放置在 25°C 培養箱中培養，觀察并記錄草莓植株發病情況。從草莓發病處分離純化病原菌，并與原接種的病原菌菌株進行比較。

1.4 病原菌鑒定

1.4.1形態學觀察 25°C 下培養病原菌5～7d后，觀察并記載菌落的培養性狀，挑取少許菌絲和孢子，光學顯微鏡下觀察其形態。

1.4.2分子鑒定 病原菌培養3～5d后，刮取表面菌絲，基因組DNA按照DNAsecure新型植物基因組DNA提取試劑盒（天根DP320-03）說明書進行提取，采用引物ITS1、ITS4進行PCR擴增，此外，分別擴增了 EF-1α 區域和 CAL，ACT 基因來進一步確認鐮孢菌屬和炭疽菌屬物種，擴增體系和反應條件參考先前的方法[10-12]（表1）。PCR 測序結果提交至NCBI數據庫（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），進行BLAST比對分析，從而確定病原菌種類。

1.5生防菌的篩選及鑒定

1.5.1生防菌的篩選采用平板對峙法初步篩選能夠抑制草莓根腐病病原菌生長的生防菌株。將病原菌培養5～7d，待長滿培養Ⅲ，在菌落邊緣打取菌餅（直徑為 5mm ），接種至直徑為 9cm 的PDA培養基平板的一側，在另一側距離病原菌 4cm 處對稱接種內生真菌菌餅（直徑為 5mm ），以只接入病原菌菌餅的平板為對照， 25°C 黑暗培養，定期觀察并測量病原菌菌落半徑，初步篩選對根腐病病原菌有抑制效果的內生真菌菌株，進行復篩，每個處理設置3次重復， 25^°C 黑暗培養，5d后測量病原菌菌落半徑，計算抑菌率。抑菌率 σ=σ （對照組菌落半徑-處理組菌落半徑）/對照組菌落半徑 ×100% 。

1.5.2生防菌的鑒定生防菌的鑒定方法同“1.4.1”節、“1.4.2”節病原菌的形態學和分子鑒定方法。將生防菌株接種至PDA培養基上， 25^qC 下培養7d，觀察菌落培養性狀，挑取少許菌絲及孢子在顯微鏡下觀察。提取生防真菌基因組DNA，采用引物ITS1/ITS4進行PCR擴增，此外，還擴增了tefl和 RPB2 基因來進一步確認木霉屬物種[13-14]（表1）。PCR測序結果提交至NCBI數據庫進行BLAST比對分析，下載同源性較高的ITS參考序列，使用MEGA7.0軟件，以最大似然法構建其系統發育樹，確定生防菌株的分類地位[15]

2 結果與分析

2.1 田間癥狀

發病草莓植株葉片邊緣呈萎蔫狀壞死，地上部逐步全部萎垂，莖基部變紅褐色，根部變黑，根莖橫截面變褐（圖1）。

2.2 病原菌鑒定

從發病草莓植株根際土和根部共分離純化獲得47株菌株，分別命名為 JK1～JK47 。結合形態學觀察和DNA測序序列比對結果，從根際土中分離的12株菌株分別為刺腐霉（Pythiumspinosum）4株，畸雌腐霉（P.irregulare）3株，瓜果腐霉（ P. aphanidermatum）2株，卷枝毛霉（Mucorcircinelloides）擴展青霉（Penicilliumexpansum）和旋柄腐霉（Phytopythiumhelicoides）各1株；從根部分離的35株菌株分別為角擔菌屬（Ceratobasidium sp.）15株，粉紅黏帚霉（Clonostachysrosea）9株，尖孢鐮刀菌（Fusariumoxysporum）4株，暹羅炭疽菌（Colletotrichumsiamense）2株，褐紫曲霉菌（Aspergillusbrunneoviolaceus）黑曲霉菌（A.niger）、溜曲霉（A.tamarii）塔賓曲霉（A.tubingensis）和變紅鐮刀菌（F.incarnatum）各1株（表2）。

表1序列擴增和測序引物

圖1草莓植株根腐病發病癥狀

表2草莓根腐病病原菌分離鑒定結果

2.3病原菌致病性測定

通過創傷接種，發現JK1、JK6、JK23、JK45、JK46導致的根腐病最為嚴重，葉片萎蔫壞死，根系變黑腐爛，對發病部位進行重新分離，得到與原接種菌株相同的病原菌，符合科赫氏法則，表明JK1、JK6、JK23、JK45、JK46為草莓根腐病主要病原菌。而JK26～JK33、JK44共9株分離菌株則不表現發病癥狀。經鑒定JK1、JK6、JK23、JK45、JK46分別為暹羅炭疽菌、角擔菌屬、尖孢鐮刀菌、刺腐霉和畸雌腐霉。JK26～JK33、JK44均為粉紅黏帚霉，表明粉紅黏帚霉不是草莓上的致病菌。

2.4生防菌株的篩選

將上述5株致病性較強的病原菌作為靶標，篩選筆者所在實驗室前期分離自健康草莓植株的13株內生真菌對其的生防效果。經過初篩和復篩，發現13株內生真菌對5種病原真菌均具有一定的抑制效果。

對于暹羅炭疽菌（JK1），13株內生真菌的抑制率均在 60% 以上，其中，B59和T64的抑菌效果最好，其菌絲能夠完全覆蓋 C ：siamense的菌絲，抑菌率均為 100% ，其次是T69，抑菌率為 96.05% 。B4、B27、B32、T65、B34、B2抑菌率也在 80% 以上（表3、圖2）。

對于角擔菌屬（JK6），13株內生真菌的抑菌率均在 50% 以上，其中，T65、T69、B37、B59、B88、T64的抑菌效果最好，其抑菌率均達到了 100% ，在Ceratobasidiumsp.生長后期，這6株內生真菌菌絲能夠完全覆蓋Ceratobasidiumsp.的菌絲（表4、圖3）。

表3生防菌對C.siamense（JK1）的抑菌率

圖2生防菌與C.siamense（JK1）的平板對崎試驗結果

表4生防菌對Ceratobasidiumsp.（JK6）的抑菌率

圖3生防菌與Ceratobasidiumsp.（JK6）的平板對崎試驗結果

對于尖孢鐮刀菌（JK23），T64的抑菌效果最好，抑菌率為 86.55% ，T64的菌絲也可以覆蓋 F oxysporum的菌絲。B27、B32、B37、B4、B59、T69、B88的抑菌率可達 75%～80% 。B34、T65、B15、B2的抑菌率在 70%～75% 之間。B1的抑菌效果最差，抑菌率不到 50% （表5、圖4）。

表5生防菌對Fusariumoxysporum（JK23）的抑菌率

圖4生防菌與Fusariumoxysporum（JK23）的平板對崎試驗結果

對于刺腐霉（JK45），13株內生真菌的抑制率均在 69% 以上，其中，B32、B34、B37、T69、T64、B59均有較好的抑菌效果，抑菌率均可達 100% 。其次為T65、B27、B4，抑菌率可達 90% 以上（表6、圖5）。

表6生防菌對Pythiumspinosum（JK45）的抑菌率

對于畸雌腐霉（JK46），T64、B88、B59、B37、T69、B15、T65、B32、B2、B34、B27的抑菌率均為100% 。其次為B4，抑菌率為 62.44% 以上，B1抑菌率為 58.38% （表7、圖6）。

其中T64對5種病原菌的抑制效果最好，T64和B59對 C ：siamense（JK1）、Ceratobasidium sp.（JK6） ?_?P ：spinosum（JK45） ?_?P .irregulare（JK46）4種病原菌的抑菌率均為 100% ，對 F ：oxysporum（JK23）的抑菌率分別為 86.55% .78.99% 。B37、B88、T69 對 Ceratobasidium sp.（JK6） P .irregulare（JK46）的抑菌率為 100% 。

2.5生防菌株的鑒定

提取T64、B59、B37B88和T69菌株的DNA進行分子鑒定，將測序得到的序列在NCBI進行比對，利用MEGA軟件構建系統發育樹，同時結合形態學觀察，初步確定T64為里氏木霉（Trichodermareesei）、

圖5生防菌與Pythiumspinosum（JK45）的平板對崎試驗結果

表7生防菌對Pythiumirregulare（JK46）的抑菌率

圖6生防菌與Pythiumirregulare（JK46）的平板對崎試驗結果

B59和T69為棘孢木霉（T.asperellum），B37為綠木霉（T.virens），B88為哈茨木霉（T.harzianum）（圖7）。

3結論與討論

在對鎮江市京口區草莓種植大棚的調查中發現，植株根部受害情況頗為嚴重，嚴重影響了當地草莓的產量和質量，給當地莓農造成重大的經濟損失。根據近幾年研究發現，草莓根腐病病原菌復雜多樣，主要包括鐮刀菌屬（Fusariumspp.）、疫霉菌屬（Phytophthoraspp.）、炭疽菌屬（Colletotrichumspp.）立枯絲核菌（Rhizoctoniasolani）新擬盤多毛孢（Neopestalotiopsisclavispora）和腐霉屬（Pythiumspp.）等[16]。本研究共從患草莓根腐病植株的根際土和根部分離得到5種致病性較強的病原菌，根據形態觀察、分子生物學鑒定以及致病性測定，發現引起鎮江市京口區草莓根腐病的致病菌株主要是為暹羅炭疽菌、角擔菌屬、尖孢鐮刀菌、刺腐霉和畸雌腐霉，這也進一步證明了草莓根腐病病原菌種類的復雜性和復合侵染多發。據報道，暹羅炭疽菌引起南京市漂水區草莓根腐病；角擔菌屬引起北京市昌平區草莓根腐??；尖孢鐮刀菌引起北京市昌平區和安徽省長豐縣草莓根腐?。淮谈购突聘挂鸢⒏⒖七B特斯草莓根腐病[17-21] O

目前，生產中草莓根腐病的防治措施仍然主要是采用化學藥劑來進行防治，然而，大量化學藥劑的使用導致農藥殘留、環境污染、生態破壞、病原菌容易產生抗藥性等問題的出現，還會降低土壤微生物多樣性，破壞土壤自我修復能力。因此，亟需尋找針對草莓根腐病的高效環保的新型防治方法。生物防治具有對天敵和生態環境友好、針對性強、病原菌不易產生抗性、避免農殘等優點，已逐漸成為防治草莓根腐病極具發展潛力的新型手段。本研究前期分離獲得了13株草莓內生真菌，通過初篩和復篩，獲得了5株對上述5種根腐病病原菌均有較好拮抗效果的菌株，T64和B59對 C .siamense（JK1）、Ceratobasidiumsp.（JK6）、P.spinosum（JK45） ?_?P ：irregulare（JK46）4種病原菌的抑菌率均為 100% ，對 F ：oxysporum（JK23）的抑菌率分別為86. 55% 和78. 99% 。B37、B88和T69對Ceratobasidium sp.（JK6） ?^P ：irregulare（JK46）的抑菌率為 100% 。經鑒定，T64為里氏木霉、B59和T69為棘孢木霉，B37為綠木霉，B88為哈茨木霉。木霉屬真菌在自然界中分布廣泛，并具有較高的生防價值，在生防菌中具有代表性地位。本研究篩選的5株生防菌株對草莓根腐病病原菌有良好的抑制作用，具備新型控制草莓根腐病的生物防治劑的潛力及潛在應用價值。

在草莓根腐病的生物防治這項課題中，許多研究者在篩選取代或減少傳統合成化學殺菌劑應用的拮抗微生物上貢獻了大量的時間和精力。錢小強等認為，使用枯草芽孢桿菌、哈茨木霉菌或中生菌素、氨基寡糖素等抗生素類與化學藥劑或大蒜油、有機硅等配合使用可有效控制草莓根腐病[22]許英俊等通過試驗表明，鏈霉菌屬放線菌能有效抑制尖孢鐮刀菌和草莓疫霉的活性[23]。汪雪靜等篩選的熒光假單胞菌和枯草芽孢桿菌，姚錦愛等篩選的貝萊斯芽孢桿菌，陳哲等篩選的解淀粉芽孢桿菌對尖孢鐮刀菌引起的草莓根腐病具有較好的抑制作用[24-27]。Yang等篩選的解淀粉芽孢桿菌CMS5和CMR12對茄腐鐮刀菌引起的草莓根腐病的防治效果較好[28]。另外，生防真菌對根腐病害防治也有較好的效果，如哈茨木霉NBL-Z1菌株能有效防治尖孢鐮刀菌引起的草莓根腐病，還可以促進草莓植株的生長，提高草莓果實品質和產量[29]。棘孢木霉產生的代謝產物對新擬盤多毛孢引起的草莓根腐病的生物防治效果為 63.09% ，同時對草莓有促生作用[30]。本研究也發現，木霉菌菌株對草莓根腐病病原菌表現出不同程度的抑制作用，具有作為新型生物防治劑取代化學殺菌劑用于生態友好和可持續農業的潛力。此外，僅憑單一生防菌株很難完全滿足生產過程中多種病害防治的需求[31-34]。本試驗發現，13株內生真菌菌株對5種病原菌均有不同程度的抑制效果，其中5株對5種根腐病病原菌的抑制作用均較好，這為后續復合使用生防菌是否可行提供了新的研究方向，為進一步田間條件下應用生防菌劑以及開發綜合的病害綠色防控方案提供了理論支持。

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