中圖分類(lèi)號(hào)：TS201.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)： 1000-4440（2025）07-1429-09

Synergistic antimicrobial activity and mechanism of action of composite plant essential oils

TAO Hongwei ^1，2 ，MENG Lingfeng3， ZHANG Jianling3，GUO Xiaofei3， XIE Xiao ³ ，JIANG Juli ³ ，WANG Hongxin ^1，2 ， LOU Zaixiang1，2

（1SchlofFdecUi；ioalofdJianganUdflCo.，Ltd.，Dong'e ，China）

Abstract：Giventheoutstanding antimicrobialactivityof plant essentialoilsand theneedtoovercome the limitations ofsingleessentialoilsinfoodpreservation，thisstudyevaluatedtheantibacterialpotentialoftenesentialoilsandexplored thesynergisticefectsof theircombinations.Thedisc-diffusionmethodandcheckerboarddilutionmethod wereemployedto screenforsynergisticpairs，andtheirantimicrobialstabilitywasfurtherassessedunderdiferenttemperaturesandultraviolet （UV）iradiation durations.Theunderlying mechanisms were investigatedusing Escherichiacoli and Staphylococcus aureus as testorganisms.The results showed that cinnamon essential oil exhibited minimum inhibitory concentrations（ MICs ）of4 .0μL/mL ， 8.0μL/mL ， 4.0μL/mL against E .coli， s aureus and Aspergillusniger，respectively，whereas Litsea cubeba essential oil showed MICs of 32.0μL/mL ，16.0 μL/mL and 32.0μL/mL ，respectively.A mixture of cinnamonand L .cubebaoilswiththevolumeratioof 4：6 exhibited a prominent synergistic antibacterial effect，and theinhibitorycirclemeasuredmorethan26.OOmmindiameter.Thecompositeesentialoilretainedgoodantibacterialstability afterheattreatmentandUVexposure.Comparedwiththesingleessentialoil，thecompositeformulationdisplayedbeterinhibition of E .coli and s ，aureus. Compared with L. cubeba essential oil treatment，the leakage of nucleic acids and proteins of E .coli undercomposite formulation treatment increasedby3.11timesand2.03 times，respectively.Theseresults indicatedthatthecompositeessentialoilcandisruptbacterial membranesandaffecttheirpermeability.The findings providea theoretical basis andscientific support for the application of composite plant essential oils in the food industry.

Keywords：compositeplant esentialoils；Escherichiacoli；Staphylococcs aureus；bacteriostatic stability；bacteriostatic mechanism

食品保鮮是確保食品品質(zhì)、延長(zhǎng)食品貨架期和維護(hù)消費(fèi)者健康的關(guān)鍵[1]。化學(xué)合成防腐劑在食品工業(yè)中廣泛用于抑制微生物生長(zhǎng)[2、抑制酶活性和防止氧化。然而，隨著對(duì)食品中合成防腐劑可能對(duì)健康產(chǎn)生不良影響的擔(dān)憂日益增加，消費(fèi)者對(duì)于含有這些成分的產(chǎn)品的接受度正在下降[3]。天然防腐劑的來(lái)源多種多樣，包括植物、動(dòng)物、細(xì)菌、藻類(lèi)和真菌[4-5]。作為一種源自天然植物的次生代謝產(chǎn)物，植物精油已被證實(shí)能有效抑制食源性病原體和腐敗微生物[6-7]，是化學(xué)防腐劑的環(huán)保替代品[8]。劉曉麗等[]在 4‰ 下用肉桂精油保存冷鮮牛肉，發(fā)現(xiàn)冷鮮牛肉的貯藏期延長(zhǎng)至 10～20d 甚至更長(zhǎng)。王清瑤等[]將茶樹(shù)精油應(yīng)用于冷鮮豬肉的保鮮，發(fā)現(xiàn)茶樹(shù)精油可延長(zhǎng)冷鮮豬肉的貨架期3d左右。

單獨(dú)使用某一種精油在保鮮方面的效果存在一定的限制，如精油因其不穩(wěn)定、具有高揮發(fā)性且不溶于水而使用受限[]，Turek等[12]發(fā)現(xiàn)，光的影響很容易導(dǎo)致迷迭香精油化學(xué)成分發(fā)生變化，且隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)及溫度升高植物精油中的主要成分含量會(huì)減少。將不同種類(lèi)的精油進(jìn)行混合搭配，一方面可以互相補(bǔ)充不足，拓寬抑制菌種的覆蓋范圍，從而更全面地抑制食源性腐敗菌和致病菌的生長(zhǎng)與繁殖；另一方面，現(xiàn)有研究結(jié)果表明，不同精油的組合可能因?yàn)樵黾恿艘种坪蜌缥⑸锏耐緩剑_(dá)到協(xié)同的抗菌效果[13-14]。陳泳琪等[15]發(fā)現(xiàn)當(dāng)牛至精油：百里香精油：肉桂精油 =1：2：4 （體積比）時(shí)制備的復(fù)配植物精油可有效抑制草魚(yú)在貯藏期 13d 時(shí)微生物的生長(zhǎng)，結(jié)合真空包裝可將魚(yú)肉的保質(zhì)期由6d延長(zhǎng)至 13d 以上。基于以上背景，本研究擬采用濾紙片法對(duì)10種常用植物精油進(jìn)行篩選，并對(duì)具有顯著抗菌活性的精油進(jìn)行最小抑菌含量（MIC）和最小殺菌含量（MBC）測(cè)定，以期得到抑菌效果良好的單一植物精油。采用棋盤(pán)稀釋法確定復(fù)合精油的種類(lèi)及最佳體積比，對(duì)該復(fù)合精油在不同溫度條件及不同時(shí)長(zhǎng)的紫外線照射下的穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)估，并進(jìn)一步以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為受試菌種，探究復(fù)合精油的抑菌機(jī)理。本研究結(jié)果可為植物精油作為天然抑菌劑在阿膠產(chǎn)品及其他領(lǐng)域的應(yīng)用提供有益的參考和思路。

1材料與方法

1.1 材料與儀器

桉樹(shù)精油、薄荷精油、茶樹(shù)精油、丁香精油、肉桂精油、牛至精油、生姜精油、百里香精油、山蒼子精油、八角茴香精油等均購(gòu)自吉安市中香天然植物有限公司，購(gòu)買(mǎi)后于避光室溫環(huán)境下保存。氯化鈉（分析級(jí)）、吐溫-80（化學(xué)級(jí)）均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；試驗(yàn)用水為超純水。

大腸桿菌（Escherichiacoli，ATCC25922）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，ATCC 6538）購(gòu)于廣東省微生物菌種保藏中心;黑曲霉（Aspergillus ni-ger，ATCC16404）購(gòu)于上海魯微科技有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1菌懸液的制備參照胡虹等的方法制備活化菌懸液，并稍作修改。分別將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌于伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（EMB）和甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行活化（ ，黑曲霉則置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行活化（28%，3～5d） 。挑取大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的典型菌落接種于無(wú)菌的腦心浸出液肉湯（MH肉湯）培養(yǎng)基、腦心浸出液（BHI）培養(yǎng)基中，置于 37^°C 搖床中培養(yǎng) 18～24h ，離心后重懸3次。通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定菌液于 600nm 處的吸光值（ OD₆₀₀ ），OD₆₀₀=1.00±0.05 時(shí)含菌數(shù)約為 1×10⁸ CFU/ ，將菌液用液體培養(yǎng)基倍比稀釋至 1×10⁶ CFU/mL備用。向培養(yǎng)基內(nèi)添加 5mL 無(wú)菌水，輕柔吹打并振蕩混勻，重復(fù)3次。利用無(wú)菌離心管收集無(wú)菌紗布過(guò)濾后的黑曲霉孢子懸浮液，調(diào)整孢子懸浮液含量為1mL 1×10⁶～2×10⁶ 個(gè)，置于 4^°C 條件下備用。

1.2.2植物精油抑菌活性的測(cè)定通過(guò)紙片擴(kuò)散法對(duì)供試精油進(jìn)行抑菌活性評(píng)價(jià)，選出抑菌效果較好的精油。向平板內(nèi)傾注約 25mL 的固體培養(yǎng)基，待其凝固后使用涂布棒將制備所得菌懸液均勻涂布在固體培養(yǎng)基表面，將載有 5μL 待測(cè)精油的濾紙片置于固體培養(yǎng)基表面，以裝載有無(wú)菌生理鹽水的濾紙片為空白對(duì)照。大腸桿菌和金黃色葡萄球菌于37^°C 下培養(yǎng) 24h ，黑曲霉于 28^°C 下培養(yǎng) ^48h 。培養(yǎng)結(jié)束后，對(duì)帶菌平板的抑菌圈直徑進(jìn)行測(cè)量，重復(fù)3次并計(jì)算平均值。

1.2.3植物精油最小抑菌含量及最小殺菌含量的測(cè)定采用二倍稀釋法對(duì)1.2.2中篩選出的幾種具有良好抑菌活性的精油（EOs）進(jìn)一步測(cè)試，旨在精確測(cè)定這些精油的MIC及 MBC 。以吐溫-80作為稀釋劑，將幾種精油分別稀釋至 1 280μL/mL?6 40μL/mL 、 320μL/mL 、 160μL/mL 、 80μL/mL 、40μL/mL，20μL/mL，10μL/mL 。在無(wú)菌條件下，取0.5mL 稀釋后的精油樣品加入含有 4.5mL 液體培養(yǎng)基的試管中，振蕩混勻，使試管中最終精油含量分別為 128μL/mL，64μL/mL，32μL/mL，16μL/mL. 8μL/mL，4μL/mL，2μL/mL，1μL/mL ，空白對(duì)照組加入 0.5mL 吐溫-80。將分別加入 100μL 待測(cè)菌種菌懸液的上述試管于搖床中振蕩混勻后恒溫培養(yǎng)，其中大腸桿菌和金黃色葡萄球菌于 37^°C 下培養(yǎng)24h ，黑曲霉于 28^°C 下培養(yǎng) 48h 。培養(yǎng)結(jié)束后若試管中的液體培養(yǎng)基呈現(xiàn)完全清澈透明狀態(tài)，則視為無(wú)菌生長(zhǎng)，并將此含量記錄為最低抑菌含量。隨后，對(duì)外觀澄清透明的試管液體再次進(jìn)行培養(yǎng)，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌于 37°C 下培養(yǎng) 24h ，黑曲霉于28^°C 下培養(yǎng) ^48h 。再次觀察時(shí)，將試管中的液體培養(yǎng)基保持完全清澈透明時(shí)的最低精油含量確定為最低殺菌含量。重復(fù)3次，計(jì)算平均含量。

1.2.4復(fù)合精油抑菌活性的研究根據(jù)1.2.2和1.2.3中的試驗(yàn)結(jié)果，初篩后選擇抑菌效果較好的精油進(jìn)行兩兩復(fù)配，測(cè)試精油在抑制病原微生物生長(zhǎng)繁殖方面是否存在協(xié)同效果。通過(guò)棋盤(pán)稀釋法選取9支空試管進(jìn)行試驗(yàn)，按照 3×3 方陣排布，以吐溫-80 為稀釋劑，按照預(yù)定的含量梯度對(duì)精油A和精油B進(jìn)行適當(dāng)稀釋。向每個(gè)試管中加入 4.50mL 培養(yǎng)基后分別添加 0.25mL 的精油A和 0.25mL 的精油B，以確保方陣各試管中精油A、精油B的最終含量符合表1所示的配置。將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌在 37^°C 條件下培養(yǎng) 24h ，黑曲霉在 28^°C 下培養(yǎng) 48h 。培養(yǎng)結(jié)束后，按照1.2.3中的方法對(duì)每支試管中的菌種生長(zhǎng)狀況進(jìn)行3次重復(fù)檢驗(yàn)。采用分級(jí)抑菌濃度指數(shù) （FIC） 來(lái)評(píng)估復(fù)配精油的協(xié)同增效性。若 ?FIC?0.500 ，表明存在協(xié)同效應(yīng)；若 0.500lt; FIClt;1.000 ，則表現(xiàn)為相加效應(yīng)；若 1.000?FIClt; 2.000，則意味著其作用效果為無(wú)關(guān)[17]

根據(jù)公式（1）計(jì)算不同精油聯(lián)用的 FIC^[18] 2

式中， MIC_A^? 為精油A單用時(shí)的 MIC，MIC_Bψ_f 為精油B單用時(shí)的MIC， MIC_ABE 為精油A聯(lián)用時(shí)的MIC，MIC_Bigk 為精油B聯(lián)用時(shí)的 MIC 。

表1棋盤(pán)稀釋法方陣 Table1 Squarediagramof thecheckerboard dilutionmethod

。式中， MIC 為最小抑菌含量， MIC_A 為精油A單用時(shí)的MIC， MIC_B 為精油B單用時(shí)的 MIC_ι □

1.2.5復(fù)合精油最佳復(fù)配體積比的測(cè)定以篩選后的精油A、精油B為主要原料，經(jīng)初步試驗(yàn)后，以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉為測(cè)試菌，按照1.2.2中的方法，測(cè)定精油A、精油B體積比為 1：9 、2：8.3：7.4：6.5：5.6：4.7：3.8：2.9：1 時(shí)的抑菌圈大小，獲得最佳復(fù)合精油配比。

1.2.6復(fù)合精油抑菌穩(wěn)定性測(cè)定

1.2.6.1溫度對(duì)復(fù)合精油抑菌穩(wěn)定性的影響為考察不同溫度條件下復(fù)合精油抗菌效果的變化，將復(fù)合精油分別暴露于 40% 60%.80% 100%.120 C 的環(huán)境中 30min ，同時(shí)以室溫（ 25^°C ）下的復(fù)合精油為對(duì)照。按照1.2.2中方法，測(cè)定各樣品的抑菌圈直徑變化，以此評(píng)估溫度對(duì)復(fù)合精油抑菌效果的影響。

1.2.6.2紫外線照射對(duì)復(fù)合精油抑菌穩(wěn)定性的影響為探究紫外線照射時(shí)間對(duì)精油抑菌活性的影響，將復(fù)合精油于超凈臺(tái)紫外環(huán)境中分別照射 40min 、80min₁₂₀min_160min200min ，以未經(jīng)紫外線照射處理的復(fù)合精油為對(duì)照，按照1.2.2中的方法，通過(guò)測(cè)量不同樣品的抑菌圈直徑，評(píng)估紫外線照射時(shí)間對(duì)精油抗菌效果的影響。

1.2.7復(fù)合精油對(duì)供試菌抑菌機(jī)理的分析

1.2.7.1供試菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作為供試菌種測(cè)定細(xì)菌生長(zhǎng)曲線，參考胡璇等9的方法，稍作修改。取 200mL 方法1.2.1中制備所得的菌懸液，向其中加入肉桂精油、山蒼子精油及復(fù)合精油（肉桂精油：山蒼子精油 Σ=Σ 4：6 ，體積比），使其終含量為 16.0μL/mL ，以不加精油的菌懸液為空白對(duì)照，在 37^°C 的搖床內(nèi)對(duì)菌液進(jìn)行連續(xù) 24h 的培養(yǎng)，每隔 2h 取樣1次，并測(cè)定其OD₆₀₀ 。以抑菌時(shí)間作為橫軸，以 OD₆₀₀ 作為縱軸，繪制出試驗(yàn)菌株的生長(zhǎng)曲線。每組樣品進(jìn)行3次平行測(cè)定。

1.2.7.2供試菌相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定參考Diao等[20]的方法，并加以修改。取部分1.2.1中菌懸液進(jìn)行離心（ 5000r/min.10min ，收集沉淀物后，使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 5% 的葡萄糖溶液清洗3次，隨后將其重新懸浮，直至上清液的電導(dǎo)率與5% 葡萄糖溶液的電導(dǎo)率相近，此時(shí)上清液的電導(dǎo)率記錄為 L₀ 。在 5% 葡萄糖溶液中分別加入肉桂精油、山蒼子精油及復(fù)合精油（肉桂精油：山蒼子精油 O=4：6 ，體積比），使其終含量為 16.0μL/mL ，均勻混合后，各自進(jìn)行電導(dǎo)率測(cè)定，記為 L₁ 。采用同樣的方法向等滲處理后的菌液中分別加入肉桂精油、山蒼子精油及復(fù)合精油（肉桂精油：山蒼子精油 =4：6 ，體積比），使其終含量為 16.0μL/mL ，混勻后于 37^qC 搖床中培養(yǎng) ^12h ，每 ^2h 取樣1次并測(cè)量其相對(duì)電導(dǎo)率，記為 L₂ 。最后，將懸浮在 5% 葡萄糖溶液中的菌液加熱至沸騰狀態(tài)，持續(xù) 5min 后迅速冷卻，測(cè)定其電導(dǎo)率，記為 L_0^′ 。按照公式（2）計(jì)算供試菌膜通透性的相對(duì)電導(dǎo)率。試驗(yàn)重復(fù)3次。

相對(duì)電導(dǎo)率

1.2.7.3供試菌菌體內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)泄漏情況的測(cè)定取1.2.1中的菌懸液進(jìn)行離心（ ?5000r/minΩ，10 min）后收集菌體，用磷酸鹽緩沖液（ pH=7.2 沖洗3次后重懸于磷酸鹽緩沖液。取 100mL 重懸液分別加入肉桂精油、山蒼子精油及復(fù)合精油（肉桂精油：山蒼子精油 =4：6 ，體積比），使其終含量為16.0μL/mL ，將未添加精油的菌懸液作為空白對(duì)照，所有樣品于 37^°C 搖床中培養(yǎng) 4h 。隨后，將菌懸液于 4^°C 下 5000r/min 離心 10min ，取上清液用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定并記錄 OD₂₆₀ 和 OD₂₈₀ ，以確定細(xì)胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)的泄漏情況，試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物精油的抑菌活性

10種植物精油對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉的抑菌活性（抑菌圈直徑）如表2所示。在測(cè)試試驗(yàn)中，10種精油展現(xiàn)了不同的敏感性反應(yīng)。其中，牛至精油、肉桂精油、百里香精油和山蒼子精油均對(duì)3種供試菌種表現(xiàn)出了較好的抗菌能力，肉桂精油對(duì)大腸桿菌形成的抑菌圈直徑可達(dá)30.50mm ，牛至精油對(duì)金黃色葡萄球菌、黑曲霉形成的抑菌圈直徑分別可達(dá) 31.83mm.48.17mm 。相較于對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌性而言，肉桂精油、丁香精油對(duì)大腸桿菌（革蘭氏陰性菌）的抑菌活性更強(qiáng)，抑菌圈直徑分別可達(dá) 30.50mm，16.17mm ；牛至精油、百里香精油、山蒼子精油和茶樹(shù)精油對(duì)金黃色葡萄球菌展現(xiàn)出較高的抗菌效力，抑菌圈直徑分別為31.83mm，31.83mm，30.67mm 和 30.67mm ，而茶樹(shù)精油對(duì)黑曲霉的抑菌活性較弱，抑菌圈直徑為7.00mm ，這可能與不同精油發(fā)揮抑菌效果時(shí)的作用靶向位點(diǎn)不同有關(guān)[21]。因此，本研究選取肉桂精油、牛至精油、百里香精油、茶樹(shù)精油、山蒼子精油和丁香精油作為后續(xù)研究對(duì)象。

表2植物精油的抑菌圈直徑

Table2 Antibacterialcirclediameterofessentialoilsofplants

同一列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示差異顯著（ Plt;0.05）

2.2植物精油的最小抑菌含量和最小殺菌含量

采用二倍稀釋法測(cè)定肉桂精油、牛至精油、百里香精油、茶樹(shù)精油、山蒼子精油及丁香精油對(duì)3種供試菌的MIC值，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，肉桂精油、牛至精油和山蒼子精油都具有較強(qiáng)的廣譜抑菌活性，在 4.0～64.0μL/mL 的較低含量下對(duì)3種供試菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉）都表現(xiàn)出了良好的抑菌效果。相較而言，肉桂精油對(duì)大腸桿菌和黑曲霉的抑菌能力更強(qiáng)，其MIC值為4.0μL/mL ；山蒼子精油對(duì)金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗菌作用，在 16.0μL/mL 的含量下即可抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)繁殖，但其對(duì)大腸桿菌和黑曲霉的抑制能力較弱，MIC值均為 32.0μL/mL 。精油的抗菌性能取決于其內(nèi)含的活性組分。肉桂醛作為肉桂精油的主要成分，主要針對(duì)細(xì)胞膜發(fā)揮作用，破壞細(xì)胞膜的完整性，進(jìn)而影響細(xì)菌的代謝活性，最終達(dá)到抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的效果[22]。牛至精油的關(guān)鍵活性物質(zhì)香芹酚可以通過(guò)改變胞外多糖合成和 pH 值來(lái)阻礙生物膜的發(fā)育，破壞微生物細(xì)胞的正常生理代謝機(jī)能[23]。山蒼子精油含有大量的檸檬醛，這種成分能與微生物DNA結(jié)合，產(chǎn)生嵌合結(jié)構(gòu)，進(jìn)而有效抑制細(xì)菌活性，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗菌能力[24]

表3植物精油對(duì)測(cè)試菌種的最小抑菌含量（MIC） Table3Minimuminhibitory concentration（MIC）of plant essentialoilsagainsttest strains of bacteria

Table4 Minimum bactericidal concentration（MBC）of plant essentialoilsagainstteststrains

肉桂精油、牛至精油、百里香精油、茶樹(shù)精油、山蒼子精油及丁香精油對(duì)3種供試菌的MBC值如表4所示。幾種精油對(duì)供試菌的MBC值與MIC值相近或略有差異，這反映出供試菌對(duì)這些精油的耐受性較低，說(shuō)明這些精油在抑制微生物生長(zhǎng)及繁殖方面展現(xiàn)出了較為穩(wěn)定的效果。

2.3復(fù)合精油的抑菌活性

為了進(jìn)一步研究植物精油的協(xié)同抑菌作用，選取抑菌性能突出的肉桂精油、牛至精油和山蒼子精油進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。通過(guò)棋盤(pán)稀釋法對(duì)這些精油的協(xié)同抗菌作用進(jìn)行評(píng)價(jià)，具體試驗(yàn)結(jié)果參見(jiàn)表5、表6、表7。肉桂精油與山蒼子精油的復(fù)配使用對(duì)抑制黑曲霉有協(xié)同增效作用，其FIC低至0.500，同時(shí)對(duì)大腸桿菌及金黃色葡萄球菌均展現(xiàn)出協(xié)同抑制作用，二者的FIC均達(dá)到1.000。Xiang等[25發(fā)現(xiàn)肉桂精油、牛至精油和檸檬草精油協(xié)同使用時(shí)對(duì)黃曲霉菌有協(xié)同抑制作用。這可能是因?yàn)橹参锞椭谢衔锝M成種類(lèi)不同，最終表現(xiàn)出的抑菌效果并非由單一特定抑菌機(jī)制導(dǎo)致的，而是由多種抑菌機(jī)制共同作用引起的[26]。因此本研究選擇肉桂精油和山蒼子精油制備復(fù)合精油，并進(jìn)行最佳復(fù)配體積比的篩選。

表4植物精油對(duì)測(cè)試菌種的最小殺菌含量 ?_MBC）

2.4復(fù)合精油的最佳復(fù)配體積比

表8詳細(xì)展示了在不同體積比例下，肉桂精油與山蒼子精油對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及黑曲霉3種受試菌株的抗菌效果。試驗(yàn)結(jié)果顯示，在大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)基上，當(dāng)肉桂精油與山蒼子精油的體積比為 4：6 時(shí)，觀察到的抑菌圈直徑達(dá)到最大值，分別為 27.75mm 與 26.50mm 。已有研究結(jié)果表明，精油中的一些微量成分也具有輔助抑菌的作用，可在一些體積比下完全抑制黑曲霉的生長(zhǎng)。Miladinovic等[27]研究發(fā)現(xiàn)，精油中的微量成分或者它們的組合可能是精油抗菌的主要成分，這表明了精油中少量成分的關(guān)鍵作用。通過(guò)對(duì)精油進(jìn)行復(fù)配，不僅增加了有效成分的多樣性，還可能加強(qiáng)了這些微量成分之間的相互作用，從而提升了整體的抗菌效果[28]。因此，復(fù)合精油中肉桂精油與山蒼子精油最佳體積比確定為 4：6 。

表5肉桂精油和牛至精油協(xié)同抑菌的最小抑菌含量（MIC）及協(xié)同效果

FIC：分級(jí)抑菌濃度指數(shù)。

表6肉桂精油和山蒼子精油協(xié)同抑菌的最小抑菌含量 ?MIC? 及協(xié)同效果 Table6Evaluationofcombinedminimumibitoryconcentration（MC）andcombinedefectofcinnamoandLitseacubebaessetialoils

FIC：分級(jí)抑菌濃度指數(shù)。

表7牛至精油和山蒼子精油協(xié)同抑菌的最小抑菌含量（ MIC） 及協(xié)同效果 Table7Evaluatioofcombiedminimuminhibitoryconcentration（MC）andombinedeectoforeganoandLitseubebaesentialoils

：分級(jí)抑菌濃度指數(shù)。

表8不同體積比復(fù)合精油抑菌效果

Table8Bacteriainhibitioneffectofcompositeessentialoilswith differentvolumeratios

同一列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示差異顯著（ 。

2.5復(fù)合精油的穩(wěn)定性

以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉作為測(cè)試菌種，探討了復(fù)合精油在多種溫度和不同時(shí)間紫外線照射下的抑菌圈直徑變化，評(píng)價(jià)該復(fù)合精油在不同環(huán)境下的穩(wěn)定性能。由圖1A可知，復(fù)合精油對(duì)大腸桿菌的抑菌活性在低于 100‰ 時(shí)較為穩(wěn)定，在加熱至 80^°C 后開(kāi)始下降， 100^qC 時(shí)抑菌圈直徑最小，但仍對(duì)菌種表現(xiàn)出強(qiáng)抑制能力。與室溫（ 25^°C ）條件下對(duì)照樣品的抑菌效果相比，經(jīng)過(guò) 4 0 ℃ ， 6 0" 直至 120^qC 的熱處理后，復(fù)合精油對(duì)金黃色葡萄球菌和黑曲霉的抑菌活性并未發(fā)生顯著變化（ Pgt;0.05） ，說(shuō)明復(fù)合精油對(duì)3種供試菌的抑菌效果具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性。圖1B顯示，與未經(jīng)紫外線照射處理的空白對(duì)照組的抑菌效果相比，經(jīng)過(guò) 及 200min 的紫外線照射處理后，復(fù)合精油對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉的抑菌活性并未發(fā)生顯著變化（ Pgt; 0.05）。綜上所述，復(fù)合精油的抑菌效果具備一定的環(huán)境穩(wěn)定性，其在極端貯藏和使用過(guò)程中仍能保持良好的抑菌性能，可以作為食品保鮮領(lǐng)域中有效 的天然防腐劑使用。

圖1復(fù)合精油在不同溫度（A）和不同紫外照射時(shí)間（B）下抑菌活性的變化Fig.1Varioititedit）

2.6復(fù)合精油對(duì)供試菌的抑菌機(jī)理

2.6.1復(fù)合精油對(duì)供試菌生長(zhǎng)曲線的影響由圖2可知，對(duì)照的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌在指數(shù)增長(zhǎng)階段快速增殖，并維持了穩(wěn)定的生長(zhǎng)趨勢(shì)。添加了肉桂精油、山蒼子精油及其復(fù)合精油后，這2種細(xì)菌的生長(zhǎng)明顯受到抑制。在處理的前 8h 內(nèi)，大腸桿菌與金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)曲線未表現(xiàn)出明顯差異，細(xì)菌生長(zhǎng)停滯在遲緩期，未能進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，表明精油對(duì)細(xì)菌增殖具有顯著抑制作用。經(jīng)過(guò) 16h 培養(yǎng)，復(fù)合精油處理組的細(xì)菌生長(zhǎng)曲線增長(zhǎng)上限較單一精油處理組更低。因此可以得出精油的使用主要阻斷了細(xì)菌在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的分裂和增殖，顯著減少了活菌數(shù)量，并阻止了細(xì)菌達(dá)到正常的生長(zhǎng)峰值。此外，復(fù)合精油在抑制細(xì)菌生長(zhǎng)方面表現(xiàn)出了更佳的效果。

圖2肉桂精油、山蒼子精油及復(fù)合精油對(duì)大腸桿菌（A）和金黃色葡萄球菌（B）生長(zhǎng)曲線的影響 Fig.2Impactofiamooilitseubebaoiladbendedssetialoilonegowthcuresofschericacoli（A）andtaloocs aureus（B）

OD₆₀₀ ：菌液在 600nm 處的吸光值。

2.6.2復(fù)合精油對(duì)供試菌相對(duì)電導(dǎo)率的影響相對(duì)電導(dǎo)率的變化是衡量精油對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜通透性作用的一個(gè)重要指標(biāo)。如圖3所示，在 ^12h 內(nèi)，對(duì)照組的相對(duì)電導(dǎo)率增加不超過(guò)20個(gè)百分點(diǎn)，然而，經(jīng)過(guò)精油處理的細(xì)菌，其相對(duì)電導(dǎo)率顯著增加，并且這種增加趨勢(shì)隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)更加明顯。經(jīng)過(guò)^12h 復(fù)合精油的處理，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的相對(duì)電導(dǎo)率分別是單獨(dú)使用山蒼子精油處理后的1.56倍和1.53倍，以及單獨(dú)使用肉桂精油處理后的1.13倍和1.29倍，表明精油能夠破壞細(xì)菌細(xì)胞膜，提高其通透性，進(jìn)而干擾細(xì)胞內(nèi)部環(huán)境，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，從而使相對(duì)電導(dǎo)率上升[29]

2.6.3復(fù)合精油對(duì)供試菌菌體內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)泄漏情況的影響精油發(fā)揮抑菌作用的機(jī)制之一是破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁或細(xì)胞膜，進(jìn)而引起細(xì)胞內(nèi)生命物質(zhì)及遺傳物質(zhì)的逸出。這種泄漏造成了細(xì)胞質(zhì)膜的不可逆損傷，并進(jìn)一步干擾細(xì)菌的代謝活動(dòng)，最終引起細(xì)菌死亡。由于核酸和蛋白質(zhì)在 260nm 和280nm 處分別具有最大的紫外吸收，因此，通常利用OD₂₆₀ 和 OD₂₈₀ 來(lái)評(píng)估細(xì)胞膜的破壞程度及細(xì)胞內(nèi)容物的泄漏程度。表9顯示，與單一精油相比，復(fù)合精油能夠顯著增加菌懸液中核酸和蛋白質(zhì)的含量。具體來(lái)說(shuō)，與山蒼子精油相比，復(fù)合精油處理的大腸桿菌中核酸和蛋白質(zhì)的泄漏量分別增加了3.11倍和2.03倍。這一泄漏趨勢(shì)與張贊彬等[22]的研究結(jié)果一致，復(fù)合精油能顯著破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性，破壞細(xì)胞膜的通透性，從而引起細(xì)胞內(nèi)離子、核酸、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的外泄。

圖3肉桂精油、山蒼子精油及復(fù)合精油對(duì)大腸桿菌（A）和金黃色葡萄球菌（B）相對(duì)電導(dǎo)率的影響Fig.3Effectsbdiii（A）and Staphylococcusaureus（B）

表9肉桂精油、山蒼子精油、復(fù)合精油對(duì)大腸桿菌及金黃色葡萄球菌菌體內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)泄漏情況的影響

Table9 Effects of cinnamon essential oil，Litsea cubeba essential oil and compound essential oil on nucleic acid and protein leakageinEscherichiacoliandStaphylococcusaureus

同種供試菌同一列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示差異顯著（ Plt;0.05） 。OD₂₆₀ 為核酸的吸光度， OD₂₈₀ 為蛋白質(zhì)的吸光度。

3結(jié)論

本研究采用濾紙片法對(duì)10種常見(jiàn)的植物精油的抗菌活性進(jìn)行了系統(tǒng)分析。通過(guò)比較植物精油的抑菌圈直徑及MIC和MBC，得到抑菌效果良好的單一精油，進(jìn)一步篩選獲得了最佳復(fù)配比例。本研究結(jié)果表明，肉桂精油與山蒼子精油展現(xiàn)出較優(yōu)的抗菌效果，其中肉桂精油對(duì)大腸桿菌和黑曲霉的最小抑菌含量為 4.0μL/mL ，而山蒼子精油對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌含量為 16.0μL/mL 。基于FIC的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，采用棋盤(pán)稀釋法篩選出了協(xié)同抑菌效果最佳的肉桂精油與山蒼子精油組合，并確定了其最優(yōu)復(fù)配體積比為 4：6 。此外，本研究還考察了復(fù)合精油在不同環(huán)境條件下的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)不良環(huán)境因素（高溫和長(zhǎng)時(shí)間紫外線照射）并未顯著影響復(fù)合精油的抑菌效力。最后以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作為試驗(yàn)菌株，探討了復(fù)合精油的抗菌作用機(jī)制。結(jié)果顯示，復(fù)合精油在處理 期間有效抑制了2種供試細(xì)菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，并在處理 16h 后進(jìn)一步降低了生長(zhǎng)上限。處理 ^12h 后，復(fù)合精油顯著增加了細(xì)菌的相對(duì)電導(dǎo)率，揭示了復(fù)配精油具有更強(qiáng)的抗菌活性。另外，復(fù)合精油顯著提高了細(xì)胞內(nèi)容物的泄漏量，這表明其通過(guò)破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)并改變其透性，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制。綜上所述，本研究為復(fù)合植物精油作為天然抑菌劑的研發(fā)提供了理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持，為進(jìn)一步探索天然抑菌劑的潛在應(yīng)用領(lǐng)域奠定了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：陳海霞）