消毒劑對(duì)日本鰻腸道 NΩ 乙酰 -β-D -氨基葡萄糖苷酶活性的影響

doi：10.3969/j.issn.1000-4440.2025.07.013

關(guān)鍵詞：消毒劑；日本鰻； N -乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶；抑制作用；構(gòu)象變化中圖分類號(hào)：Q556+.2;S965.223 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)： 1000-4440（2025）07-1366-09

Effects of disinfectants on N -acetyl- β -D-glucosaminidase activity of Japanese eel Anguilla japonica

LIN Jiancheng， CHEN Weihao， ZENG Shuiqin， LIN Juanjuan

（CollfdlmergingCotats/KbfolEoetdfoaiofrcaUisiuUi，China）

Abstract： N -acetyl-β-D-glucosidase （NAGase） is one of the main components of chitinolytic enzymes.Inorder to investigate the effects of disinfectants on chitinase in the digestive tract ofcultured fish，NAGasewasextracted from theintestinal tractofJapaneseeel，Anguilla japonica.The effects of ten disinfectants including methylene blue，potassium permanganate，copper sulfate，calcium oxide， formaldehyde，glutaraldehyde，ethanol，sodiumhypochlorite，sodium dichloroisocyanurate，and trichloroisocyanuricacid（TCCA）on NAGaseactivities were studiedbyusing the kinetics methodofenzyme-catalyzedreactionand kineticsmethodofenzymaticinhibition.Spatialconformationchangesof the NAGase influencedbydisinfectants weredetermined through measuring theirfluorescenceemissonspectrum.Theresults showed that methlene blue and copper sulfate could activate the enzyme activity，while potasium permanganate hada strong inhibitory effect on the enzyme activity in a certain range of mass concentration. 40.0mg/L of calcium oxide could lead to losingtheenzyme activityby11.79 percentage points，andformaldehyde，glutaraldehyde，ethanol，sodium hypochlorite， sodium dichloroisocyanurate and TCCA also had strong inhibitory effects on NAGase .Theinhibitoryeffectofformaldehyde on NAGase was reversible and was the non-competitive type. The inhibition constant（ K_i ）of formaldehyde on the enzyme wasdeterminedtobe1.43 mol/L.Buttheendogenous inhibitory effctofTCCAon NAGase was irreversible.Moreover，the fluorescenceemisionintensityof theNAGasetreatedbyformaldehydewasdecreasedobviouslyandthefluorescenceemissionpeakswerered-shifted.Theresults indicatedthattheinactivationefectsofformaldehydeonNAGase were caused by the conformationalchangesand the microenvironment changes inactive centerof enzyme.Butthefluorescence emission spectrumof the NAGase treatedbyTCCA lessthan 10O μmol/Lconcentration had noobvious changes，indicating that TCCAhadlitlefectontheconformationofNAGase.TCCAmightoxidate theenzyme’ssulfhydrylsorcovalentlybound tothe amino groups of enzyme，leading to the irreversible inactivation on NAGase .The results suggested that ten disinfectants have greatregulatoryefectsontheactivitiesofNAGaseintheintestinesofAnguilljaponica.Theresultisinstructiveforthescientificuse of water disinfectants in fish culture.

Key words： disinfectants；Anguilla japonica; N -acetyl ??β -D-glucosaminidase；inhibition；conformational chan！

幾丁質(zhì)酶包括內(nèi)切幾丁質(zhì)酶、外切幾丁質(zhì)酶以及 N -乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（ N -acetyl -D-glu-cosaminidase，NAGase，EC3.2.1.52）。幾丁質(zhì)酶可協(xié)同對(duì)幾丁質(zhì)進(jìn)行降解[1]。研究結(jié)果表明，來源于動(dòng)物體不同部位的幾丁質(zhì)酶有著不同的生理功能，甲殼動(dòng)物外殼膜幾丁質(zhì)酶與其周期性蛻皮生理密切相關(guān)[2-3]，動(dòng)物精巢NAGase可能與其受精與生殖能力相關(guān)[4-5]，而水生動(dòng)物消化道幾丁質(zhì)酶的功能主要表現(xiàn)在對(duì)含幾丁質(zhì)食物的消化上[6。近年來，有關(guān)魚類幾丁質(zhì)酶性質(zhì)和功能的研究越來越受到人們的重視。Abro等[7]發(fā)現(xiàn)北極紅點(diǎn)鮭（Salwelinusalpinus）腸道具有較強(qiáng)的內(nèi)切幾丁質(zhì)酶、外切幾丁質(zhì)酶活性，腸道后段酶活性較強(qiáng)，胃組織中內(nèi)切幾丁質(zhì)酶活性比外切幾丁質(zhì)酶活性高幾百倍。在吉富羅非魚（Oreochromisniloticus）前腸和中腸中發(fā)現(xiàn)分布有tChitlatChi3和tChit等3種幾丁質(zhì)酶，均為非酸性幾丁質(zhì)酶，屬于18家族幾丁質(zhì)酶；而且魚胃中幾丁質(zhì)酶表達(dá)量相對(duì)較低，可能與其是雜食且偏素食的食性相關(guān)[8]。Chen 等9]也從中華烏塘（Bostrychussinensis）的食道、胃、肝胰腺、腸道等不同部位檢測(cè)到幾丁質(zhì)酶活性，發(fā)現(xiàn)食道和肝胰腺均有較高的幾丁質(zhì)酶轉(zhuǎn)錄水平，并從肝胰腺中分離到一種相對(duì)分子量為58000的幾丁質(zhì)酶，它是一種耐熱型酶，對(duì)食物中的幾丁質(zhì)具有強(qiáng)降解能力。相似地，Pascon等[io]發(fā)現(xiàn)虹魚（Oncorhynchusmykiss）在喂食 1.5h 后胃內(nèi)幾丁質(zhì)酶基因表達(dá)量達(dá)到峰值，但與歐洲舌齒鱸（Dicentrarchuslabrax）胃幾丁質(zhì)酶比較時(shí)，虹鱒魚胃幾丁質(zhì)酶的活性要低些。此外，從尼羅羅非魚（Oreochromisniloticus）[11]肝臟中也分離到NAGase，相對(duì)分子量為61800，由1個(gè)亞基組成，最適pH和最適溫度分別為5.8和 55^°C 。Kono 等[12]從日本鰻（Anguillajaponica）胃內(nèi)分離純化到一種能降解幾丁質(zhì)的幾丁質(zhì)酶。本課題組也從日本鰻腸道分離純化到另一種幾丁質(zhì)酶——NAGase，并闡明了這種幾丁質(zhì)酶的基本性質(zhì)和功能基團(tuán)[13]]魚類幾丁質(zhì)酶已成為研究熱點(diǎn)。

水體消毒劑在魚類養(yǎng)殖中正被廣泛使用，它主要起到殺蟲和抗菌作用，消毒劑按化學(xué)本質(zhì)劃分可分為鹵素類、氧化劑類、醇醛類、重金屬類和染料類等，常見的有高錳酸鉀、硫酸銅、甲醛和三氯異氰尿酸（TC-CA）等。但是，這些消毒劑除了能給魚類帶來急性毒性作用外[14]，還可能進(jìn)入魚體內(nèi)，影響到魚類的生理代謝。近年來，有關(guān)外源性效應(yīng)物對(duì)水生動(dòng)物NA-Gase的影響已有不少研究。Rollin等[5將鋸齒長臂蝦（Palaemonserratus）直接暴露在苯醚威、二硫代氨基甲酸鹽、丙酮和甲醇等溶液中，發(fā)現(xiàn)這些溶液對(duì)鋸齒長臂蝦體內(nèi)NAGase活性可直接產(chǎn)生影響。硫酸銅和硫酸鋅對(duì)尼羅羅非魚精巢的 NAGase 活性均具有較強(qiáng)的抑制效應(yīng)[16]，TCCA還可以直接導(dǎo)致尼羅羅非魚精巢NAGase失活[17]。謝曉蘭等[18]研究發(fā)現(xiàn)，次氯酸鈉和 TCCA對(duì)凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeusvannamei）NAGase活性均有較強(qiáng)的抑制作用，戊二醛對(duì)該酶則有微弱的激活效應(yīng)。此外，甲醛對(duì)中國（Tachypleustridentatus）內(nèi)臟NAGase活性也具有抑制作用，且呈現(xiàn)濃度效應(yīng)[19]。這些研究結(jié)果顯示外源性效應(yīng)物可直接對(duì)動(dòng)物體NAGase產(chǎn)生影響。有關(guān)消毒劑對(duì)魚類消化道幾丁質(zhì)酶的影響還未見報(bào)道，本研究擬選擇10種常見養(yǎng)殖水體消毒劑，研究其對(duì)日本鰻腸道NAGase活性的影響，進(jìn)一步探討甲醛和TCCA對(duì)NA-Gase活性的影響機(jī)理，為闡明消毒劑對(duì)魚類消化道幾丁質(zhì)酶的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。本研究結(jié)果可為鰻養(yǎng)殖水體消毒劑的科學(xué)使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

日本鰻新鮮腸購于東源水產(chǎn)食品有限公司。NAGase是由本實(shí)驗(yàn)室按照參考文獻(xiàn)［13]的方法用日本鰻腸道制備的電泳純酶制劑。

對(duì)硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷（ D -GlcNAc）購于上海底物生化科技有限公司；葡聚糖凝膠（SephadexG-100）與二乙基氨基乙基纖維素（DEAE-32）均購于北京吉泰科技生物有限公司；磷酸氫二鈉（ Na₂HPO₄ ）、磷酸二氫鈉（ NaH₂PO₄ ）氫氧化鈉（ NaOH ）、對(duì)硝基苯酚、高錳酸鉀、硫酸銅、氧化鈣、甲醛、戊二醛、乙醇、次氯酸鈉、二氯異氰尿酸鈉和TCCA等藥品均為國產(chǎn)分析純；甲基藍(lán)為國產(chǎn)生物染色劑。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1日本鰻NAGase活性的測(cè)定NAGase活性的測(cè)定參照文獻(xiàn)[13]和文獻(xiàn)[20]的方法。 2.0mL 反應(yīng)體系包括： 0.2mL 5mmol/L pNP-β-D-GlcNAc底物、1.0 mL 75mmol/L Na₂HPO₄-NaH₂PO₄ 緩沖液（ pH6.0? 和 0.78mL 無離子水，在 37^°C 下預(yù)保溫10min ，再加人 20μL 酶制劑。催化反應(yīng) 10min ，加人 2.0mL0.5mol/LNaOH 終止反應(yīng)，在 405nm 波長下測(cè)定反應(yīng)液吸光度（ ?_A405 ），以先加入 2.0mL 0.5mol/LNaOH 后加入 20μL 酶制劑為對(duì)照組。以對(duì)硝基苯酚為標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)測(cè)定獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=0.017 6x 計(jì)算酶活性，以酶促反應(yīng)初速度 （v） 表示。1個(gè)酶活性單位（U）定義為：在上述條件下，每 1min 催化產(chǎn)生 1μmol/L 對(duì)硝基苯酚所需要的NAGase量。

1.2.2消毒劑對(duì)日本鰻NAGase活性的影響以甲基藍(lán)、高錳酸鉀、硫酸銅、氧化鈣、甲醛、戊二醛、乙醇、次氯酸鈉、二氯異氰尿酸鈉和TCCA等10種常見的水體消毒劑為效應(yīng)物，研究消毒劑對(duì)日本鰻NAGase活性的影響。參照文獻(xiàn)[19］的方法，在上述NAGase的活性測(cè)定體系中，分別加入不同濃度的消毒劑，測(cè)定NAGase的剩余活性，以沒有加效應(yīng)物的酶活性為 100% ，計(jì)算加入消毒劑后酶的相對(duì)活性（2 （%） ，分析各消毒劑對(duì)日本鰻NAGase活性的影響。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Excel2013軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析，采用OriginPro8.5軟件作圖。

1.2.3甲醛和TCCA對(duì)日本鰻NAGase活性抑制機(jī)理的判斷在 NAGase 活性測(cè)定體系中，固定底物濃度（S）為 0.5mmol/L ，改變NAGase的質(zhì)量濃度（ μg/mL ），分別測(cè)定5種不同濃度（ 0mol/L，0.5 mol/L.1.0mol/L.2.0mol/L.3.0mol/L） 甲醛和5種不同濃度 （ 0μmol/L，30μmol/L，60μmol/L，80 μmol/L，100μmol/L ）TCCA對(duì)NAGase活性的影響，以 v 對(duì)NAGase質(zhì)量濃度作圖，分析甲醛和TCCA對(duì)日本鰻 NAGase 活性的抑制作用機(jī)理。

1.2.4甲醛對(duì)日本鰻NAGase活性的抑制作用類型在NAGase活性測(cè)定體系中，NAGase質(zhì)量濃度恒定，改變底物濃度 0.167～0.500mmol/L） ，測(cè)定5種不同濃度（ 0mol/L.0.5mol/L.1.0mol/L.2.0 mol/L，3.0mol/L ）甲醛對(duì)NAGase活性的影響，采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法，根據(jù)在各底物濃度下，經(jīng)不同濃度甲醛作用后測(cè)定的酶促反應(yīng)速度，以1/v 對(duì)1/S作圖，測(cè)定不同濃度甲醛作用下NAGase的表觀米氏常數(shù)（ K_mapp ）和表觀最大反應(yīng)速度（ V_mapp ），分析甲醛對(duì)日本鰻NAGase活性的抑制作用類型。

1.2.5甲醛和TCCA對(duì)日本鰻NAGase蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的影響分別測(cè)定 NAGase 蛋白質(zhì)在不同濃度0 0～5.00mol/L ）甲醛和不同濃度 （0～200μmol/L） ）TCCA作用下的熒光發(fā)射強(qiáng)度，在 227nm 波長的內(nèi)源熒光激發(fā)光譜下，在 290～410nm 波長范圍內(nèi)掃描NAGase蛋白質(zhì)的熒光發(fā)射光譜，根據(jù) NAGase 蛋白質(zhì)的發(fā)射光譜的變化規(guī)律，分析甲醛和TCCA對(duì)日本鰻NAGase蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的影響。

2 結(jié)果與分析

2.110種消毒劑對(duì)日本鰻NAGase活性的影響

甲基藍(lán)是一種染料類水體消毒劑，在殺滅寄生蟲藥物中用于替代孔雀石綠等禁藥被廣泛使用。由圖1可知，質(zhì)量濃度為 0.5～7.5mg/L 時(shí)，甲基藍(lán)對(duì)日本鰻NAGase有一定的激活效應(yīng)， 2.0mg/L 甲基藍(lán)可使NAGase相對(duì)酶活性提高19.97個(gè)百分點(diǎn)。而高錳酸鉀是具有強(qiáng)氧化性的消毒劑，能快速氧化酶蛋白質(zhì)而使酶失活[14]。質(zhì)量濃度為 0～5.0mg/L 時(shí)，高錳酸鉀對(duì)日本鰻 NAGase 活性具有較強(qiáng)的抑制效應(yīng)，5.0mg/L 高錳酸鉀會(huì)使NAGase相對(duì)酶活性下降43.65個(gè)百分點(diǎn)；之后隨著高錳酸鉀質(zhì)量濃度的升高，對(duì) NA Gase活性的抑制逐漸趨于平緩。硫酸銅屬于重金屬類消毒劑，在硫酸銅質(zhì)量濃度小于 32.0mg/L 時(shí)，它對(duì)NAGase活性沒有明顯影響（ Pgt;0.05） ，隨著質(zhì)量濃度增大，表現(xiàn)出對(duì)酶的微弱激活效應(yīng)，質(zhì)量濃度為160.0mg/L 的硫酸銅可以使NAGase相對(duì)酶活性提升6.14個(gè)百分點(diǎn)。氧化鈣即呈堿性的生石灰，也是養(yǎng)殖水體的消毒劑。質(zhì)量濃度為 10.0～40.0mg/L^? 寸，氧化鈣對(duì)日本鰻NAGase表現(xiàn)出明顯的抑制效應(yīng)，質(zhì)量濃度為 40.0mg/L 的氧化鈣可使 NAGase 相對(duì)酶活性下降11.79個(gè)百分點(diǎn)，隨氧化鈣質(zhì)量濃度增大，其對(duì)NA-Gase活性的影響效應(yīng)有所減弱。

A：甲基藍(lán);B：高錳酸鉀;C：硫酸銅;D：氧化鈣。不同小寫字母表示差異顯著（ Plt;0.05） 。圖14種常用消毒劑對(duì)日本鰻 N -乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAGase）活性的影響Fig.1Effect of four common disinfectants onthe activity of NAGase from Anguilla japonica

甲醛和戊二醛作為醛類殺蟲藥物，對(duì)日本鰻NAGase活性均具有抑制效應(yīng)（圖2），甲醛對(duì)NAGase活性的抑制作用呈明顯的濃度效應(yīng)，濃度為1.0mol/L的甲醛可使NAGase相對(duì)酶活性降低38.29個(gè)百分點(diǎn)，當(dāng)甲醛濃度達(dá)到 5.0mol/L 時(shí)，NAGase相對(duì)酶活性下降83.27個(gè)百分點(diǎn)。相似地， 0.5mol/L 濃度的戊二醛可使NAGase相對(duì)酶活性下降50.50個(gè)百分點(diǎn)。乙醇濃度小于 2.0mol/L 時(shí)，對(duì)日本鰻NAGase有輕微的激活作用，隨著濃度升高，轉(zhuǎn)為對(duì)NAGase活性的抑制作用， 6.0mol/L 的乙醇會(huì)使NA-Gase相對(duì)酶活性下降35.87個(gè)百分點(diǎn)， 8.5mol/LZ 醇可使NAGase活性幾乎全部喪失。

次氯酸鈉、二氯異氰尿酸鈉和TCCA都是氯制劑殺菌藥物，3種氯制劑對(duì)日本鰻NAGase活性均有較強(qiáng)的抑制效應(yīng)（圖3） .2.0mmol?L 的次氯酸鈉可使日本鰻NAGase相對(duì)酶活性下降91.85個(gè)百分點(diǎn)；而 0.10mmol/L 濃度的二氯異氰尿酸鈉和TC-CA可分別使NAGase相對(duì)酶活性降低89.87個(gè)百分點(diǎn)和82.80個(gè)百分點(diǎn)，二氯異氰尿酸鈉和TCCA對(duì)日本鰻NAGase的抑制作用較強(qiáng)。

2.2甲醛對(duì)日本鰻NAGase活性抑制機(jī)理的判斷以酶促反應(yīng)速度 （v） 對(duì)NAGase質(zhì)量濃度作圖（圖4），在 0mol/L. 0.5mol/L. 1.0mol/L. 2.0 mol/L和 3.0mol/L 等5種甲醛濃度下，獲得了5條相交于原點(diǎn)的直線，即 σ_v 與酶質(zhì)量濃度間呈線性關(guān)系，同時(shí)隨著甲醛濃度逐漸增大，相應(yīng)的直線斜率則不斷下降。 χ_t 檢驗(yàn)分析結(jié)果表明，在甲醛作用下，相同酶質(zhì)量濃度下各試驗(yàn)組NAGase活性之間均存在顯著差異（ Plt;0.05 ）。說明甲醛濃度恒定時(shí)，NAGase活性受到的抑制與酶質(zhì)量濃度成比例，從而獲得了一組隨甲醛濃度增大而斜率不斷降低的直線[21]。說明甲醛對(duì)日本鰻NAGase活性的抑制作用是可逆的。

2.3甲醛對(duì)日本鰻NAGase活性的抑制作用類型

以酶促反應(yīng)速度倒數(shù)（ ）對(duì)底物濃度倒數(shù)1/S進(jìn)行雙倒數(shù)作圖（圖5），獲得了5條斜率不同的直線，且5條直線幾乎相交于第二象限橫軸上的一點(diǎn)，而各直線在縱軸上有不同的截距，隨著甲醛濃度增大，直線在縱坐標(biāo)上的截距也增大。說明在不同濃度的甲醛作用下，日本鰻 NAGase 的表觀米氏常數(shù) ?K_mapp ）值不變，隨著甲醛濃度增大，其表觀最大反應(yīng)速度（ V_mapp ）值則不斷下降，這符合酶的非競(jìng)爭性抑制作用動(dòng)力學(xué)的特性[21]。可以說明甲醛對(duì)日本鰻腸道 NAGase 活性的抑制屬于非競(jìng)爭性抑制作用。

求出圖5中5條直線的斜率 （k） ，以k對(duì)相應(yīng)的甲醛濃度作圖（圖6），獲得一條直線，從該直線在第二象限橫軸上的交點(diǎn)，可求出甲醛對(duì)日本鰻NA-Gase的抑制常數(shù) （K_i ）為 1.43mol/L 。

2.4 甲醛對(duì)日本鰻NAGase蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的影響

日本鰻NAGase蛋白質(zhì)熒光發(fā)射峰在335.9nm 處，在NAGase內(nèi)源熒光發(fā)射光譜掃描波長范圍內(nèi)，隨著甲醛濃度的增大， NAGase 蛋白質(zhì)熒光發(fā)射峰呈逐漸降低趨勢(shì)（圖7）， 1.00mol/L 甲醛可使 NA Gase蛋白質(zhì)熒光發(fā)射峰值下降 34.23% 。隨著甲醛濃度的增大， NAGase 蛋白質(zhì)熒光發(fā)射峰還有輕微的紅移，在 5.00mol/L 甲醛作用下， NAGase 從原蛋白質(zhì)熒光發(fā)射峰的光波長 335.9nm 紅移至 342.0nm 處。說明加入甲醛會(huì)使日本鰻 NAGase 蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象發(fā)生改變，從而導(dǎo)致NAGase失活。

圖5甲醛對(duì)日本鰻 N -乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAGase）抑制作用的Lineweaver-Burk關(guān)系

Fig.5Lineweaver-BurkplotsforinhibitoryeffectofformaldehydeontheactivityofNAGasefromAnguillajaponica

圖6甲醛對(duì)日本鰻NAGase活性抑制常數(shù)的測(cè)定 Fig.6 Determinationofinhibitionconstantsofformaldehyde ontheNAGaseactivityfromAnguillajaponica

2.5TCCA對(duì)日本鰻NAGase抑制機(jī)理的判斷 改變NAGase質(zhì)量濃度，測(cè)定了TCCA對(duì)NAGase酶促反應(yīng)速度 （v） 的影響，以 v 對(duì)NAGase質(zhì)量濃度作圖，結(jié)果（圖8）顯示： v 與 NAGase 質(zhì)量濃度之間呈線性關(guān)系，隨著TCCA濃度的增大，相應(yīng)的直線不斷向右平移，最終獲得5條平行線。 Φ_t"檢驗(yàn)分析結(jié)果表明，在TCCA作用下，相同酶質(zhì)量濃度下各試驗(yàn)組NAGase活性之間差異顯著（ Plt;0.05 ），說明TCCA對(duì)NAGase抑制作用是不可逆的[21]。經(jīng)TCCA作用后， NAGase 蛋白質(zhì)失活，只有當(dāng)酶質(zhì)量大于TCCA溶劑量時(shí)，才能表現(xiàn)出酶活性，TCCA是NAGase活性的不可逆抑制劑。

圖7日本鰻 N -乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（ NAGase ）在甲醛溶劑中的內(nèi)源熒光發(fā)射光譜

0～7分別對(duì)應(yīng)甲醛濃度為 0mol/L，0.125mol/L，0.250mol/L 0.500mol/L.1.00mol/L.2.00mol/L.3.00mol/L 和 5.00mol/L 時(shí)的曲線。

Fig. 7 Endogenous fluorescence emission spectra of NAGase fromAnguillajaponicainformaldehydesolution

2.6TCCA對(duì)日本鰻NAGase蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的影響

TCCA濃度為 0～100μmol/L 時(shí)，NAGase蛋白質(zhì)經(jīng)TCCA作用后，蛋白質(zhì)的熒光強(qiáng)度發(fā)生微弱的下降；熒光發(fā)射峰沒有發(fā)生位移現(xiàn)象（圖9）。隨著TCCA濃度的增大，NAGase蛋白質(zhì)的熒光發(fā)射強(qiáng)度變化不明顯，與原酶的熒光強(qiáng)度相比， 100μmol/L TCCA僅僅使NAGase蛋白質(zhì)的熒光發(fā)射強(qiáng)度下降5.25% ，而在該TCCA濃度下NAGase活性已喪失82.80% ；當(dāng)TCCA溶劑濃度升至 200μmol/L 時(shí)，酶蛋白質(zhì)的熒光發(fā)射強(qiáng)度下降了 15.40% 。分析結(jié)果表明，低于 100μmol/L 濃度的TCCA對(duì)日本鰻NAGase蛋白質(zhì)空間構(gòu)象影響很小。

3討論

水體消毒劑已被廣泛應(yīng)用在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，起到防腐、殺菌和殺蟲的作用，這些消毒劑的使用不僅污染了生態(tài)環(huán)境，對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的生理代謝也會(huì)產(chǎn)生直接影響。Wang等[22]的研究結(jié)果表明，斜帶石斑魚（Epinepheluscoioides）在含硫酸銅環(huán)境中暴露 25d ，不僅幼魚生長性能下降，幼魚肝臟、胃和腸道中的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等消化酶活性也會(huì)受到抑制。

不同小寫字母表示差異顯著（ Plt;0.05 ）。0～4分別對(duì)應(yīng)TCCA濃度為 0μmol/L 、 30μmol/L 、 60μmol/L 、 80μmol/L 和100μmol/I 時(shí)作出的直線。

圖8三氯異氰尿酸（TCCA）對(duì)日本鰻 N -乙酰 -β-D -氨基葡萄糖苷酶（NAGase）的抑制機(jī)理

Fig.8 Determination of the inhibitory mechanism of trichloroisocyanuricacid（TCCA）onNAGasefrom Anguilla japonica

圖9日本鰻 N_?rosun 乙酰 -β-D. -氨基葡萄糖苷酶（ NAGase） 在三氯異氰尿酸（TCCA）溶劑中的內(nèi)源熒光發(fā)射光譜

Fig. 9 Endogenous fluorescence emission spectra of NAGase fromAnguilla japonicain trichloroisocyanuricacid （TCCA）solution

曲線0～6對(duì)應(yīng)的TCCA濃度分別為 0μmol/L，30μmol/L，60 （2號(hào)μmol/L.80μmol/L.100μmol/L.150μmol/L 和 200μmol/L

而羅氏沼蝦（Macrobrachiumrosenbergii）在 1.4mg/L 亞甲基藍(lán)中暴露4d后，蝦肝胰腺超氧化物歧化酶、堿性磷酸酶和酸性磷酸酶等的活性也均顯著低于對(duì)照組，亞甲基藍(lán)對(duì)蝦體內(nèi)的氧化應(yīng)激系統(tǒng)和免疫能力可直接產(chǎn)生影響[23]。硫酸銅和硫酸鋅均能影響到尼羅羅非魚精巢NAGase蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光發(fā)射強(qiáng)度，使酶蛋白質(zhì)空間構(gòu)象發(fā)生改變，從而引起對(duì)羅非魚NAGase活性的抑制作用[16]。在本研究中，在特定濃度范圍內(nèi)，甲基藍(lán)對(duì)日本鰻 NAGase 有一定的激活效應(yīng)；高錳酸鉀對(duì)NAGase活性有較強(qiáng)的抑制作用，當(dāng)硫酸銅質(zhì)量濃度達(dá)到 32.0mg/L 后，對(duì)日本鰻NAGase也具有較小的激活作用，而在 30.0～ 40.0mg/L 的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，氧化鈣對(duì)日本鰻NAGase活性呈現(xiàn)一定的抑制效應(yīng)。可見，不同消毒劑對(duì)日本鰻腸道NAGase活性的影響存在差異。

陳宏惠等[24]研究發(fā)現(xiàn)，甲醛對(duì)中華絨螯蟹（Eriocheirsinensis）內(nèi)臟NAGase活性有較強(qiáng)抑制作用，屬于可逆非競(jìng)爭性抑制；低濃度乙醇對(duì)中華絨螯蟹NAGase有激活作用，高濃度乙醇對(duì)NAGase有可逆的抑制作用，而戊二醛對(duì)中華絨蟹NAGase活性沒有明顯影響。還有研究結(jié)果顯示，甲醛對(duì)中國內(nèi)臟NAGase活性也具有抑制作用， 1.0mol/L 甲醛可使中國NAGase活性下降81.87個(gè)百分點(diǎn)；而乙醇對(duì)中國鯊NAGase 活性的抑制作用相對(duì)較弱[19]。此外，甲醛對(duì)中國明對(duì)蝦（Fenneropenaeuschinen-sis）[25]體壁NAGase活性和尼羅羅非魚[26]精子NA-Gase活性均有可逆的抑制作用。本研究結(jié)果表明，甲醛、戊二醛和乙醇對(duì)日本鰻腸道NAGase活性均具有較強(qiáng)的抑制作用，其中甲醛對(duì)NAGase活性的抑制作用具有濃度效應(yīng)，屬于可逆的非競(jìng)爭性抑制作用，原因可能是，甲醛有機(jī)溶劑的加入可降低NA-Gase溶液的介電常數(shù)，破壞酶蛋白質(zhì)分子表面的水膜，從而引起酶蛋白質(zhì)相互凝聚而發(fā)生變性現(xiàn)象。同時(shí)，甲醛還具有較高的反應(yīng)活性，可以與NAGase蛋白質(zhì)中較強(qiáng)的親核基團(tuán)賴氨酸（Lys）的 ε -氨基發(fā)生可逆反應(yīng)，形成席夫堿[27]，酶蛋白質(zhì)分子表面的水膜被破壞后也加劇了該反應(yīng)的進(jìn)行。Lys的 ε -氨基是日本鰻NAGase的必需基團(tuán)[13]，甲醛對(duì)酶蛋白質(zhì)的功能基團(tuán) ε -氨基進(jìn)行化學(xué)修飾后還可引起NAGase蛋白質(zhì)空間構(gòu)象變化，導(dǎo)致酶變性失活[26]

內(nèi)源性熒光光譜的變化可以反映蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化情況[28]，酶蛋白質(zhì)熒光發(fā)射主要是由蛋白質(zhì)內(nèi)源生色基團(tuán)色氨酸（Trp）引起的[21]，酶蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的變化使得原來處于酶蛋白質(zhì)內(nèi)核疏水區(qū)的生色基團(tuán)Trp暴露于極性溶劑中，從而改變了酶蛋白質(zhì)活性中心疏水微環(huán)境，導(dǎo)致酶蛋白質(zhì)熒光發(fā)射強(qiáng)度降低，熒光發(fā)射峰發(fā)生紅移[29]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)甲醛溶劑作用后日本鰻NAGase蛋白質(zhì)熒光發(fā)射強(qiáng)度降低，熒光發(fā)射峰發(fā)生微弱的紅移，證明甲醛溶劑改變了NAGase蛋白質(zhì)空間構(gòu)象，從而導(dǎo)致酶失活。

次氯酸鈉和TCCA對(duì)凡納濱對(duì)蝦內(nèi)臟NAGase活性具有不可逆的抑制作用[18]；而TCCA對(duì)尼羅羅非魚精巢NAGase活性則具有可逆的反競(jìng)爭型抑制作用[17]。在本研究中，次氯酸鈉、二氯異氰尿酸鈉和TCCA3種含氯消毒劑對(duì)日本鰻NAGase活性均有較強(qiáng)的抑制效應(yīng)，TCCA對(duì)日本鰻NAGase活性的抑制作用是不可逆的。這些說明了TCCA消毒劑對(duì)不同生物來源的NAGase活性的抑制機(jī)理有差異。此外，TCCA溶解在水中可產(chǎn)生次氯酸，進(jìn)而釋放出新生態(tài)氧和活性氯，它們分別是極強(qiáng)的氧化劑和氯化劑[30]。研究結(jié)果表明，巰基和Lys 的 ε -氨基都是日本鰻NAGase的必需基團(tuán)[13]，所以，TCCA可能通過對(duì)NAGase蛋白質(zhì)的巰基產(chǎn)生氧化作用，或者是與酶蛋白質(zhì)的 ε -氨基共價(jià)結(jié)合形成氯胺，從而使NAGase蛋白質(zhì)不可逆地失活。而TCCA對(duì)蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光發(fā)射強(qiáng)度影響較小，說明TCCA溶劑對(duì)NAGase蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象影響不大，TCCA可能不是通過改變酶蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象對(duì)酶產(chǎn)生抑制作用。有關(guān)TCCA與酶蛋白質(zhì)之間的互作機(jī)制，還有待進(jìn)一步研究。

4結(jié)論

甲基藍(lán)、高錳酸鉀和硫酸銅等10種消毒劑對(duì)日本鰻腸道NAGase活性有不同的調(diào)控作用，其中醇醛類和氯制消毒劑對(duì)NAGase具有較強(qiáng)的抑制作用。甲醛對(duì)NAGase活性的抑制屬于可逆的非競(jìng)爭性抑制，而TCCA對(duì)NAGase活性的抑制是不可逆的。甲醛可引起NAGase蛋白質(zhì)空間構(gòu)象變化，而TCCA對(duì)NAGase蛋白質(zhì)空間構(gòu)象影響很小。為此，在日本鰻養(yǎng)殖水體的消毒中，應(yīng)謹(jǐn)慎選擇消毒劑，才能既起到殺滅水體有害菌類和寄生蟲的作用，又能達(dá)到健康養(yǎng)殖的功效。

參考文獻(xiàn)：

[1]WANGY，ZOU HB，LAI J，et al. The miR-282-5p regulates lar-val moulting processby targeting chitinase5in Bombyx mori[J].Insect Molecular Biology，2022，31（2）：190-201.

[2]ZHANG B L，LI C L，LUANY，et al. The role of chitoligosac-charidolytic β -N-acetylglucosamindase inthemoltingand wingde-velopment of the silkwormBombyxmori[J].International Journalof Molecular Sciences，2022，23（7） ：3850.

[3] ROLLIN M，COULAUDR，ROCHERB，et al. N -acetyl-β- D -glu-cosaminidaseactivityinPalaemon serratus-Methodological optimis-ationand intrinsic variability[J].Comparative BiochemistryandPhysiology，Part A，2021，256：110932.

[4]SAROSIEK B， GLOGOWSKI J，CEJKO B， et al. Inhibition of β （20 N acetylglucosaminidase byacetamide affectssperm motility andfertilization success of rainbow trout（Oncorhynchus mykiss）andSiberian sturgeon（Acipenser baeri）[J].Theriogenology，2014，81（5） ： 723-732.

[5]SAROSIEK B，DRYL K，KOWALSKI R K， et al. Optimalisationof the activation medium and efect of inhibiting activities of acidphosphatase，lactate dehydrogenase and β N -acetylglucosaminidaseon the fertilisation success of Eurasian perch （Perca fluviatilis L.）[J].Animals，2022，12（3）：307.

[6]IKEDA M， KAKIZAKI H，MATSUMIYA M. Biochemistry of fishstomach chitinase[J].International Journal of Biological Macro-molecules，2017，104：1672-1681.

[7]ABRO R，SUNDELL K，SANDBLOM E，et al.Evaluation of chitino-lytic activities and membrane integrityin gut tissues of Arctic charr（Salvelinus alpinus）fedfishmealand zygomycete biomassJ].Com-parative Biochemistry and Physiology Part B：Biochemistryand Molec-ular Biology，2014，175：1-8.

[8]黃金鳳，李波，白瑩，等.吉富羅非魚胃腸道幾丁質(zhì)酶的克隆、組織分布和純化[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2021，48（6）：107-115.

[9]CHEN YL，TAO Z P，ZHANG M H，et al. Identification of achitinase from the hepatopancreas of Chinese black sleeper（Bostrychus sinensis）[J].Acta Oceanologica Sinica，2021，40（6） ：50-60.

[10]PASCON G， DANISO E，CARDINALETTI G，et al. Postprandialkineticsof digestive function in rainbow trout（Oncorhynchusmykiss））：genes expression，enzymatic activity and blood biochemis-try as a practical tool for nutritional studies[J].Comparative Bio-chemistryandPhysiologyPartA：Molecularamp;IntegrativePhysiolo-gy，2024，288：111559.

[11］陳曉佳，孫林浩，袁陽，等.尼羅羅非魚肝臟 N -乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)分析[J].廈門大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2019，58（5）：685-691.

[12]KONO M，MATSUI T， SHIMIZU C，et al. Purification and someproperties of chitinase from the stomach of Japanese eel，Anguillajaponica[J].AgriculturalandBiological Chemistry，199o，54（4）：973-978.

[13]林建城，胡建輝，吳欽端.日本鰻腸道 N -乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)［J].水生生物學(xué)報(bào)，2022，46（9）：1301-1309.

[14]劉銀華，何國森，錢毅，等.5種常用消毒劑對(duì)錦鯉幼魚的急性毒性試驗(yàn)[J].漁業(yè)研究，2019，41（1）：70-74.

[15]ROLLINM，COULAUDR，ROCHERB，etal.Effectsofchemi-cal compounds on the activity of the N -acetyl ?β D -glucosaminidaseofthemarineprawn，Palaemon serratus：screening in vitro[J].En-vironmental Toxicology and Chemistry，2023，42（4） ：846-858.

[16]張偉妮，謝璐娜，黃小紅. CuSO₄ 和 ZnSO₄ 對(duì)尼羅羅非魚N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的影響[J].水生生物學(xué)報(bào)，2015，39（6）：1093-1099.

[17］張偉妮，陳曉佳，沈林松，等.強(qiáng)氯精對(duì)尼羅羅非魚精巢N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的失活動(dòng)力學(xué)[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2017，23（2）：306-311.

[18］謝曉蘭，黃乾生，魏曉倩，等.養(yǎng)殖常用消毒藥物對(duì)凡納濱對(duì)蝦NAGase活力的影響[J].水生態(tài)學(xué)雜志，2009，30（4）：108-112.

[19］林建城，吳建洪，林娟娟.有機(jī)溶劑來源污染物對(duì)中國 N 乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的影響[J].中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2021，51（6）：42-49.

[20]ZHANGWN，BAIDP，HUANGYF，etal.Enzymaticcharac-terizationsandactivityregulationsof N -acetyl-β- ??D -glucosaminidasefromthespermary of Nile Tilapia（Oreochromisniloticus）[J].Journal ofBioscience and Bioengineering，2014，117（2）：153-157.

[21］陳清西.酶學(xué)及其研究技術(shù)［M].2版.廈門：廈門大學(xué)出版社，2015.

[22]WANG T，LONGXH，CHENGYZ，etal.Acomparison effect ofcopper nanoparticles versus copper sulphate on juvenile Epinephe-luscoioides：growth parameters，digestive enzymes，body composi-tion，and histologyas biomarkers[J].International Journal of Ge-nomics，2015，2015（1）：783021.

[23］敖士齊，翟乾，紀(jì)鵬，等.亞甲基藍(lán)對(duì)羅氏沼蝦組織結(jié)構(gòu)、抗氧化系統(tǒng)及免疫能力的影響[J].淡水漁業(yè)，2023，53（1）：49-56.

[24］陳宏惠，李文跡，黃小紅，等.醇、醛類有機(jī)物對(duì)中華絨螯蟹 N 乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的影響[J].農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2007，36（1）：82-87.

[25］林娟娟，朱秋香，林建城.有機(jī)溶劑對(duì)中國明對(duì)蝦體壁 N -乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活力的影響[J].農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015，30（12）：1143-1148.

[26]ZHANGWN，BAIDP，LINXY，etal.Inactivationkinetics offormaldehydeon N -acetyl-β D -glucosaminidase from Nile Tilapia（Oreochromisniloticus）[J].Fish Physiologyand Biochemistry，2014，40（2）：561-569.

[27］韓庚，張翠英，朱蕾蕾.甲醛對(duì)甲醛裂合酶結(jié)構(gòu)的修飾作用研究[J].天津科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2024，39（3）：9-14，63.

[28]DOS SANTOS RODRIGUESFH，DELGADO GG，SANTANADA COSTA T，et al. Applications of fluorescence spectroscopy inprotein conformational changes and intermolecular contacts[J].BBA Advances，2023，3：100091.

[29]CHAI WM，LINMZ，SONGFJ，et al.Rifampicin as a novel ty-rosinaseinhibitor：inhibitoryactivityand mechanism[J].Interna-tional Journal ofBiological Macromolecules，2017，102：425-430.

[30］張健，李赫，李敬偉，等.3種水產(chǎn)藥物對(duì)松荷鯉的急性毒性[J].漁業(yè)研究，2024，46（2）：162-170.

（責(zé)任編輯：陳海霞）