野生肋果沙棘根際3株固氮菌的分離、鑒定及其促生能力比較

中圖分類號：S182;S714.6 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2025）14-0245-06

沙棘（HippophaerhamnoidesLinn.）又稱酸棗、醋柳，屬于胡頹子科（Elaeagnaceae）沙棘屬（Hippophae），是一種生態幅廣、適應性強的落葉灌木或小喬木，雌雄異株且刺多[1]。沙棘作為我國西部地區的特色經濟林樹種，不僅是改善生態環境、促進鄉村經濟發展的優質樹種資源，同時也是防治水土流失、降低荒漠化的先鋒樹種[2]。目前研究表明該屬植物共有6個種，其中肋果沙棘（Hippophaeneurocarpa）是在1978年被發現和命名的，因其具有耐寒、耐旱的特點而備受關注，對肋果沙棘的研究、開發和利用對于發展地區經濟、改善惡劣環境具有重要意義。

根際細菌作為根際微生態系統的重要組成部分，其廣泛且豐富地存在于植物根際及其附近的區域，它們能夠在有競爭的微生物存在的情況下，繁殖和定植在根系的所有生態位，通過改變其生理和代謝來應對干旱、寒冷和有害病原體等生物、非生物脅迫，向植物提供養分或者通過影響植物的氮素吸收利用和生態適應性等直接或間接機制來促進植物生長[3-4]。氮素作為組成植物的四大重要元素之一，是植物生長的主要限制性養分[5-6]。該元素大部分以動植物無法直接吸收到的氣態（ N₂ ）形式存在，雖然施加氮肥可以一定程度上滿足植物對于氮素的需求，但帶來了環境污染、土壤酸化等問題。大氣氮的生物固定是重要的微生物活動，每年約有1.75億t的大氣氮通過生物固定的方式被重新引入植物生命周期內，從而大大減少了氮肥的使用[7-8]。生物固氮這一過程依賴于土壤微生物中的固氮菌，與植物相關的固氮細菌既包括能獨立固氮的自生固氮菌，也包括必須與其他生物共生固氮的根瘤菌屬（Rhizobium）等和聯合固氮菌固氮螺菌屬（Azospirillum）等，研究表明，從植物根際中分離出的固氮菌可以對種子的萌發和幼苗的生長產生積極的影響，從而提高農作物的產量和品質，并改善土壤的狀況[9-12] O

目前，肋果沙棘的相關研究主要聚集在成分提取與生物學特性等方面[13-14]。本研究從青海野生肋果沙棘根際土壤中分離出具有固氮功能的促生菌株，為開發適宜西北高寒干旱地區環境的生物菌肥并應用于當地農業生產以提高農林作物的產量和品質提供菌種資源。

1材料與方法

1.1 試驗材料

試驗試劑包括革蘭氏染液、固氮ELISA檢測試劑盒。

試驗培養基包括普通肉湯培養基、1/2MS培養基、Ashby固體培養基。普通肉湯培養基：含 20.0g 蛋白陳 .5.0g 牛肉粉和 5.0g 氯化鈉，加蒸餾水至 。 1/2MS 培養基：含 950mg 硝酸鉀 ??825mg 硝酸銨 85mg 磷酸二氫鉀 .185mg 硫酸鎂 、220mg 氯化鈣 、100mg 肌醇和 30g 蔗糖，加蒸餾水至 ¹L 。Ashby固體培養基：含 2mg 七水硫酸亞鐵 ?5.0g 蘋果酸 、4.50g 氫氧化鉀、 500mg 磷酸二氫鉀、 .20mg 二水碳酸鈣 .0.1g 氯化鈉 .2mg 二水高錳酸鈉和18g 瓊脂，加蒸餾水至 ¹L 。

1.2 試驗方法

1.2.1根際土采集2021年8月于青海省海北藏族自治州門源縣（ 101.1242^°E，37.4537^°N ，海拔3370m ）采集肋果沙棘根際土壤，采集時以植物主莖為中心，去除上層覆土后選擇其周圍 20cm 以內的根際土壤，每區各采取6份土樣，每份約 50g 土，裝入無菌袋中編號并用冰袋低溫保存運回實驗室。將采集好的土樣混合均勻保存在 4‰ 冰箱里，用于后續沙棘根際促生菌分離鑒定的相關研究。

1.2.2根際促生菌分離和篩選在無菌條件下，稱量 10g 根際土，溶于裝有 90mL 生理鹽水的錐形瓶中，分別配制成 10^-1?10^-2?10^-3?10^-4?10^-5?10^-6 的稀釋液，于 28‰ 的條件下振蕩 30min 后將稀釋液涂抹于Ashby固體培養基中，每個平板重復3次。

1.2.3菌株的純化在Ashby固體培養基中選擇 帶有透明圈或渾濁圈、凸起高的單菌落接種到普通 肉湯固體平板上運用平板劃線法純化，直至出現單 一菌落。

1.2.4菌株形態、生理生化及分子鑒定在劃線平板中選擇單一菌落，觀察其形狀、大小、顏色等，并根據《常見細菌系統鑒定手冊》對固氮菌進行形態學觀察，并對分離菌株的生理生化特征進行測定，參照生化管說明判斷結果并進行記錄[15]。利用細菌通用引物27F（ 5^′ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（ 5^′ -GGTTACCTTGTTACGACTT -3^′ ）擴增16SrDNA測序后進行BLAST分析，運用MEGA11.0構建系統發育樹。

1.2.5菌株固氮能力測定定性測定：運用點接法將分離純化出的固氮菌株接種于Ashby固體培養基中，每個平板3次重復， 30% 倒置培養3～5d，分別在培養3、5d時測量各菌株在培養基上透明圈直徑。定量測定：試劑盒提取用微生物（microorganism）固氮酶（nitrogenase）ELISA檢測試劑盒定量測定，菌株固氮酶含量可直接反映固氮微生物的固氮能力[16]

1.2.6標準單菌懸液制備取 -80°C 的甘油凍存菌液，放人 30% 的恒溫箱中活化 4～8h ，然后接種至普通肉湯液體培養基中， 28‰ 振蕩培養，調節菌液吸光度 D_600nm=1 后，將菌液稀釋100倍備用。

1.2.7拮抗試驗通過劃線法測試菌株間是否有拮抗作用，將測試菌株在普通肉湯固體培養基上交叉劃線接種， 28^°C 下培養2～4d，觀察菌株交叉點處菌落生長情況，若交叉點處無菌落生長，則表明2菌株間有拮抗作用；若交叉點處菌落生長正常，則表明菌株間無拮抗作用，可用于制作復合菌劑。

1.2.8標準復合菌懸液將“1.2.6”節所述的標準單菌懸液按相同的體積進行混配，制成標準復合菌懸液。

1.2.9種子預處理所用油菜為青蔬919（青海互豐農業科技集團有限公司），用無菌水充分浸泡，去掉漂浮及壞損的種子，挑選大小一致、顆粒飽滿的種子，先用 75% 無水乙醇處理 30s ，無菌水沖洗3次，然后用 0.3% 高錳酸鉀消毒 7～9min ，最后用無菌水洗滌3次，晾干待用。

1.2.10種子發芽率測定用鑷子將菌液浸種 20h 后的30顆種子均勻地擺放至含有濕潤濾紙的培養皿中，每天補充等量無菌水保持培養皿濕潤，于光照培養箱中 25^°C 、光照 16h 黑暗 8h 培養 2d 。種子萌發以胚根露出種皮外為準，每日記錄已萌發種子個數，測試周期為3d，計算種子的發芽率。

1.2.11植物生長能力測定將菌液浸種 20h 后的種子經表面滅菌預處理后，接種至 pH 值為中性且高壓滅菌過的 1/2MS 固體培養基中，對照組為20h 無菌水浸泡后滅菌消毒，每個培養瓶接種20粒種子，將其置于人工氣候箱內培養，溫度 24^°C ，濕度為 60% ，光照 16h 、黑暗 8h 光照黑暗交替培養，生長6d后測定油菜幼苗鮮重、株高、根長等指標。

1.3 數據處理

運用Excel2016進行數據處理及作圖，用SPSS25.0軟件對數據進行單因素方差分析，其中 Plt; 0.05代表存在顯著差異。

2 結果與分析

2.1固氮菌菌株形態學鑒定

在Ashby固體培養基上經純化培養后共得到47株具有固氮能力的菌株，根據定性定量結果篩選出3株固氮能力最強的菌株，命名為N1、N2、N3。由圖1、圖2可知，N1菌落呈淺黃色，圓形，表面光滑濕潤，單一菌落直徑 1～2mm ，為革蘭氏陰性桿狀菌；N2菌落呈紅色，不透明，表面光滑隆起，單一菌落直徑 0.5～0.8mm ，為革蘭氏陰性桿狀菌；N3菌落呈圓形，質地干燥多皺，與培養基結合緊密，不易挑取，單一菌落直徑 1～2mm ，為革蘭氏陽性桿狀菌。

2.2固氮菌菌株生化鑒定

由表1可知，菌株N1、N2、N3在明膠液化 .7% 氯化鈉 ??D-? 木糖試驗中均呈陰性；在淀粉水解、甘露醇試驗中，菌株N1、N3呈陰性，菌株N2呈陽性；在葡萄糖 、L- 精氨酸雙水解酶、賴氨酸脫氨酶、尿素醇試驗中，菌株N1、N3呈陽性，菌株N2呈陰性；在乳糖、接觸酶、蔗糖、革蘭氏染色試驗中N1、N2呈陰性，N3呈陽性；V-P試驗中N2、N3呈陽性，N1呈陰性。

2.3固氮菌菌株分子生物學鑒定

提取菌株16SrDNA進行PCR擴增測序，將3株菌的序列在BLAST上進行同源性對比，運用MEGA11.0構建系統發育樹，結果如圖3所示。N1與參考菌株弗雷德里克斯堡假單胞菌（Pseudomonasfrederiksbergensis）MT974420.1同源性為 99.72% ，且處于同一分支，結合形態學和生理生化特征將其鑒定為弗雷德里克斯堡假單胞菌；N2與參考菌株居泉沙雷氏菌（Serratiafonticola）MN227496.1同源性為99.35% ，且處于同一分支，結合形態學和生理生化特征將其鑒定為居泉沙雷氏菌；N3與參考菌株基愈創木膠類節桿菌（Paenarthrobacternitroguajacolicus）PP683181.1同源性為 99.64% ，且處于同一分支，結合形態學和生理生化特征將其鑒定為基愈創木膠類節桿菌。

表1固氮菌菌株生理生化特征

注： + 代表陽性，-代表陰性。

圖3固氮菌株的系統發育樹

2.4固氮菌固氮能力測定

2.4.1固氮菌固氮能力定性測定結果由表2可見，在Ashby固體培養基上培養3d，各菌株形成的透明圈直徑為 3.04～13.40mm ，其透明圈直徑從大到小依次為菌株 N2gt;N1gt;N3 ，其中N2菌株的透明圈直徑最大，為 13.40mm ，顯著大于菌株N1和N3（ Plt;0.05） 。培養5d，各菌株形成的透明圈直徑為5.25～13.52mm ，其中菌株N2的透明圈顯著高于其他2株菌株。

2.4.2固氮菌固氮能力定量測定結果菌株固氮酶含量可直接反映固氮微生物的固氮能力。由表2可見，固氮酶的含量在 220.52～227.50U/L ，其含量從大到小依次為 N2gt;N3gt;N1 。菌株N2的固氮酶含量最高，較N1顯著高 3.16% ，相比定性結果，3株固氮菌定量結果差異較小。

表2固氮菌固氮能力

注：同列數據后不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。

2.5 固氮菌的拮抗作用

如圖4所示，3株菌株間的拮抗試驗發現交叉處菌株生長，表明各菌株間不存在拮抗作用，可進行單一菌株和混合菌株促生能力研究。

2.6固氮菌菌劑對油菜種子發芽率的影響

將篩選出的3株固氮菌制成單一菌液以及復合菌液，探究其對油菜幼苗的影響。共設置8組處理方式：CK為無菌水處理；C1為N1菌劑浸泡；C2為N2菌劑浸泡；C3為N3菌劑浸泡;C4為 N1+N2 菌劑浸泡；C5為 N2+N3 菌劑浸泡；C6為 N1+N3 菌劑浸泡；C7為 N1+N2+N3 菌劑浸泡，結果如圖5。由圖5可見，對照組發芽率為 79.67% ，而經過N2、N3、N1單一菌劑處理的油菜種子發芽率分別為94.33% 、90. 00% 、90. 33% ，較CK分別提高了18. 40% 12.97% .13.38% ，均顯著提高了油菜種子的發芽率。經過 N1+N2，N2+N3，N1+N3，N1+ N2+N3 復合菌劑處理過的油菜種子發芽率分別為92.00% ， 94.67% 92.67% （204號 ，95.67% ，較CK分別提高了 15.48%.18.83%.16.32%.20.08% 。可見單一菌劑和復合菌劑處理油菜種子與對照組相比發芽率均有一定的提升，表明固氮菌劑能提高植物發芽率。

不同小寫字母表示處理間差異顯著 （Plt;0.05） 。圖6同圖5單一及復合菌劑對發芽率的影響

2.7固氮菌菌劑對油菜生長發育的影響由圖6可知，施用固氮菌菌劑處理后油菜的生長發育速度得到了明顯的提高。在單一菌劑中 N1 ！N2、N3較CK組油菜幼苗鮮重分別增加了 15.67% ！28.33% 、 30.00% ；幼苗株高分別增加了 6.28% ！82.79% （204號 ，28.09% ;幼苗根長分別增加了 217.26% 7336.87% ，降低了 53.98% 。由此可知，單一菌劑N3在增加植物鮮重上較N2、N1效果好，單一菌劑N2具有顯著增長植物株高及根長的作用。混合菌劑N1+N2，N2+N3，N1+N3，N1+N2+N3 較CK組油菜幼苗鮮重分別增加了15. 50% 、15. 90% ！141. 67% ） 16.67% ;幼苗株高分別增加了 96.24% ！18.74% 、111. 67% （20 ，23.29% ；幼苗根長分別增加了906.64% 、129. 35% 、1013. 13% 、 239.38% 。由此可知，在混合菌劑中 N1+N3 具有顯著增長植物鮮重、株高及根長的作用。

處理

圖6單一菌劑及復合菌劑對油菜生長發育的影響

處理

3討論

對土壤根際微生物的研究旨在提高人們對根際微生物種群及其活性的多樣性、動態性和重要性的認識[17]。研究表明，通過根際微生物的應用，可廣泛而深入地改變土壤結構及根系分泌物，從定性和定量上重塑根際微生物群落，減少化肥和農藥的施用[18-19]。根際促生菌能夠通過其獨特的溶解磷酸鹽和固氮等代謝活動，直接作用于植物的新陳代謝，不僅提高了植物對水分和礦物質的吸收能力，促進了根系的發育和酶活性的增強，還能通過支持其他有益微生物的作用或抑制植物病原體，間接促進植物的健康成長[20]

Hellriegel等在1884年的研究揭示了土壤微生物在植物固氮過程中的不可或缺性，這一發現使得生物固氮機制逐漸被了解[21]。生物固氮是指固氮微生物通過自然過程將大氣中的氮氣轉化為植物可利用的氮化合物，為植物提供了一種有效的氮源，具有替代化學氮肥的潛力。近年來，在甘蔗、玉米、水稻等作物中發現了大量的內生固氮菌，這些菌株能夠顯著促進植物生長并減少氮肥的使用[22-24]。本研究從肋果沙棘中分離出的3株固氮菌株不僅展現出顯著的固氮含量，而且具有促進植物生長的潛力，為生產高效生物有機肥提供了高效菌株。

本研究深入探討了從肋果沙棘根際中分離獲得的3株固氮菌的固氮效果及其對植物生長的促進作用。其中，居泉沙雷氏菌N2的固氮效果最強，弗雷德里克斯堡假單胞菌N1的固氮效果則相對較弱。這一發現與先前的研究相呼應，表明不同固氮菌株間的固氮能力存在顯著差異[25-26]。在菌株固氮能力的定性分析中，3株固氮菌在Ashby培養基上培養3、5d后的透明圈直徑分別為 3.04～ 13.40mm 和 5.25～13.52mm ，這一結果與李妍等的研究結果[27-28]一致，進一步證實了固氮菌經固氮培養基培養后的固氮能力存在顯著差異。此外，本研究中固氮菌分泌的固氮酶含量在 220.52～ 227.50U/L ，與胡應平等從旱稻根系中分離出的高效固氮菌的固氮酶含量 220.15U/L^[29] 相近，這表明所得的固氮菌株在固氮酶含量方面有較高的水平。在植物生長促進作用方面，本試驗中施用固氮菌菌劑不僅促進了油菜種子的萌發，提高了種子發芽率，還顯著促進了油菜幼苗的生長發育，這一結果不僅驗證了固氮菌對植物生長的積極影響，也為農業生產中利用固氮菌提高作物產量提供了科學依據。王夢姣等的研究揭示了混合菌劑相較于單一菌劑在提升植物生物量和果實質量方面的顯著優勢[30-31]，本研究的結果同樣支持這一觀點，表明復合菌劑在促進植物生長方面比單一菌劑更為有效。

本研究深化了對固氮菌功能多樣性的認識，并為農業中復合微生物菌劑的應用提供了科學依據，展現了其在推動農業可持續發展中的潛力。研究結果對提升農業生產力、減少化學肥料依賴、促進農業的綠色可持續發展具有重要意義。

4結論

本研究從青海野生肋果沙棘根際土壤中篩選出3株固氮菌（N1、N2、N3），結果表明：3株固氮菌均具有高效固氮的能力；施用單一固氮菌劑及復合固氮菌劑均可促進油菜種子的萌發，提高種子發芽率，促進油菜幼苗的生長發育；其中單一菌劑以N2的促生效果最佳，復合菌劑中 N1+N2+N3 促進發芽率效果最佳， N1+N3 促進植物鮮重、株高及根長的作用最佳。經生化及分子鑒定，確定N1、N2、N3分別為弗雷德里克斯堡假單胞菌、居泉沙雷氏菌、基愈創木膠類節桿菌。

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